ReAsH / Flash Rotulagem e Análise de Imagem Sensor de Proteínas em Células Tetracysteine

O objetivo geral deste procedimento é rotular células que expressam uma tetracisteína e uma proteína marcada com fluorescência com os corantes flash ou cinzas e analisar quantitativamente os resultados. Isso é feito primeiro por transecção, um plasmídeo carregando uma proteína fluorescente e a proteína-alvo contendo uma marca de tetracisteína na linha celular de interesse. Em seguida, a proteína expressa é marcada com R ou flash, e a dieta não especificamente ligada é removida por lavagem com LBA para se preparar para imagens microscópicas.

Em seguida, um microscópio confocal é usado para coletar imagens fluorescentes das células com os canais de cinzas ou flash e proteínas fluorescentes. Finalmente, as imagens são analisadas usando a imagem J para quantificar a ligação de cinzas ou flash à proteína alvo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a extensão das cinzas ou ligação instantânea à proteína-alvo nas células por meio da correlação da fluorescência das cinzas com a fluorescência da proteína fluorescente.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como simplesmente pegar a proteína alvo com GFP, é que pode rastrear uma segunda propriedade da proteína, como mudança conformacional, além de sua localização. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de subestrutura e função da proteína, como eventos de ização, mudanças conformacionais e eventos de ligação LI que alteram a capacidade do TAC de banir cinzas ou flash. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando queríamos avaliar como pequenos polígamos submicroscópicos de Met Huntington se formavam nas células.

A demonstração visual deste método é crítica, pois a etapa de análise de dados é difícil de aprender porque é tecnicamente complexa Demonstrando os procedimentos experimentais. As etapas um a três serão Yasmin Ranson, assistente de pesquisa de nosso laboratório, demonstrando a análise dos dados. O quarto passo será Sevki GaN, um estudante de pós-graduação de nosso laboratório Usando métodos padrão de cultura de células para sua linha celular de interesse e uma lâmina de imagem de células vivas pronta para transfecção.

Prepare uma cultura de células de adesão transfect seu plasmídeo contendo o gene TC tag de interesse. De acordo com um método de transfecção de escolha, é importante ter controles positivos e negativos para avaliar a extensão da ligação específica às tags TC, bem como para avaliar o fluxo de fluência de alvejante entre os canais durante a coleta de micrografias confocais. Portanto, para duas cores, certifique-se de que as amostras sejam preparadas para cores únicas, seja a proteína fluorescente sozinha e, se possível, uma proteína T ctech ligada à carne ou vs.

Mas sem uma proteína fluorescente. Um a dois dias após a transfecção, enxágue suavemente as células com 300 microlitros de solução salina de equilíbrio de Hank pré-guerra ou HBSS, prepare HBSS pré-aquecido fresco com 10 micromolares, um, dois, et Ethan dia tiol ou EDT e um flash micromolar ou cinza. E depois de remover o HBSS das células, substitua suavemente por 300 microlitros do meio de cinzas incube por exatamente 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos.

Em nossa experiência, tempos de incubação mais longos aumentam significativamente a fluorescência de fundo. Aspire suavemente a solução de marcação das células e substitua-a por 300 microlitros de HBSS pré-aquecido com 250 micromolares, dois dímeros de três, cap propanol ou BAL por 15 minutos a 37 graus Celsius. Remova a solução de lavagem por aspiração suave e substitua-a por 300 microlitros de HBSS pré-aquecido.

Após essa lavagem, as células podem ser fixadas com a altura da paraforma, embora tenhamos descoberto que isso aumenta a fluorescência cínica não específica. Portanto, geralmente imaginamos que as células vivem à temperatura ambiente. Além disso, a fixação das células antes da marcação evita a ligação do corante bial.

Para iniciar a imagem das células no microscópio confocal, configure parâmetros para obter imagens dos fluoróforos individuais e certifique-se de que haja um sangramento insignificante entre os canais. Em seguida, ajuste as configurações do multiplicador de fotos para que a fluorescência máxima na amostra não sature o detector. Uma vez determinadas as melhores configurações de imagem, não altere nenhuma delas entre as amostras.

Use uma taxa de varredura de 200 hertz, colete médias de quatro linhas e defina o diâmetro do orifício para uma unidade de área. O diâmetro do orifício pode ser expandido se o sinal para o ruído for um problema. No entanto, isso pode resultar em alguma perda de resolução da imagem.

Colete as imagens confocais em um formato de 12 bits ou superior, se possível. Maximizar a qualidade da análise quantitativa de dados. Colete imagens para o canal de proteína fluorescente e também para o canal de matriz do arsenal BI para todas as amostras.

Para analisar os dados, use o software Image J com os seguintes plug-ins. Se estiver usando uma versão da Imagem J anterior à versão 1.32 C, clique nas seguintes opções. Para permitir que várias imagens sejam abertas ao mesmo tempo, edite as opções de entrada de saída de barra, clique na caixa para usar o seletor de arquivos j para abrir o compartilhamento de barra.

Clique em OK. Abra as imagens de interesse. A imagem J definirá automaticamente as intensidades máxima e mínima de pixel que são exibidas na tela para cada imagem separadamente, porque imagens diferentes terão intensidades de pixel diferentes.

Isso significa que as imagens exibidas não são comparáveis como visualizadas. Para garantir que as imagens abertas estejam todas na mesma escala, defina fisicamente as intensidades de pixel superior e inferior a serem visualizadas. Para definir esses valores, escolha a imagem, ajuste o brilho, o contraste.

Clique em definir, defina os valores mínimo e máximo exibidos. Em seguida, escolha propagar para todas as imagens abertas e clique em OK. Como alternativa, coloque todas as imagens de um canal específico juntas em um único arquivo ou pilha.

A imagem J ajustará automaticamente todas as imagens para a mesma escala. Para fazer isso, escolha pilhas de imagens, imagens para empilhar, insira um nome comum a cada arquivo e escolha os títulos usados como rótulos. Clique em OK.

Converta todas as imagens abertas em oito bits para análise. Ao escolher o tipo de imagem de oito bits, isso redimensionará o intervalo visualizado em um intervalo de zero a 255. É importante não salvar no formato original de 12 bits ou superior, pois isso perderá o conteúdo da informação.

Salve uma cópia em uma nova pasta chamada oito bits convertida usando a opção salvar como. Um método para examinar a extensão da ligação de matriz bi arsal em uma imagem inteira é realizar um gráfico de correlação de intensidade de pixel. Este gráfico é cada valor de pixel em um canal em relação ao valor de pixel correspondente em um segundo canal.

Portanto, uma posição de pixel alta na fluorescência GFP também será alta na fluorescência de cinzas se houver alta ligação. Para analisar a correlação de pixels, certifique-se de que as imagens REA e GFP de oito bits estejam abertas na imagem J.Em seguida, abra o plug-in do correlacionador de imagens escolhendo o correlacionador de imagens dos plug-ins. Atribua os arquivos de imagem à imagem um e à imagem dois.

Em seguida, clique em OK. A pilha resultante pode não exibir nenhuma informação detalhada. Isso é normal.

Salve a pilha em uma nova pasta chamada gráficos de dispersão e dê a ela o mesmo nome de arquivo que a amostra a que ela se refere. Por exemplo, gráfico de correlação de GFP de cinzas. Para visualizar os dados, escolha uma das duas opções.

Primeiro, transforme os dados para que sejam um formato de log escolhendo process math log auto. Em seguida, para redimensionar visualmente os dados, clique em imagem, ajuste, brilho, barra, contraste e selecione automático. Em segundo lugar, redimensione os dados visualmente para mostrar apenas valores baixos e exiba os dados usando uma tabela de pesquisa especial ou LUT para criar uma LUT personalizada.

Clique em LUT de edição de cor da imagem para um LUT muito simples. Clique no pixel superior esquerdo e escolha a cor preta. Em seguida, selecione o próximo pixel à direita e escolha a cor vermelha.

Em seguida, clique no terceiro pixel e, enquanto segura o botão do mouse, arraste a seleção para o pixel inferior direito. Selecione a cor vermelha, clique em OK e, em seguida, selecione a cor branca e clique em OK. Selecione a faixa de contraste da barra de brilho de zero a 255, conforme descrito anteriormente, para bloquear a imagem na mostrada na tela.

Converta-o para o formato RGB para copiar e colar imagens em outros programas. Primeiro, abra as imagens de oito bits ou 16 bits, conforme descrito anteriormente. Atribua um esquema de cores LUT às imagens para GFP.

Atribua o LUT verde clicando na imagem. Procure tabelas verdes. Por fim, selecione a imagem a ser copiada e copie-a para a área de transferência Ao escolher editar cópia para o sistema, esta figura mostra um resultado típico para a meia quinase fundida, o GFP e uma tag TC que foi manchada por 30 minutos.

Com cinzas em células HEC 2 9 3, parece que a ASH se liga eficientemente à proteína alvo que carrega uma etiqueta TC com alta afinidade. Em contraste, esta figura mostra a amostra de controle correspondente de SARK fundido à GFP, mas sem a etiqueta TC, que é essencial para verificar a especificidade da etiqueta TC e o nível de coloração de fundo. Este resultado mostra que o RH não tem reatividade com a proteína alvo, sem a tag TC, o que indica a especificidade da tag TC para ligação SSH.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não permitir que as células sejam confluentes e calmas, pois isso afetará a ligação do V nas células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como simplesmente analisar seus dados quantitativamente e pode refinar esses métodos para desenvolver seu próprio IUTS exclusivo para visualização de dados.