Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

Um método para a incorporação de DNA plasmidial em células da retina de camundongos com o propósito de realizar qualquer ganho ou perda de função de estudos

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de eletroporação in vivo em camundongos neonatais, a fim de introduzir material genético de forma estável nas células da retina. Isso é feito primeiro anestesiando, um camundongo neonatal no gelo por aproximadamente cinco a 10 minutos. O segundo passo do procedimento é identificar a junção das pálpebras fundidas e abrir o olho cortando ao longo dessa junção.

Uma incisão é então feita no olho para facilitar a inserção da seringa de microinjeção. A seringa de microinjeção é então inserida através da incisão e a solução de DNA injetada no espaço sub-retiniano. Finalmente, um eletrodo de pinça é colocado na cabeça do pop e uma série de pulsos elétricos são entregues.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a transdução retroviral, é que a eletroporação in vivo não requer a geração e manuseio de agentes biológicos como ferramentas para a entrega de genes. Como resultado, a técnica requer menos trabalho, menos reagentes e pode ser conduzida em qualquer estação de trabalho aprovada para procedimentos com animais. Geralmente, os indivíduos novos na técnica terão dificuldades porque leva tempo e repetição para desenvolver uma sensação para a colocação da seringa de microinjeção no espaço sub-retiniano.

Demonstrando o procedimento estará Jimmy DeMilo, um pós-doutorando em meu laboratório. Como a concentração de DNA necessária para a eletroporação é relativamente alta, o DNA do plasmídeo desejado é primeiro amplificado por células incompetentes extraídas usando uma maxi prep, depois purificado e concentrado em cerca de cinco microgramas por microlitro. O corante verde rápido FCF é adicionado como um marcador de injeção.

Uma vez que o DNA do plasmídeo tenha sido preparado, anestesiou filhotes de camundongos recém-nascidos em gelo por aproximadamente cinco minutos, monitorando-os até que a inconsciência seja confirmada pela compressão da pata. Troque a área do olho a ser injetada com álcool de perfil 70% isop e use um microscópio de dissecação para identificar o epitélio juncional FUS onde as pálpebras se juntam. Usando uma agulha afiada de calibre 30, abra cuidadosamente o olho cortando ao longo do epitélio juncional fundido sem aplicar pressão excessiva para baixo ou cortar além da faixa da pálpebra.

Uma vez aberta a pálpebra e exposto o olho, use a ponta da agulha para fazer uma pequena incisão na esclera perto da junção com a córnea, tomando cuidado para não penetrar muito profundamente e perfurar o cristalino. Insira a agulha de injeção de ponta romba na incisão. Apenas até que a resistência da parede escleral oposta seja sentida, injete lentamente 0,3 microlitros da solução viscosa de DNA no espaço sub-retiniano.

Tomando cuidado para não pressionar com muita força contra a parede escleral, gire o animal para verificar se há uma distribuição uniforme da solução de DNA na retina. Primeiro, mergulhe o eletrodo da pinça em PBS para maximizar a condutividade elétrica. Em seguida, coloque a cabeça do filhote injetado entre os eletrodos com o olho injetado adjacente ao eletrodo do pólo positivo e o olho não injetado adjacente ao eletrodo do pólo negativo.

Aplique cinco pulsos quadrados usando um gerador de pulsos, com cada pulso tendo 80 volts e 50 milissegundos de duração com um intervalo de 950 milissegundos entre os pulsos. Por fim, aqueça os filhotes sob uma lâmpada de aquecimento até que eles se recuperem da anestesia com gelo. Após a recuperação, devolva os filhotes eletroporados à mãe no terceiro dia pós-natal.

A maioria das células eletroporadas EGFP fica na camada neuroplásica da retina e não demonstra características morfológicas distintas de nenhuma das células gliais neurais diferenciadas da retina. No 14º dia pós-natal, as células eletroporadas podem ser encontradas na camada nuclear externa e na camada nuclear interna da retina e nas várias células marcadas. Agora exibem características morfológicas características de neurônios diferenciados.

Ao tentar este procedimento, é importante executar todas as etapas de maneira suave e uniforme. É muito fácil danificar as retinas durante a microinjeção e as práticas necessárias para desenvolver a destreza manual necessária para evitar danos aos tecidos. Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como imuno-histoquímica ou hibridização in situ, podem ser realizados para determinar se a expressão de genes de interesse é regulada para cima ou para baixo nas eletrorretinas.