Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um novo método para testar a eficácia de medicamentos com espécimes cirúrgicos de tumores cerebrais denominado método tumor X explante. Isso é realizado primeiramente obtendo espécimes cirúrgicos recém-removidos de gliomas malignos durante a cirurgia, para experimentos pré-clínicos. Em seguida, as amostras são transportadas para a unidade central de obtenção de tecidos, onde são separadas para fins de diagnóstico clínico e de pesquisa.

Em seguida, no laboratório de pesquisa, os explantes tumorais são dissecados em tecidos menores e transferidos para um meio otimizado. Por fim, são realizadas injeções intratumorais com candidatos a fármacos e os explantes são incubados por 16 horas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que revelam a eficácia do tratamento por meio da coloração com hematina e ein, bem como por imuno-histoquímica com marcadores específicos de tipo celular.

Também podemos avaliar a eficácia de fármacos in vitro utilizando citometria de fluxo e ensaios de formação de neuroesferas. A maioria dos ensaios atuais de eficácia de fármacos deixa uma lacuna entre a eficácia do fármaco nos modelos experimentais pré-clínicos atuais e a eficácia em pacientes internados. Em particular, quando testamos candidatos a fármacos em cânceres sólidos, como gliomas malignos, não podemos subestimar as trocas de sinalização intercelular bem como intracelular.

Para evitar a ruptura do microambiente de tumores sólidos, estabelecemos um método de cultura antígena com o nosso explante tumoral. Após a remoção dos tumores dos pacientes, as amostras são transferidas para o Departamento de Patologia, onde dividimos os fragmentos tumorais em duas partes. Uma parte da amostra tumoral é utilizada para corte congelado e inclusão em parafina para diagnóstico clínico, e o restante do tecido tumoral é enviado aos laboratórios de pesquisa para ser utilizado pelos pesquisadores.

Utilizando o método, podemos preservar o microambiente do tumor com células endoteliais tumorais adjacentes e células imunes, bem como células cerebrais normais que estão ao redor do tumor ou migrando para as cavidades tumorais. Antes de processar o tecido de glioblastoma, prepare a solução líquida, o meio e a solução de ágar. Misture-os em uma proporção de um para um.

Em seguida, adicione um mililitro a cada poço de placas de seis poços. Após receber o tecido fresco de glioblastoma multiforme, transfira-o para uma placa de Petri usando pinça e lave cuidadosamente três vezes com cinco mililitros de PBS gelado uma vez com lâmina cirúrgica e pinça. Corte secções seriadas com cerca de 10 milímetros de diâmetro das amostras dissecadas para criar blocos tumorais, transfira cada bloco para um poço de uma placa de seis poços contendo meio de ágar, permitindo que tenha exposição suficiente ao ar para mantê-lo viável.

Em seguida, utilizando uma seringa de insulina de um mililitro e uma agulha de 28 graus com meio polegada, injete os blocos tumorais três vezes com DMSO a 5% ou com temozolomida a 2,5 nanomolar ou com um novo candidato a fármaco antineoplásico e incube por 16 horas a 37 graus Celsius em atmosfera úmida contendo 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, lave os blocos três vezes com cinco mililitros de PBS uma vez. Em seguida, em tubos de 50 mililitros, fixe os blocos com 10 mililitros de formalina a 10% volume por volume por 24 horas.

Incorpore o tecido em parafina e corte seções de quatro mícrons para desparafinizar, hidratar e reidratar as seções. Coloque as lâminas em uma gradinha e incube-as nas seguintes soluções. Lave três vezes por cinco minutos cada.

Etanol a 100% três vezes por cinco minutos cada. Etanol a 95% uma vez por cinco minutos e etanol a 70% uma vez por cinco minutos. Por fim, enxágue com água corrente por três minutos.

Consulte o protocolo escrito em anexo para obter detalhes sobre a recuperação de antígenos e inibição da peroxidase interna. Para bloquear as seções, cubra os tecidos com soro de cabra normal a 10%, transfira as lâminas para uma caixa úmida e incube por uma hora à temperatura ambiente. Lave as lâminas três vezes em PBS uma vez, durante cinco minutos cada.

Em seguida, adicione anticorpos primários, como caspase-3 específica para humanos ou KI-67, diluídos em PBS 1× e incube durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave as lâminas em PBS 1× três vezes, por 10 minutos cada. Em seguida, cubra os tecidos com duas a três gotas de anticorpo secundário marcado com HRP.

Coloque as lâminas em uma caixa úmida e incube por uma hora à temperatura ambiente. Lave com PBS 1X três vezes, durante cinco minutos cada. Desenvolva as amostras utilizando um kit de cromógeno DAB, seguindo as instruções do fabricante, para contracoloração.

Mergulhe as lâminas em hematina por 10 a 15 segundos. Em seguida, enxágue com água corrente da torneira por três minutos. Desidrate as amostras mergulhando as lâminas nas seguintes soluções em um reagente de montagem e uma lamínula.

Em seguida, utilize um microscópio de fluorescência para imaginar as lâminas. A imagem de ressonância magnética ponderada em T1 com realce por gadolínio nesta figura demonstra um tumor de glioblastoma multiforme ou GBM realçado no lobo frontal direito de um paciente antes da cirurgia. A imagem pós-operatória confirmou a remoção subtotal da lesão após a cirurgia.

A coloração com hematoxilina e eosina demonstra a presença de necrose, células em pseudo-filátrides e proliferação microvascular. Assim, esses tumores foram diagnosticados histopatologicamente como GBM para investigar se essas amostras de explantes tumorais poderiam ser utilizadas de forma confiável. Com o objetivo de um teste de eficácia medicamentosa, avaliamos o efeito do medicamento temozolomida ou TMZ; a imuno-histoquímica de tecidos GBM tratados com TMZ demonstra uma redução substancial de células tumorais positivas para KI-67 em comparação com as amostras controle.

Por sua vez, a imuno-histoquímica com um marcador de apoptose, a caspase três, não revelou diferença significativa entre espécimes de glioma tratados com TMZ e as amostras controle. O efeito do tratamento com temozolomida pode ser ainda caracterizado combinando este ensaio ex plan com cultura in vitro ou citometria de fluxo. Podemos comparar este método ex plan com transplante de xenoenxerto e com o ensaio de formação de esferoides in vitro para triagem de novos agentes antineoplásicos.

Uma vez obtidos os tecidos tumorais no laboratório, o procedimento para este experimento pode ser concluído em até uma hora. Este novo ensaio é relativamente fácil de realizar e reprodutível após a dissociação dos implantes tumorais tratados. Podemos combiná-lo com experimentos in vitro.

Uma grande vantagem deste ensaio é que ele preserva o microambiente tumoral. Obtemos dados positivos com explantes tumorais tratados com Temodar, que foram consistentes com o desfecho dos mesmos pacientes submetidos ao tratamento com Temodar após cirurgias. Por fim, este método é aplicável a outros cânceres sólidos e, portanto, pode ter o potencial de acelerar a identificação de novos agentes quimioterápicos para o tratamento de cânceres sólidos.