Bromodeoxiuridina Labeling (BrdU) e separação de células subseqüentes Fluorescence Activated de Cultura independente de Identificação de carbono orgânico dissolvido de degradação bacterioplâncton

Os micróbios mediam a degradação de inúmeras substâncias de carbono orgânico dissolvido ou compostos de COD, como em ambientes aquáticos e de Racine. Para compreender plenamente o papel dos micróbios na transformação do COD, é necessário identificar simultaneamente sua taxonomia e função. Este vídeo demonstra um procedimento para a identificação taxonômica de bactérias livres ou plâncton bacteriano que transformam reservatórios específicos de COD e ambientes aquáticos.

As amostras de água coletadas de um ambiente de teste são processadas e incubadas com um composto de interesse e bromodesoxiuridina, BRDU, que se incorpora ao DNA recém-sintetizado e às células em crescimento ativo. Em seguida, o plâncton bacteriano marcado com BRDU é rotulado com anticorpos anti-BRDU conjugados com ZI. O plâncton bacteriano com altos níveis de marcação por BRDU é isolado por meio de triagem celular ativada por fluorescência.

O DNA é então extraído das células classificadas e a identificação taxonômica é realizada com base nos resultados da análise do gene do RNA ribossomal 16S por PCR. Olá, meu nome é Steven Robbins, do laboratório da Dra. Chen Mao, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Kent. Hoje, lu e eu vamos mostrar a vocês um método independente de cultivo para a identificação de plâncton bacteriano degradador de DOC em ambientes aquáticos.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a adição de nutrientes seguida de análise do DNA da comunidade bacteriana, é que ela direciona a análise para bactérias altamente ativas e exclui células dormentes e de crescimento lento. Apresentamos aqui a identificação de bactérias da bananeira que utilizam um composto específico de DOC. No entanto, este método também pode ser aplicado para estudar o plâncton bacteriano que utiliza outro composto único de DOC ou grupos de DLCs, como exsudatos de algas.

Então, vamos coletar algumas amostras de água e começar. Antes de analisar as amostras de água quanto a plâncton bacteriano degradador de DOC, as amostras de água devem ser adequadamente processadas. As amostras mostradas aqui foram coletadas da costa da Geórgia para remover partículas grandes e ER VREs da amostra de água.

Utilize uma bomba peristáltica para transferir água do garrafão de coleta para uma unidade de filtração com filtro de tamanho de poro de um micrômetro. Em seguida, transfira alíquotas de 36 mililitros do filtrado para três tubos estéreis de 50 mililitros de polipropileno, cada um contendo quatro mililitros de solução fresca de paraformaldeído a 10%. Incube por duas horas à temperatura ambiente para preservar as células após a incubação.

Despeje a água na torre de filtração de uma unidade de filtração a vácuo de vidro com filtros de membrana branca de 0,22 micrômetro de diâmetro de poro e aplique o vácuo para puxar a solução através do filtro. Lave o filtro aplicando 10 mililitros de PBS através do filtro a vácuo. Identifique os filtros como controles negativos e armazene-os a menos 20 graus Celsius.

Para estabelecer um ecossistema experimental ou microcosmo, comece preenchendo seis frascos de vidro de um litro, previamente lavados, com 800 mililitros da amostra de água previamente filtrada. Adicione BRDU a cada microcosmo até uma concentração final de 10 micromolar. Gire rapidamente o frasco manualmente para homogeneizar.

Cada amostra será analisada em triplicata. Assim, adicione o composto modelo de DOC a três dos microcosmos. Aqui, a reina é adicionada aos microcosmos numa concentração final de 100 nanomolar.

Em seguida, adicione PBS estéril aos outros três microcosmos. Estes servirão como controles sem DOC. Coloque todos os microcosmos em um incubador com agitação a 100 RPM, no escuro e à temperatura in situ, que é de 25 graus Celsius, nos tempos de 0, 8, 16 e 24 horas.

Colete 36 mililitros de cada microcosmo em um tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros contendo quatro mililitros de paraformaldeído fresco a 10%, e incube por duas horas à temperatura ambiente para fixar as células. Em seguida, filtre as células fixadas através de filtros membrana brancos com porosidade de 0,22 micrômetros. Passe 10 mililitros de PBS através do filtro sob vácuo para remover os resíduos de PFA.

Prossiga imediatamente para a detecção imuno em local fixo (INS) ou armazene os filtros a menos 20 graus Celsius para ensaio de incorporação de BRDU em plâncton bacteriano. Comece colocando os filtros das amostras em temperatura ambiente para comprometer a parede celular bacteriana. Coloque o filtro em uma unidade de filtração, em seguida pipete um mililitro de solução de lisozima sobre o filtro para cobrir as células e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Após a incubação, aplique vácuo para remover a solução. Assim que a solução passar pelo filtro, lave as células adicionando 10 mililitros de PBS e aplique vácuo. Em seguida, para comprometer ainda mais a parede celular, adicione um mililitro de solução de proteinase K ao filtro, cobrindo completamente as células.

Incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Lave com PBS para produzir DNA em camadas simples. Adicione um mililitro de solução de exonuclease para cobrir as células no filtro.

Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, lave o filtro passando 10 mililitros de PBS através do filtro a vácuo. Em seguida, corte as bordas do filtro para remover a parte que não contém células.

Em seguida, sobre uma superfície seca limpa com álcool, use uma lâmina estéril para cortar o filtro em oito pedaços de tamanho igual. Oito câmaras de incubação com selo de quadro são necessárias para cada amostra; coloque um oitavo do filtro na câmara de incubação com selo de quadro montada, com o lado da amostra voltado para cima. Uma vez que as câmaras estejam montadas, use o kit de fluxo para proliferação celular Roche Intu para detectar células marcadas com A-B-R-D-U in situ.

Após a conclusão dos procedimentos de repouso, remova a seção do filtro da câmara de incubação e coloque-a sobre uma superfície estéril; utilizando uma lâmina estéril, corte a seção do filtro em pequenos pedaços. Transfira os pedaços do filtro para um tubo microcentrífugo de dois mililitros contendo um mililitro de PBS, feche bem o tubo e selo com parafina. Em seguida, incube o tubo em um incubador com agitação a 37 graus Celsius e 200 RPM por 10 minutos.

Após a incubação, feche o tubo e vortexe na velocidade máxima. Por cinco minutos, pipete o sobrenadante SUP para um tubo estéril de 15 mililitros de polipropileno. Em seguida, ressuspenda o filtro em PBS e repita os passos de vortex e incubação mais duas vezes, adicionando cada vez o sobrenadante ao mesmo tubo de 15 mililitros para cada amostra.

Armazene as células ressuspendidas a quatro graus Celsius. A amostra deve ser analisada por fax até dois dias após a coleta. Por fim, realize a classificação das células para obter a população com alto nível de incorporação de BRDU.

Aqui, utiliza-se um citômetro de fluxo BD FACS e o software correspondente. Após as células terem sido classificadas, a população enriquecida com BrdU pode ser analisada para determinar sua identidade taxonômica. Para amplificar os genes do RNA ribossômico 16S de bactérias filtradas, realize PCR: pipete as células classificadas sobre um filtro de membrana de policarbonato branco com poro de 0,22 µm e ligue a bomba de vácuo; em seguida, usando uma lâmina estéril, corte as bordas livres de células do filtro.

Corte o filtro em quatro pedaços de tamanho igual para cada condição, coloque um único pedaço do filtro em cada um dos três tubos de reação PCR com as células voltadas para o interior do tubo. Adicione 45 microlitros de água grau PCR. Deixe a seção do filtro submergir completamente na água.

Em seguida, adicione dois grânulos Roche illustra pure T ready to go PCR e vortex brevemente para ajudar a dissolver os grânulos. Em seguida, adicione dois microlitros de cada iniciador, sentido direto e reverso, do gene do RNA ribossomal 16 s.

Adicione um microlitro de BSA para ajudar na absorção de inibidores de amplificação ou um microlitro de água. Realize a amplificação por PCR em um termociclador. Recomenda-se um programa de PCR com touchdown, no qual a temperatura de annealing diminui sequencialmente de 62 para 52 graus Celsius em um grau Celsius por ciclo, seguido por 15 ciclos a 52 graus Celsius.

Confirme a amplificação por PCR por eletroforese em géis de agarose a 1% corados com brometo de etídio, recorte os amplicons de PCR do gel e purifique com um kit de extração rápida de gel KaiGen cayo. Após a purificação em gel de PCR, reúna os amplicons da mesma amostra. Os amplicons de DNA ribossomal 16 s purificados estão agora prontos para diversas análises moleculares.

As amostras foram coletadas em um local costeiro da Geórgia e processadas para estudar bactérias degradadoras de Racine seguindo os procedimentos descritos neste vídeo. Racine é um composto poliamídico que pode ser encontrado amplamente em ambientes marinhos. Ele pode servir como fonte de nutrientes e energia para bactérias marinhas, conforme demonstrado aqui.

A análise fatorial de amostras revelou que, após uma incubação de 24 horas, um grupo de bactérias com maior intensidade de fluorescência de FXI, positivamente relacionada ao grau de incorporação de BRDU, se desenvolveu em microcosmos enriquecidos com Racine. Essas células foram designadas como células com alta incorporação de BRDU ou HI e esperava-se que contivessem principalmente bactérias degradadoras de Racine. Nenhum hi.

Foram encontradas células nos controles sem adição, que continham apenas células com níveis mais baixos de incorporação de BRDU, referidas como células lii, que se esperava conter principalmente plâncton bacteriano que não foi capaz de utilizar. Células Racine HI adicionadas foram separadas em tubos distintos e então coletadas em filtros de membrana. Amplicons parciais do gene de RNA ribossômico 16S foram obtidos após PCR em filtro e confirmados por eletroforese em gel.

Após a filtragem de separação, pode-se também realizar a amplificação por PCR de genes funcionais para examinar a diversidade funcional entre as células separadas. Acabamos de mostrar como separar e identificar fisicamente células bacterianas funcionais em ambientes aquáticos utilizando uma abordagem que combina a triagem de células ativadas por fluorescência e a incorporação de BRDU. Lembre-se, é necessário usar avental, jaleco de laboratório e luvas durante a realização deste procedimento.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.