Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

O objetivo geral deste procedimento é realizar a celebração direcionada das células renais no rim embrionário do peixe-zebra, o pro nefros, com o objetivo de estudar a regeneração epitelial renal após lesão renal aguda. Isso é feito pela primeira microinjeção de embriões de peixe-zebra com um conjugado fluorescente de dextrano. Durante uma incubação noturna, os conjugados são absorvidos seletivamente pelas células tubiais proximais do néfron.

No dia seguinte, as células são examinadas sob epifluorescência e as células selecionadas são ablacionadas usando um sistema de laser pulsado. Posteriormente, as alterações morfológicas e moleculares são avaliadas por meio de histologia, hibridização C dois de montagem total e química imuno-histoquímica. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a lesão renal aguda usando o antibiótico nefrotóxico gentamicina, é que tais tratamentos desencadeiam danos catastróficos e são letais, impedindo a análise de eventos de regeneração renal ao longo do tempo.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo renal, como a identificação de eventos de sinalização molecular que ocorrem durante a regeneração epitelial. Tivemos a ideia para essa técnica pela primeira vez quando queríamos desenvolver uma análise detalhada da regeneração epitelial renal em placas de Petri. Colete embriões de peixe-zebra fertilizados em solução E três modificada sem azul de metileno.

Aumente os embriões fertilizados a 28,5 graus Celsius até que estejam entre 48 e 55 horas Após a fertilização, quando o sistema renal do embrião começar a funcionar antes de iniciar as injeções, prepare uma árvore de injeção de aros usando um molde com depressões triangulares para segurar os embriões. Em seguida, prepare agulhas de microinjeção padrão e uma solução de injeção para marcar o túbulo proximal. Comece o experimento preparando os embriões.

Primeiro, remova o Corian de todos os ovos não eclodidos usando uma pinça fina. Em seguida, enxágue os detritos de Corian, os detritos da placa de Petri e encha novamente o prato com 30 mililitros de solução E três modificada. Em segundo lugar, anestesiar as larvas com cinco mililitros de trica.

Certifique-se de que as larvas estejam completamente anestesiadas, verificando se há uma resposta ao toque. Se eles não estiverem totalmente anestesiados, eles se contorcerão durante a injeção. Terceiro, usando uma pipeta de transferência de plástico, coloque as larvas no molde.

Posicione os animais com a cabeça na parte mais profunda da depressão e as trombas ao longo da lateral do poço. Agora prossiga com micro injeções intramusculares carregando uma agulha preparada com dois a três microlitros de dextrana fluorescente na posição da agulha e injete aproximadamente um nanolitro de solução em um tronco de cada animal. Os conjugados dextranos são prontamente endocitados pelo túbulo proximal do néfron, permitindo a marcação preferencial dessa população de células epiteliais.

Aponte para a porção superior do ácaro e evite a extensão do saco vitelino, ou os túbulos do néfron acabarão rompidos, como neste animal injetado incorretamente. Uma vez que as larvas são injetadas, transfira-as para uma placa de Petri limpa e lave-as três vezes com meio E três fresco para remover todos os vestígios de trica. Agora, cubra a tampa com papel alumínio e incube os animais durante a noite a 28 graus Celsius.

Antes de iniciar este procedimento, prepare o meio de mobilização e mantenha algumas alíquotas para uso imediato em temperatura ambiente e mantenha as alíquotas restantes a quatro graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Comece anestesiando as larvas do peixe-zebra com cinco mililitros de trica em 30 mililitros de E três. Assim como antes, certifique-se de que os peixes não respondam à sensação tátil.

Agora examine os animais injetados sob fluorescência para selecionar larvas com túbulos proximais facilmente visualizados. Transfira até 12 larvas para um novo prato contendo a mesma concentração de trica em um microscópio fluorescente composto equipado com um filtro fitzy, iluminação de campo claro e um laser. A ablação começa com a transferência e anestesia da lava para uma placa contendo meios de imobilização.

E espere dois minutos, depois transfira a lava para uma lâmina de depressão de vidro contendo uma gota de meio de imobilização. Posicione suavemente o lado dorsal do animal para cima com uma sonda fina e concentre-se no lado dorsal. Agora usando um sistema de laser de microponto pulsado calibrado abl um dos néfrons deixando o outro intacto como controle.

Você verá a dispersão da fluorescência à medida que as células epiteliais renais são ablacionadas. Em seguida, transfira suavemente o animal para um poço de um prato de 12 mundos e enxágue-o três vezes em E três meios para lavar a metilcelulose. Continue ablando os néfrons até que o primeiro prato dos 12 mundos esteja cheio.

Em seguida, anestesiar outros 12 animais e repetir o processo. Dextra Fitzy foi injetado para marcar preferencialmente o túbulo proximal. Três dias após a fertilização e o néfron de cada animal foi ablacionado a laser.

Um dia após a ablação. A regeneração não é aparente quatro dias após a ablação, no entanto, a regeneração ocorreu após a ablação celular in situ dois. A hibridização foi usada para analisar mudanças em amostras fixas em pontos de tempo únicos.

Este embrião não foi submetido a ablação. Em contraste, este embrião tinha um grande trecho de epitélio tubário ablacionado, e este embrião tinha um curto intervalo de epitélio tubular ablacionado. Após este procedimento, outros métodos, como a hibridização in situ hol mount, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a identidade das alterações na expressão gênica durante o curso da regeneração do néfron.

Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, como jaleco e luvas, são recomendadas durante este procedimento.