Name: Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda o método de explantes tumorais para testar eficácia de drogas anti-câncer em gliomas malignos preservando o microambiente. Esta abordagem utiliza espécimes cirúrgicos frescos e imunohistoquímica.

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A American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / A Associação Americana do tumor cerebral, ea Família Khan Fundação para eu Nakano.

1. Preparação dos meios de comunicação <ol><li> A mídia foi preparado com 10% FBS (16140-071 - GIBCO) em DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) com solução de Agar 0,6% purificada, Granulado (1.01614.1000-EMD ). Condições estéreis foram mantidos durante todo o experimento. </li><li> Para a preparação dos meios de comunicação 5mL de FBS (16140-071 - GIBCO) foi adicionado em 45ml de DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen), tornando volume final de 50ml. A mídia preparado foi mantido em banho-maria a 37 ° C de temperatura. </li><li> A solução de ágar foi preparado pelo método de micro-ondas de calor. 0,3 gramas de ágar granulado foi dissolvido em 50 mL de água destilada usando microondas. A solução de ágar foi esfriar a 37 ° C de temperatura, mantendo-o em banho-maria. </li><li> Usamos volume igual de mídia a partir do passo 1.2 e 1.3 e solução estoque preparada. A proporção de agar 0,6% (0,5 ml) e 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 mL) foi de 1:1, fazendo o volume total de 1 mL em cada poço de 6 placas bem. </li></ol> 2. Processamento de tecidos <ol><li> Glioblastoma multiforme (GBM) os tecidos foram recebidos imediatamente após a cirurgia do Departamento de Patologia. O tecido foi classificada como GBM do Departamento de Patologia. </li><li> O tecido foi transferido para o patri-placa com a pinça com cuidado e lavados com 1XPBS gelada 5mL por 3 vezes. </li><li> Cortes seriados dos espécimes foram cortados a partir das amostras dissecadas para criar blocos de tumor (aproximadamente 10 mm de diâmetro) com uma lâmina cirúrgica (Feather-2976 # 10) e fórceps (Fisher Scientific). </li><li> Blocos foram transferidos para uma placa de 6 bem. Cada poço foi 1mL contendo de mídia mencionar no passo 1.4. O tecido tinha exposição suficiente para o ar para manter o tecido viável. </li><li> Blocos de tumor foram injectados com ou DMSO (5%) ou TMZ (2,5 nM) e incubados por 16 horas a 37 ° C no ar umidificado contendo 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) ou TMZ foi injetada três vezes em blocos de tumor em lugares diferentes para o tratamento consistente. A droga foi injetada com seringas de insulina 1mL 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort ponto 26.027). </li><li> Após 16 horas blocos foram lavados com 5 mL 1XPBS por 3 vezes. Depois de lavar os blocos foram fixados com 10ml de 10% v / v de formalina por 24 horas (Ricca empresa de produtos químicos) em tubos de 50 ml (Basix-5539802) e processados ​​para inclusão em parafina 4μm seções. </li><li> A seção de formol fixa foi colocada em copo sobre a placa de mexer com o "HEAT NO" e processadas através das seguintes soluções por 30 minutos em cada solução. Etanol 30%, etanol a 50%, etanol 75%, etanol 80%, 95% de etanol, o etanol 100%, e xileno. </li><li> O tecido foi apagado em toalhas de papel e colocados em parafina derretida (58 a 60 ° C, Fisher parafina Paraplast) por 30 minutos. </li><li> O tecido foi incluso em moldes de parafina usando Surgipath Blue Ribbon, o tecido embutida foi resfriado a temperatura ambiente. </li><li> Incluídos em parafina secções de tecido 4μm foram tomadas e colocadas em lâminas de Fisher Plus. </li></ol> 3. Imuno-histoquímica Imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente 1. <ol><li> Desparafinização e reidratação Coloque os slides em um rack e executar os passos seguintes. Xileno por 3x5 minutos (3 vezes por 5 minutos), etanol 100% por alguns minutos 3x5, o etanol 95% por alguns minutos 1x5, o etanol 70% por alguns minutos 1x5, enxágüe em água corrente por 3 minutos. </li><li> Recuperação antigênica com calor induzido epítopo slides recuperação Mergulhe em tampão citrato 1X (Thermo científico-AP9003-500) diluído em água destilada num copo de vidro. Ferver durante 15 minutos em um prato quente (certifique-se seções don "t cair do slide). Solução esfriar por 30 minutos em temperatura ambiente. Lavar as lâminas com PBS 1X para 3x5 minutos. </li><li> Inibição de peróxido interna Mergulhar as lâminas em metanol (Fisher Scientific-A-452-4) com peróxido de hidrogênio 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluído em água destilada) em um copo de vidro durante 15 minutos. Enxágüe em 1X PBS para 3x5 minutos. </li><li> Cubra o bloqueio tecidos com soro de cabra 10% normal. Transferir os slides em uma caixa úmida e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lavar as lâminas com PBS 1X para 3x5 minutos. </li><li> Seções anticorpo primário foram incubadas overnight a 4 ° C com o anticorpo primário em concentrações seguintes: caspase-3 humana específica (1:1.000, R &amp; D de sistemas, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluído com PBS 1X. Enxágüe as lâminas em PBS 1X minutos 3x10 no dia seguinte. </li><li> Reação anticorpo secundário Cubra os tecidos com 2-3 gotas de HRP anticorpo marcado secundário (envision sistemas). Colocar slides em uma caixa úmido e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lavar com PBS 1X para 3x10 minutos. </li><li> Detecção de desenvolver para o DAB cromógeno kit (Vector laboratórios-SK-4100) para detecção do anticorpo primário seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Mergulhe a coloração contra slides com hematoxilina (10-15 s egundos, certifique-don "t overrun DAB sinal). Lavar com água corrente por 3 minutos. </li><li> Mergulhe a desidratação os slides em ordem a seguir, o etanol 70% por 5 minutos, etanol 95% por 5 minutos, o etanol 100% por alguns minutos 3x5, 3x5 para Xileno minutos. </li><li> Tampa de deslizamento das lâminas com o reagente de montagem Permount (Fisher Scientific-SP-15-100). </li><li> Imagens foram obtidas utilizando microscópio de fluorescência Olympus (DP-72) .3.11). Em todos os experimentos, rotulagem específica foi confirmada pelo controle negativo, sem o anticorpo primário. </li></ol> 4. Resultados representativos: Foram coletados espécimes cirúrgicos de glioblastoma multiforme (GBM). Os pacientes foram submetidos a primeira cirurgia sem quimioterapia prévia, incluindo temozolomida (TMZ). A imagem ponderada em T1 da RM com contraste gadolíneo na figura-1a demonstrou um tumor reforçada no lobo frontal direito antes da cirurgia. A imagem no pós-operatório (Figura 1b) confirmou a remoção subtotal da lesão após a cirurgia. Os tecidos cirúrgicos foram enviados para o Departamento de Patologia para o propósito diagnóstico clínico, e as amostras restantes foram processadas para a colheita de tecidos sob o Conselho de Revisão aprovada Institucional (IRB) protocolo na Ohio State University Medical Center. Hematoxilina e eosina (H &amp; E) demonstraram a presença de necrose, células pseudopallisading e microvascular proliferação (Figura 1-c). Assim, esses tumores foram diagnosticados como histopatologicamente GBM. De nota, explantes tumor após incubação sem TMZ até 48 horas manteve a citoarquitetura do GBM. Em contraste, com incubação por 72 horas ou mais, percebemos o aumento do número de núcleos de condensação na amostra, sugerindo algumas das células do tumor de partida para apoptose. Como resultado, os tecidos do tumor após mais de incubação continha regiões irregulares que perdeu as células tumorais, que foram observadas preferencialmente e em torno de áreas de necrose (dados não mostrados). A fim de investigar se estas amostras explante do tumor pode ser utilizado de forma confiável com a finalidade de testar a eficácia da droga, testamos o efeito do tratamento TMZ. A Figura 2 representa o fluxo das experiências neste estudo. Um estudo recente indicou que a injeção intratumoral de TMZ tem um efeito mais potente no controle de crescimento de glioma maligno do que a administração sistêmica da droga 2. Após a incubação por 16 horas, esses explantes foram incorporados com parafina e cortes seriados foram preparados para a coloração. Imuno-histoquímica dos tecidos tratados com TMZ GBM demonstrado uma redução substancial de células Ki-67 positivo tumor em comparação com as amostras de controle. Por sua vez, imuno-histoquímica com um marcador de apoptose, Caspase-3, não deu qualquer diferença significativa entre os espécimes tratados com TMZ glioma e as amostras controle (Figura-3). Efeito do tratamento com TMZ foi ainda caracterizada pela combinação explante este ensaio em conjunto com qualquer cultura in vitro ou citometria de fluxo. Especificamente, buscou-se determinar o efeito sobre células-tronco como as células do tumor (SCLTC). Portanto, após o tratamento intratumoral com TMZ, foi realizado ensaio de esfera formando e citometria de fluxo destes explantes tumor. Os espécimes foram tratados com TMZ dissociada em células individuais única e estas células isoladas foram semeadas em uma densidade baixa (uma células por microlitro ou menos) em placas de 96 poços no soro livre de meio suplementado com bFGF e EGF. No grupo controle, a formação de esferas de tumor do tumor explantes foi observada após sete dias de incubação. Dado que a formação de esfera é uma propriedade da SCLTC 3 4, alterações no número de esferas por um tumor de tratamento da toxicodependência indica o efeito sobre SCLTC. Da mesma forma, a citometria de fluxo dos explantes tumor dissociado com um marcador de superfície celular, CD133, foi realizado para verificar o efeito sobre SCLTC. Se SCLTC nas células tumorais em GBM heterogêneos são seletivamente erradicados por um tratamento medicamentoso, pode-se prever que a citometria de fluxo deve detectar diminuição da fração CD133 positivo pelo tratamento (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura.1 imagens de ressonância magnética (MRI) de um GBM paciente. Figuras representativas de pré-operação Figura 1a-e pós-operação Figura 1b. Figura 1c é H &amp; E de coloração de amostra fresca GBM tecido. Ampliação original, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura. 2 O fluxo experimental do experimento cultura bloco. Figura 2a. Imagem do GBM cirúrgica fresca recebeu do departamento de patologia. Figura 2b mostra Dissecção do bloco de tumor em 10 milímetros pequenos pedaços com a lâmina ajuda cirúrgico. Figura-2c é a droga de tratamento (TMZ) de blocos de tumor usando seringa de insulina. e 3 "/&gt; Figura. 3 Imunohistoquímica. Imunohistoquímica de blocos de tecido GBM injetados com DMSO ou TMZ com ativadas Caspase-3 e Ki67. Hematoxilina foi usado para a coloração nuclear. Ampliação original, 40X.

<ol><li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li>
<li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li>
<li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors%2C+including+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li>
<li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis%2C+delineate+a+pattern+of+disease+progression%2C+and+resemble+stages+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li>
<li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Bing+Li+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li>
<li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li>
<li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li>
<li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab%3A+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Existe uma lacuna entre a eficácia da droga na corrente modelos pré-clínicos e experimentais a eficácia em pacientes. Mais especificamente, no campo da pesquisa de tumor cerebral, novos métodos e confiáveis ​​são necessárias que ajudariam preencher a lacuna existente entre a avaliação de drogas com os métodos atuais ea eficácia em pacientes. O ensaio descrito neste estudo é um recurso adicional, se não uma solução, para facilitar o preenchimento da discrepância dos dados experimentais e os resultados dos pacientes acometidos. Em culturas de células in vitro preferencialmente expandir certos tipos de células tumorais independentemente das condições de cultura, e representam apenas uma subpopulação de todo o tumor. 5 Além disso, transformação genética e fenotípica da célula artificial de expansão ocorre e é inevitável com as culturas de longo prazo de células . Um dos principais obstáculos para o tratamento de glioma maligno é a heterogeneidade das células tumorais, tanto dentro de um único tumor e entre amostras de tumor 6, 7. Portanto, o enriquecimento seletivo de uma determinada população de células tumorais, independentemente de um tipo ou outro, não pode ser um meio adequado para determinar a eficácia de quaisquer agentes quimioterápicos sobre células tumorais heterogêneos. 8 9 modelo Qualquer animal de tumores cerebrais derivadas de uma subpopulação de células tumorais lançar luzes sobre a eficácia da droga em uma subpopulação, mas não todo o tumor. Várias limitações, por outro lado, ainda permanecem neste método explante tumor. Uma tal limitação é o período relativamente curto de tratamento. Uma vez que células de tumores malignos são considerados para adquirir resistência para a maioria, senão todas, as terapias ao longo do tempo, o controle inicial do crescimento de células tumorais de curto prazo pode não ser reflectida pelo prognóstico do paciente a longo prazo, como foi relatado recentemente com um anti- angiogênico agente, 10 bevacizumab. Assim, a melhoria do protocolo para este ensaio explante para preservar tecidos por um longo período é necessário com outras investigações. Outra questão é um efeito específico de um medicamento testado em SCLTC no tumor. Dado que SCLTC são relativamente resistentes às terapias atuais para glioma maligno, identificação de novos medicamentos anti-cancerígenos que potently erradicar SCLTC se justifica. A este respeito, que atualmente procuram combinar este ensaio explante com a subseqüente em experimentos in vitro, tais como ensaio formando neurosphere (dados não mostrados). Esperamos para saber mais sobre os efeitos, se houver, de um candidato de drogas em SCLTC através destes ensaios combinados. Por fim, usando pequenos blocos de amostras de tumor pode não refletir a população de células inteiras tumor, como é o caso com as linhas convencionais tumor de células ou culturas primárias de espécimes cirúrgicos. Estas questões de lado, preservando estroma tumoral, incluindo o nicho vascular, é útil na caracterização dos fatores ambientais para as células do tumor. Portanto, este ensaio pode ter potencial para avaliar qualquer estratégias terapêuticas sob uma condição mais fisiologicamente relevantes. Aqui, nós estabelecemos um ensaio para testes de drogas com eficácia explantes de espécimes cirúrgicos de GBM. Na verdade, com os espécimes testados cirúrgica, descobrimos que uma injeção direta de TMZ reduz a proliferação nas amostras de GBM. Este método de explantes de tecido é teoricamente aplicável a outros tumores sólidos e fornece ativo para determinar a eficácia da droga sobre o tumor de um paciente, que esperamos nos ajudar a evitar um novo fracasso em ensaios clínicos para o câncer.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino, qualificados, inativado pelo calor </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Líquido 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar Agar-purificada, Granulado </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS para a coloração </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Richalrd allan sci </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% Caspase-3 w / v formol </td><td> Ricca empresa química </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspase-3 </td><td> R &amp; D de sistemas </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-rato </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-coelho </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vector Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tabela 1. Materiais. <table border="1"><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 6 Placa Bem </td><td> Greiner bio-um </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Placa de Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Sorológicos pipeta </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Pontas com filtro </td><td> EUA científica </td><td></td></tr><tr><td> 500 mm de malha de poliéster NetWell inserir </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> Seringa de 10 ml BD </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Hipodérmica Hub alumínio agulha. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Frasco de cultura de tecidos </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga </td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Finos tubos de parede </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Lâmina de aço inoxidável cirúrgico </td><td> Pena </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Seringa de insulina </td><td> Ponto de conforto </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50mL tubo de tampa plana tampa de rosca </td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Pinça </td><td> Fisher Sci </td><td></td></tr></table> Equipamentos tabela 2..

método para desenvolvimento de drogas anti-câncer novel utilizando explantes tumor de espécimes cirúrgicos

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

As terapias atuais para glioma maligno têm apenas efeito paliativo. Para o desenvolvimento de terapêuticas, um obstáculo é a discrepância de eficácia determinada por testes de drogas atual eficácia ea eficácia em pacientes. Assim, novos métodos e confiável para avaliar a eficácia da droga estão garantidos na fase pré-clínica. Na cultura in vitro de tecidos tumorais, incluindo linhagens de células, tem substanciais alterações fenotípicas, genéticas e epigenéticas de células de câncer causado pelo ambiente artificial de cultura de células, que podem não refletir a biologia dos tumores originais in situ. Modelos de xenoenxerto com os ratos imunodeficientes também têm limitações, isto é, a falta de sistema imunológico e interespécies discrepâncias genéticas e epigenéticas no microambiente. Aqui, nós demonstramos um novo método usando a espécimes cirúrgicos de glioma maligno como blocos de tumor não dissociado para avaliar os efeitos do tratamento. Para validar este método, os dados com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida (TMZ), são descritos. Utilizou-se o espécime recém-removido cirúrgico de gliomas malignos para nossos experimentos. Realizamos a injeção intratumoral de TMZ ou candidatos de outras drogas, seguido de incubação e análises sobre espécimes cirúrgicos. Aqui, procurou-se estabelecer um método de explante tumor de tecido como uma plataforma para determinar a eficácia de novas terapias anti-câncer para que possamos ser capazes de superar, pelo menos, algumas das limitações atuais e preencher o hiato existente entre o experimental atual dados ea eficácia em tumor de um paciente real. Este método pode ter o potencial de acelerar a identificação novos agentes quimioterápicos para tratamento de câncer sólido.

Aqui, nós estabelecemos um método para testar a eficácia de drogas com espécimes cirúrgicos dos tumores cerebrais, denominado &quot;método de explante tumor&quot;. Com este método, podemos avaliar a eficácia da droga, sem quebrar o microambiente de tumores sólidos. Para validar a confiabilidade deste método, descrevemos dados representativos com nosso exemplar glioma tratadas com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida.

Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos

As terapias atuais para o glioma maligno têm apenas efeito paliativo. Para o desenvolvimento terapêutico, um dos obstáculos é a discrepância na eficácia determinada...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um novo método para testar a eficácia de medicamentos com espécimes cirúrgicos de tumores cerebrais denominado método tumor X explante. Isso é realizado primeiramente obtendo espécimes cirúrgicos recém-removidos de gliomas malignos durante a cirurgia, para experimentos pré-clínicos. Em seguida, as amostras são transportadas para a unidade central de obtenção de tecidos, onde são separadas para fins de diagnóstico clínico e de pesquisa.Em seguida, no laboratório de pesquisa, os explantes tumorais são dissecados em tecidos menores e transferidos para um meio otimizado. Por fim, são realizadas injeções intratumorais com candidatos a fármacos e os explantes são incubados por 16 horas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que revelam a eficácia do tratamento por meio da coloração com hematina e ein, bem como por imuno-histoquímica com marcadores específicos de tipo celular.Também podemos avaliar a eficácia de fármacos in vitro utilizando citometria de fluxo e ensaios de formação de neuroesferas. A maioria dos ensaios atuais de eficácia de fármacos deixa uma lacuna entre a eficácia do fármaco nos modelos experimentais pré-clínicos atuais e a eficácia em pacientes internados. Em particular, quando testamos candidatos a fármacos em cânceres sólidos, como gliomas malignos, não podemos subestimar as trocas de sinalização intercelular bem como intracelular.Para evitar a ruptura do microambiente de tumores sólidos, estabelecemos um método de cultura antígena com o nosso explante tumoral. Após a remoção dos tumores dos pacientes, as amostras são transferidas para o Departamento de Patologia, onde dividimos os fragmentos tumorais em duas partes. Uma parte da amostra tumoral é utilizada para corte congelado e inclusão em parafina para diagnóstico clínico, e o restante do tecido tumoral é enviado aos laboratórios de pesquisa para ser utilizado pelos pesquisadores.Utilizando o método, podemos preservar o microambiente do tumor com células endoteliais tumorais adjacentes e células imunes, bem como células cerebrais normais que estão ao redor do tumor ou migrando para as cavidades tumorais. Antes de processar o tecido de glioblastoma, prepare a solução líquida, o meio e a solução de ágar. Misture-os em uma proporção de um para um.Em seguida, adicione um mililitro a cada poço de placas de seis poços. Após receber o tecido fresco de glioblastoma multiforme, transfira-o para uma placa de Petri usando pinça e lave cuidadosamente três vezes com cinco mililitros de PBS gelado uma vez com lâmina cirúrgica e pinça. Corte secções seriadas com cerca de 10 milímetros de diâmetro das amostras dissecadas para criar blocos tumorais, transfira cada bloco para um poço de uma placa de seis poços contendo meio de ágar, permitindo que tenha exposição suficiente ao ar para mantê-lo viável.Em seguida, utilizando uma seringa de insulina de um mililitro e uma agulha de 28 graus com meio polegada, injete os blocos tumorais três vezes com DMSO a 5% ou com temozolomida a 2,5 nanomolar ou com um novo candidato a fármaco antineoplásico e incube por 16 horas a 37 graus Celsius em atmosfera úmida contendo 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, lave os blocos três vezes com cinco mililitros de PBS uma vez. Em seguida, em tubos de 50 mililitros, fixe os blocos com 10 mililitros de formalina a 10% volume por volume por 24 horas.Incorpore o tecido em parafina e corte seções de quatro mícrons para desparafinizar, hidratar e reidratar as seções. Coloque as lâminas em uma gradinha e incube-as nas seguintes soluções. Lave três vezes por cinco minutos cada.Etanol a 100% três vezes por cinco minutos cada. Etanol a 95% uma vez por cinco minutos e etanol a 70% uma vez por cinco minutos. Por fim, enxágue com água corrente por três minutos.Consulte o protocolo escrito em anexo para obter detalhes sobre a recuperação de antígenos e inibição da peroxidase interna. Para bloquear as seções, cubra os tecidos com soro de cabra normal a 10%, transfira as lâminas para uma caixa úmida e incube por uma hora à temperatura ambiente. Lave as lâminas três vezes em PBS uma vez, durante cinco minutos cada.Em seguida, adicione anticorpos primários, como caspase-3 específica para humanos ou KI-67, diluídos em PBS 1× e incube durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave as lâminas em PBS 1× três vezes, por 10 minutos cada. Em seguida, cubra os tecidos com duas a três gotas de anticorpo secundário marcado com HRP.Coloque as lâminas em uma caixa úmida e incube por uma hora à temperatura ambiente. Lave com PBS 1X três vezes, durante cinco minutos cada. Desenvolva as amostras utilizando um kit de cromógeno DAB, seguindo as instruções do fabricante, para contracoloração.Mergulhe as lâminas em hematina por 10 a 15 segundos. Em seguida, enxágue com água corrente da torneira por três minutos. Desidrate as amostras mergulhando as lâminas nas seguintes soluções em um reagente de montagem e uma lamínula.Em seguida, utilize um microscópio de fluorescência para imaginar as lâminas. A imagem de ressonância magnética ponderada em T1 com realce por gadolínio nesta figura demonstra um tumor de glioblastoma multiforme ou GBM realçado no lobo frontal direito de um paciente antes da cirurgia. A imagem pós-operatória confirmou a remoção subtotal da lesão após a cirurgia.A coloração com hematoxilina e eosina demonstra a presença de necrose, células em pseudo-filátrides e proliferação microvascular. Assim, esses tumores foram diagnosticados histopatologicamente como GBM para investigar se essas amostras de explantes tumorais poderiam ser utilizadas de forma confiável. Com o objetivo de um teste de eficácia medicamentosa, avaliamos o efeito do medicamento temozolomida ou TMZ; a imuno-histoquímica de tecidos GBM tratados com TMZ demonstra uma redução substancial de células tumorais positivas para KI-67 em comparação com as amostras controle.Por sua vez, a imuno-histoquímica com um marcador de apoptose, a caspase três, não revelou diferença significativa entre espécimes de glioma tratados com TMZ e as amostras controle. O efeito do tratamento com temozolomida pode ser ainda caracterizado combinando este ensaio ex plan com cultura in vitro ou citometria de fluxo. Podemos comparar este método ex plan com transplante de xenoenxerto e com o ensaio de formação de esferoides in vitro para triagem de novos agentes antineoplásicos.Uma vez obtidos os tecidos tumorais no laboratório, o procedimento para este experimento pode ser concluído em até uma hora. Este novo ensaio é relativamente fácil de realizar e reprodutível após a dissociação dos implantes tumorais tratados. Podemos combiná-lo com experimentos in vitro.Uma grande vantagem deste ensaio é que ele preserva o microambiente tumoral. Obtemos dados positivos com explantes tumorais tratados com Temodar, que foram consistentes com o desfecho dos mesmos pacientes submetidos ao tratamento com Temodar após cirurgias. Por fim, este método é aplicável a outros cânceres sólidos e, portanto, pode ter o potencial de acelerar a identificação de novos agentes quimioterápicos para o tratamento de cânceres sólidos.

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Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra uma técnica para estudar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. Após a injeção subcutânea de células cancerígenas em camundongos para a formação de tumores, são injetados anticorpos marcados com fluorescência que se ligam a receptores específicos do tumor, permitindo a avaliação in vivo da localização do anticorpo por meio de imagens.

Uma técnica para avaliar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor

Este vídeo demonstra uma técnica de localização por imunofluorescência in vivo (IVIL) para estudar a biodistribuição de anticorpos direcionados ao tumor em um modelo murino de câncer de mama. Após a injeção intravenosa de um anticorpo específico do tumor no camundongo, o tumor é isolado cirurgicamente e a localização do anticorpo dentro do tecido tumoral é confirmada por imunocoloração ex vivo.

Um método de localização de imunofluorescência in vivo para estudar a biodistribuição de anticorpos

Linhas celulares de cancro estabelecidos e xenotransplantes têm sido o esteio da pesquisa do câncer para as últimas décadas. No entanto, evidências recentes sugerem que a resposta terapêutica é muito influenciada pelo microambiente de células tumorais. Portanto, foi desenvolvida uma análise ex vivo de amostras de tumor primário para fins de desenvolvimento de drogas.

Ex Vivo resposta ao tratamento de tumores primários e / ou Associated Metástases para pré-clínica e clínica de Desenvolvimento Therapeutics

Utilizando tumores derivados do paciente em um modelo pré-clínico subcutânea é uma excelente maneira de estudar a eficácia de novas terapias, a descoberta de biomarcadores preditivos, e vias resistentes aos medicamentos. Este modelo, no processo de desenvolvimento de medicamentos, é essencial para determinar o destino de muitas terapias anti-cancro novos antes da investigação clínica.

Desenvolvimento e manutenção de um tumor do paciente pré-clínica Derivado Xenoenxerto Modelo de Investigação de Novel Anti-Cancer Therapies

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

Aqui, apresentamos um protocolo utilizar injeção guiada por ultra-som de neuroblastoma (NB) e células (ES) de sarcoma de Ewing (estabeleceu linhas celulares e células tumorais do paciente-derivado) biologicamente relevantes locais para criar modelos pré-clínicos confiáveis para câncer pesquisa.

Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático

Nós fornecemos um método para a geração, cultivo e análise sistemática de fatias de organotypic derivadas de tumores de pulmão murino. Descrevemos também como otimizar para espessura da fatia e como selecionar as concentrações de drogas para tratar a fatias de tumor.

Estabelecimento e análise do Tumor fatia Explants como um pré-requisito para o teste de diagnóstico

O método de localização de imunofluorescência in vivo (IVIL) pode ser usado para examinar a biodistribuição in vivo de anticorpos e conjugados de anticorpo para fins oncológicos em organismos vivos usando uma combinação de segmentação tumoral in vivo e imunocoloração ex vivo Métodos.

In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) e modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados recapitulam fielmente a doença humana e são modelos preferidos para pesquisas básicas e translacionais sobre câncer de mama. Aqui, um método é descrito para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária para estudar biologia tumoral e avaliar a resposta medicamentosa.

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Este artigo descreve métodos para a geração, tratamento medicamentoso e análise de explants derivados do paciente para avaliar as respostas de medicamentos tumorais em um sistema modelo pré-clínico vivo, relevante para o paciente.

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Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos

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