Formação específica de vocalizações ultra-som em ratos idosos e Parkinson

O objetivo geral deste procedimento é treinar ratos para aumentar o número e a complexidade de suas vocalizações ultrassônicas, ou USVs. Isso é realizado primeiramente gravando as vocalizações basais. O próximo passo é treinar para vocalizações específicas por meio de reforço positivo.

Após o treinamento, são gravadas as vocalizações pós-treinamento. A etapa final do procedimento é a análise acústica e a comparação entre as vocalizações basais e as pós-treinamento. Em última instância, os resultados podem ser obtidos.

Esse estudo demonstra que o treinamento aumenta o número e a complexidade das vocalizações ultrassônicas por meio do aumento de parâmetros acústicos, como largura de banda, frequência de pico e duração. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de distúrbios da comunicação, como a forma pela qual o exercício vocal modula os mecanismos neurais subjacentes. Embora este método possa fornecer informações sobre déficits sensoriomotores cranianos associados à doença de Parkinson e ao envelhecimento.

Também pode ser aplicado a outros modelos e condições de doença que utilizam vocalizações ultrassônicas como um índice comportamental. A demonstração do treinamento de vocalização será realizada por Emerald Dahl e Jamie Shire, membros do meu laboratório. Para iniciar o monitoramento ultrassônico, carregue o software Avisoft Recorder, selecione "permanent unlimited" para o gatilho, permitindo que as gravações sejam iniciadas e interrompidas manualmente. Em seguida, defina onde os arquivos de áudio capturados serão salvos no diretório base.

A taxa de amostragem deve ser de pelo menos 200.000 hertz para captar a frequência mais alta da vocalização. Uma vez definidos esses parâmetros, remova a tampa da gaiola domiciliar do macho e coloque-a diretamente abaixo do microfone. Em seguida, identifique uma rata fêmea sexualmente receptiva em ress por meio da presença de lordose, movimentação das orelhas e movimentos rápidos e breves.

Coloque a fêmea receptiva na gaiola do rato macho experimental. Quando o macho demonstrar interesse pela fêmea farejando, perseguindo ou montando nela, remova a fêmea e grave as vocalizações do macho por um a dois minutos. Monitore visualmente as vocalizações ultrassônicas observando o espectrograma em tempo real.

Se o macho não vocalizar, devolva imediatamente a fêmea brevemente à gaiola domiciliar do macho para estimular a vocalização. Para começar, leve um único rato macho para a sala de treinamento. Todos os demais machos devem permanecer em uma sala adjacente até a sessão de treinamento de cada um.

O rato deve ter acesso restrito à água previamente para facilitar o uso da água como recompensa. Durante o treinamento, configure o gravador Avis soft conforme mostrado anteriormente. Em seguida, posicione a gaiola domiciliar sob o microfone.

Uma vez que o macho esteja em posição, introduza uma rata receptiva na gaiola. Remova a fêmea assim que o macho demonstrar interesse por ela e monitore as vocalizações-alvo. Inicialmente, qualquer chamado modulado na frequência de 50 kilohertz é recompensado.

Apresente a recompensa clicando simultaneamente em uma caneta e exibindo brevemente uma garrafa d'água ou alimento. Trate conforme o treinamento progride, reforçando apenas cadeias de chamados cada vez mais complexas, como sequências de cinco ou 10 chamados em rápida sucessão. Continue o treinamento até que 30 reforços tenham sido dados.

Isso geralmente leva de cinco a 10 minutos para analisar as gravações de linha de base e pós-treinamento. Primeiro, gere um arquivo do arquivo de som original e faça edições em uma cópia de trabalho para remover as frequências de ruído abaixo das vocalizações ultrassônicas. Use o modo em lote do AVI Soft SaaS Lab Pro para filtrar os arquivos de som com um filtro passa-alta em 25 quilohertz.

Para determinar o limite de ruído necessário para utilizar o recurso de detecção automática de elementos do SaaS Lab Pro, abra um arquivo de som e crie um espectrograma. Defina o comprimento da FFT para 512 com um tamanho de quadro de 75% e uma sobreposição temporal de 93,75%. Habilite a edição de forma de onda para que o ruído removido do espectrograma possa ser eliminado da forma de onda. Configure as medições de parâmetros automáticos conforme mostrado aqui.

Os três parâmetros a serem medidos são duração do elemento, frequência de pico e amplitude de pico. Na localização das medições, a seção habilita a amplitude máxima e os parâmetros mínimos e máximos de todo o elemento. Em separação de elementos, selecione limiar único automático e mostre o limiar.

Encontre uma área do espectrograma onde não haja chamados ou ruídos. Esta é a chamada ruído de fundo. Ajuste o limiar um pouco acima do ruído de fundo.

Ajustando a linha preta na janela do espectro de potência acima do espectrograma, pode-se encontrar aqui o nível de decibéis do limiar definido na etapa anterior. Defina o valor de amplitude rejeitada como um decibel abaixo do limiar. Esses dois valores devem agora ser utilizados para todos os arquivos de som analisados.

Assumindo que todas as configurações de gravação foram iguais, para rotular as vocalizações, crie um espectrograma utilizando o limiar automático definido anteriormente e as mesmas configurações mostradas anteriormente. Apague manualmente qualquer ruído que atenda aos seguintes critérios: um, que tenha sido incorretamente identificado como uma vocalização; dois, que esteja afetando a discriminação do início e/ou do fim da vocalização; três, que tenha sido incorretamente identificado como a frequência mais alta ou mais baixa na vocalização, indicadas pelas linhas vermelhas superior e inferior, respectivamente.

Em alguns casos, uma vocalização não pode ser separada do ruído circundante, como o som da cama durante a locomoção. Essa chamada não pode ser analisada com precisão e deve ser apagada assim que todas as vocalizações tiverem sido identificadas, apagando permanentemente as seções excluídas do espectrograma do arquivo de som. Ao selecionar remover, apague seções do espectrograma da forma de onda no menu suspenso ferramentas para criar rótulos permanentes no arquivo de som.

Abra a janela de configuração de medição automática de parâmetros e clique no botão de edição na seção de separação de elementos, visual e oralmente. Revise cada vocalização identificada para determinar sua categoria e atribua a etiqueta apropriada utilizando os módulos de texto predefinidos. As categorias que utilizamos em nossa análise são frequência simples, modulada e harmônica.

Feche o espectrograma, salve o arquivo de som e prossiga para o próximo arquivo de som a ser analisado. Após as vocalizações terem sido identificadas em todos os arquivos de som, use a ferramenta de processamento em lote para medir automaticamente os parâmetros acústicos de todos os arquivos. Na caixa de diálogo de processamento em lote, selecione medições automáticas de parâmetros no menu suspenso.

Selecione a caixa de seleção processar todos os arquivos na pasta selecionada. Em seguida, clique no botão pasta e selecione a pasta onde os arquivos de som estão salvos. Clique em iniciar e cada arquivo será automaticamente analisado de acordo com as configurações utilizadas anteriormente.

No diálogo de configuração da medição automática de parâmetros, as medições serão salvas em um arquivo de texto que pode ser definido usando o comando de configuração DDE com a opção de arquivo de registro. Esse arquivo de texto pode então ser importado para um programa de análise estatística. Esses gráficos demonstram que o número de vocalizações por sessão e a taxa de vocalização por minuto aumentam ao longo de um período de treinamento de seis semanas.

Vocalizações representativas de cada uma das três categorias de vocalizações de 50 quilohertz que utilizamos são mostradas aqui da esquerda para a direita. São elas: frequência simples, modulada e harmônica. Neste exemplo, são apresentadas vocalizações moduladas em frequência do mesmo rato antes da indução do parkinsonismo, após a indução do parkinsonismo e após o treinamento de vocalização.

Em comparação com a vocalização basal no painel A, a vocalização na condição de parkinsonismo no painel B mostra uma redução na largura de banda, duração e intensidade. A vocalização pós-treinamento mostrada no painel C demonstra como duração, intensidade, largura de banda e modulação de frequência retornam aos níveis basais após o treinamento de vocalização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como treinar, gravar e analisar as vocalizações ultrassônicas de ratos.