Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

O objetivo geral deste procedimento é realizar a marcação direcionada de células renais no rim embrionário de peixe-zebra, o pronefros, com a finalidade de estudar a regeneração epitelial renal após lesão renal aguda. Isso é realizado inicialmente por meio da microinjeção de embriões de peixe-zebra com um conjugado fluorescente de dextrana. Durante uma incubação noturna, os conjugados são absorvidos seletivamente pelas células do túbulo proximal do néfron.

No dia seguinte, as células são examinadas em microscopia de fluorescência epiluminiscente e células selecionadas são ablatadas utilizando um sistema a laser pulsado. Posteriormente, alterações morfológicas e moleculares são avaliadas por meio de histologia, hibridização *in situ* em preparações inteiras e imunohistoquímica. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a lesão renal aguda induzida pelo antibiótico nefrotóxico gentamicina, é que tais tratamentos provocam danos catastróficos e são letais, impedindo a análise dos eventos de regeneração renal ao longo do tempo.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área renal, como a identificação de eventos de sinalização molecular que ocorrem durante a regeneração epitelial. Tivemos pela primeira vez a ideia desta técnica ao querer desenvolver uma análise detalhada da regeneração epitelial renal em placas de Petri. Colete embriões de peixe-zebra fertilizados em solução E três modificada sem azul de metileno.

Crie embriões fertilizados e mantenha-os a 28,5 graus Celsius até que tenham entre 48 e 55 horas pós-fertilização, quando o sistema renal do embrião já tiver começado a funcionar. Antes de iniciar as injeções, prepare uma placa de injeção para embriões utilizando um molde com reentrâncias triangulares para acomodar os embriões. Em seguida, prepare agulhas padrão para microinjeção e uma solução de injeção para marcar o túbulo proximal. Inicie o experimento preparando os embriões.

Primeiro, remova a corion de ovos não eclodidos usando pinça fina. Em seguida, enxágue os resíduos de corion, remova os resíduos da placa de Petri e reabasteça a placa com 30 mililitros de solução E três modificada. Segundo, anestesie as larvas com cinco mililitros de trica.

Certifique-se de que as larvas estão completamente anestesiadas verificando a resposta ao toque. Se elas não estiverem totalmente anestesiadas, irão se contrair durante a injeção. Em terceiro lugar, usando uma pipeta de transferência de plástico, coloque as larvas no molde.

Posicione os animais com as cabeças na parte mais profunda da depressão e os troncos ao longo do lado do poço. Prossiga então com microinjeções intramusculares, carregando uma agulha preparada com dois a três microlitros de dextrana fluorescente, posicionando a agulha e injetando aproximadamente um nanolitro de solução em um tronco de cada animal. Os conjugados de dextrana são prontamente endocitados pelo túbulo proximal do néfron, permitindo a marcação preferencial dessa população de células epiteliais.

Visar a porção superior do somito e evitar a extensão do saco vitelino, caso contrário os túbulos nefrónicos acabarão danificados, como neste animal injetado incorretamente. Após a injeção das larvas, transfira-as para uma placa de Petri limpa e lave-as três vezes com meio E3 fresco para remover todos os vestígios de trica. Agora, cubra a tampa com papel alumínio e incube os animais durante a noite a 28 graus Celsius.

Antes de iniciar este procedimento, prepare o meio de imobilização e mantenha algumas alíquotas dele para uso imediato em temperatura ambiente e guarde as alíquotas restantes a quatro graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Comece anestesiando as larvas de peixe-zebra com cinco mililitros de trica em 30 mililitros de E3. Assim como antes, certifique-se de que os peixes não respondam à sensação tátil.

Agora, examine os animais injetados em fluorescência para selecionar larvas com túbulos proximais facilmente visualizáveis. Transfira até 12 larvas para um novo recipiente contendo a mesma concentração de trica em um microscópio fluorescente equipado com filtro fitzy, iluminação de campo claro e um laser perform. A ablação começa transferindo e anestesiando a larva para um recipiente contendo meio de imobilização.

E espere dois minutos, depois transfira a larva para uma lâmina de microscopia com cavidade contendo uma gota de meio de imobilização. Posicione suavemente o animal com o lado dorsal voltado para cima usando uma sonda fina e foque no lado dorsal. Agora, utilizando um sistema a laser pulsado micro pontual calibrado, ablate um dos néfrons, deixando o outro intacto como controle.

Você verá a dispersão da fluorescência à medida que as células epiteliais renais forem ablacionadas. Em seguida, transfira cuidadosamente o animal para um poço de uma placa de 12 poços e lave-o três vezes em meio E3 para remover a metilcelulose. Continue ablacionando néfrons até que a primeira placa de 12 poços esteja cheia.

Em seguida, anestesie outros 12 animais e repita o processo. Dextra Fitzy foi injetado para rotular preferencialmente o túbulo proximal. Três dias após a fertilização, o néfron de cada animal foi ablatado com laser.

Um dia após a ablatação. A regeneração não é aparente quatro dias após a ablatação, contudo a regeneração ocorreu após a ablatação celular in situ dois. A hibridização foi utilizada para analisar alterações em amostras fixadas em pontos de tempo únicos.

Este embrião não foi submetido à ablação. Em contraste, este embrião teve um grande trecho do epitélio tubular ablatado, e este embrião teve um curto segmento do epitélio tubular ablatado. Após este procedimento, outros métodos, como hibridização in situ em preparação total, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a identidade das alterações na expressão gênica durante o processo de regeneração do néfron.

Não se esqueça de que trabalhar com produtos químicos pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, por exemplo, jaleco e luvas, são recomendadas durante este procedimento.