Name: GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a técnica de patch-clamp para registrar correntes de canal único ativadas por GABA em fatias de hipocampo de rato. Este método diferencia canais sinápticos e extrasinápticos GABAA.

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Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa sueco, Universidade Uppsala e Fredrik e Thurings Ingrid Foundation. ZJ realizou um pós-doutorado da EXODIAB e Sällskapet Svenska för Medicinsk Forskning. Agradecemos a Frank Lee para a assistência técnica.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A corrente de célula inteira representa o conjunto das correntes geradas por canais ativos na célula. A farmacologia específica e permeabilidade dos canais de cloreto de GABAA torna possível identificar correntes associadas a estes canais. A natureza transitória da ativação dos canais sinápticos ea ativação tônica dos canais extrasynaptic permite a diferenciação fácil entre essas duas populações de canais GABAA expressos em um neurônio. No entanto, apenas com um único canal gravações se pode estudar as propriedades cinéticas das moléculas canal que geram as correntes tônica. Ao contrário dos canais sinápticos que ativam dentro de 100 mS, os canais tônica GABAA são ativados com uma latência na faixa de minutos a partir do momento GABA é aplicada 4,7,15,16,17,18. Esta ativação retardada dos resultados canais em que as propriedades do canal que muitos não podem ser estudados usando células inteiras gravações. No nível de canal único os diferentes sub-populações de canais GABAA podem ser identificados com base em diferentes propriedades funcionais e farmacológicos. Assim, tomando uma vantagem de que as diferentes configurações de patch-clamp tem a oferecer, é possível estudar em detalhe a função molecular e farmacologia dos canais GABA-ativada que gera as correntes tônico e sináptica nos neurônios.

Hardware patch-clamp e vários sistemas de software estão disponíveis e todos eles funcionam utilizando os mesmos princípios básicos. Em nosso laboratório usamos os amplificadores Axoclamp eo software PClamp (dispositivos Molecular, EUA) para registrar e analisar nossos experimentos. Outra marca popular é amplificadores Heka e software (Heka Elektronik, Alemanha) Microforge: Narishige MF-830 (Japão); Vibrotome: por exemplo, Leica VT1200S (Alemanha) ou Campden Instruments vibrotome (UK); Microscópio: Nikon Eclipse E600FN; Banho-maria; micromanipuladores: feitos e micromanipuladores Narishige (Japão); Puller: DMZ- universal (Alemanha) ou Narishige PC-10 (Japão). Eletrodo de vidro: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).

gaba-activated correntes canal único e tonic em fatias de cérebro de rato

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

O GABA A canais estão presentes em todos os neurônios e estão localizados tanto nas sinapses e fora de sinapses onde geram correntes fásicas e tônicas, respectivamente 4,5,6,7 O GABA Um canal é um canal de cloreto de pentamérica GABA-gated. As subunidades do canal são agrupados em oito famílias (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π e ρ). Dois alphas, dois betas e um subunidade 3 º formam o canal funcional 8. Ao combinar estudos de sub-tipo específico GABA-activated canal único moléculas com estudos incluindo populações de todos os canais GABA A no neurônio torna-se possível entender o mecanismo básico de inibição neuronal e como ela é modulada por agentes farmacológicos. Usamos a técnica patch-clamp 9,10 para estudar as propriedades funcionais dos canais GABA A em neurônios vivos em fatias de cérebro do hipocampo e gravar o canal único e todo-cell correntes. Nós ainda examinar como os canais são afetados por diferentes concentrações de GABA, outras drogas e os fatores intra e extracelulares. Para obter uma descrição teórica e prática detalhada do método de patch-clamp consulte A Single-Channel Recordings editado por B Sakman Neher e E 10.

Usamos a técnica patch-clamp para medir GABA-activated single-channel correntes (GABAA canais, receptores GABAA) e as correntes sinápticas e tônico que eles geram em neurônios. Ativação dos canais diminui a excitabilidade neuronal na saúde e na doença<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato

Os canais GABA$_A$ estão presentes em todos os neurônios e localizam-se tanto em sinapses quanto fora de sinapses, onde geram correntes fásicas e tônicas, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é registrar correntes ativadas por GABA geradas por moléculas individuais, a corrente de canal único, e por populações específicas de canais localizadas em sinapses ou fora das sinapses. Isso é conseguido primeiramente preparando fatias de cérebro de rato hipocampal e fabricando pipetas a serem usadas para o registro em configuração de patch. Como segundo passo, uma pipeta é fixada à membrana neuronal.Após a formação de um selo gigaseal, obtém-se a configuração de patch clamp acoplado à célula. Em seguida, aplique sucção à pipeta. Assim que houver a ruptura no interior da célula, estabelece-se a configuração de patch clamp de célula inteira.Obtêm-se resultados que diferenciam os canais GABAA sinápticos dos extra-sinápticos. A principal vantagem da técnica de grampo de membrana em configuração de lâmina (pet clamp) em comparação com métodos existentes, como a técnica de liberação (emit), é que ela permite estudar as propriedades funcionais dos canais. O método de grampo de membrana pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, como o que determina a excitabilidade dos neurônios e como ela é modulada e ajustada com precisão.As implicações dessa tecnologia estendem-se à terapia e ao diagnóstico de muitas doenças, pois cada célula viva depende do correto funcionamento do canal iônico para a sobrevivência e para a função celular especializada. O procedimento será demonstrado por giant, pesquisador pós-doutorando no laboratório, e young yin, estudante de pós-graduação no laboratório. Para iniciar este procedimento, sacrifique uma rata Wistar pós-natal com 16 a 22 dias de idade por decapitação e remova rapidamente o cérebro com uma espátula. Corte o cérebro ao longo da linha média com uma lâmina cirúrgica.Em seguida, coloque cada hemisfério sobre um papel filtro Watman com a superfície cortada voltada para o papel. Coloque uma gota de cola supercola no disco de espécime e posicione o hemisfério sobre ele com a superfície cortada voltada para baixo. Em seguida, coloque o disco de espécime na câmara de corte do vibrátomo que está preenchida com gelo frio.Uma LCR. Ajuste a espessura do corte para 400 micrômetros e comece a cortar o cérebro. Corte cerca de dois milímetros de tecido cerebral até atingir o hipocampo.Em seguida, coloque as fatias do hipocampo em uma placa de Petri de vidro preenchida com um LCR. A placa é colocada sobre um fundo preto para permitir a fácil visualização do hipocampo. O próximo passo é isolar o hipocampo do tecido circundante utilizando uma lâmina cirúrgica afiada.Tenha cuidado para não empurrar nem puxar o tecido após isso. Incube as fatias e a solução A CSF a 37 graus Celsius por uma hora e, em seguida, mantenha-as à temperatura ambiente até que os experimentos sejam concluídos. Capilares de vidro borossilicato são usados para as pipetas de patch.Puxe as pipetas de grampo com um puxador de pipetas automático ou manual, obtendo uma resistência de dois a quatro megaohms para gravações de célula inteira ou de oito a 20 megaohms para gravações de canal único. Polir a pipeta com o mesmo vidro borossilicato para gravação de canal único. Usando uma micro-fornalha, funda o vidro borossilicato sobre o fio de platina para tornar a ponta mais lisa.Polir as pipetas dessa maneira cria pipetas que formam selos mais estáveis e com maior resistência em comparação com pipetas polidas pelo calor de um fio não revestido ou por uma etapa de polimento no puxador automatizado. O equipamento de patch clamp consiste em um microscópio sobre uma mesa flutuante e inserido em uma gaiola de Faraday, um amplificador, um digitalizador e um computador. Juntos, esses equipamentos são frequentemente chamados de sistema de patch clamp.Agora insira uma pipeta no suporte de pipeta e aperte a tampa para fixar a pipeta. O P clamp é utilizado como o software de grampo de membrana. Configure o amplificador OC clamp 200 B para grampo de voltagem, ganho de dois, filtro de dois quilohertz e potencial de retenção em zero milivolts; para criar pressão positiva na pipeta, sopre ar no bocal conectado ao tubo que se liga ao suporte de pipeta.Em seguida, feche a válvula entre o bocal e o tubo. Certifique-se de que não haja vazamento de ar. Depois, abaixe a pipeta na solução do banho.Na tela do computador onde a resistência da pipeta é medida, você verá um pulso gerado por uma série de pulsos de cinco milivolts e um número que indica a resistência da pipeta. Números menores representam aberturas maiores na ponta da pipeta e pipetas maiores. Ajuste o offset da pipeta no amplificador para zero.Utilize uma ampliação de 10x no microscópio para identificar a região, ou uma ampliação de 60x. Para identificar um neurônio parametal que você irá carregar nos cortes do hipocampo, as células granulares do giro denteado, a região do corpo celular da célula parametal do CA1 e a região do corpo celular da célula parametal do CA3 aparecem cada uma como uma faixa brilhante. Coloque a pipeta em foco para que você possa ver tanto a região ou célula quanto a pipeta.Ao observar pelas oculares do microscópio, posicione a pipeta acima do centro da região utilizando o ajuste do manipulador de movimento grosseiro e abaixe a pipeta até que ela esteja logo acima, mas tocando o tecido. Nesse momento, abaixe suavemente a pipeta sobre o centro da célula ou região utilizando os ajustes de movimento fino do manipulador. Ao mesmo tempo, observe a tela do computador para acompanhar a resistência da pipeta.Continue abaixando a pipeta até que a resistência da pipeta aumente. Libere a pressão positiva da pipeta abrindo a válvula. Isso cria uma sucção suave e forma automaticamente o selo gigaseal.Se o selo giga não for formado, aplique sucção ao bocal onde anteriormente você aplicou pressão positiva. Agora você obteve a chamada configuração de grampo de patch em célula ligada. Ajuste a compensação rápida e lenta da capacitância para cancelar o transitório proveniente da pipeta e do suporte da pipeta.Na tela do computador, você verá um traçado de corrente plano. Quanto maior for o valor de GigE, melhor será a relação sinal-ruído nas gravações de canal único para registrar correntes de canal único com uma configuração de patch clamp acoplada à célula. Ajuste o ganho para 500 e a taxa de amostragem de dados para não menos que 100 microssegundos.Em seguida, registre as correntes. Mantenha o volume da solução de banho baixo, de modo que cubra apenas o fragmento, para minimizar o ruído nos registros durante a realização do registro em célula inteira. Altere o potencial do eletrodo para menos 60 milivolts ou próximo ao potencial de repouso da membrana.Na configuração de célula ligada, aplique sucção à pipeta por meio do tubo conectado ao suporte da pipeta. Ao mesmo tempo, observe as alterações na resistência e no transiente de capacitância na tela do computador. Assim que você penetrar na célula.Quando isso acontece, você está na chamada configuração de célula inteira ou modo de célula inteira. Deixe a solução da pipeta equilibrar com o interior da célula por cinco a dez minutos. Enquanto isso, acompanhe o valor da resistência em série.A corrente é conduzida pelas populações de canais abertos na membrana celular. Para demonstrar canais individuais ativados pelo GABA, o GABA é adicionado à solução do pipeta, já que não consegue atravessar a membrana celular. Aqui são mostradas as correntes de canais individuais ativadas por uma concentração de 20 nanomolares de GABA em um registro do tipo "célula ligada" sobre um neurônio granular do giro denteado.O patch foi despolarizado em 40 milivolts. A condutância máxima do canal foi de 44 pS e sua latência de ativação foi de 2,63 minutos. Aqui está um exemplo de como diferenciar as correntes gaba, sinápticas e extrasinápticas pela natureza fásica e tônica das correntes.A corrente através de populações de canais foi registrada de neurônios hipocampais de rato utilizando o método de fixação de voltagem em célula inteira para identificar correntes tônicas e fásicas. 100 micromolar do antagonista gabaa SR 9 55 31 foi aplicado a um neurônio do giro denteado conforme indicado em BA e a um neurônio tratado com insulina em ca. Um neurônio parametal conforme indicado em BB. O SR 9 55 31 bloqueou os canais extrasinápticos e induziu uma alteração na corrente de base, o que revelou a corrente tônica.Uma vez dominada, a obtenção de um selo em célula aderida e, em seguida, a perfuração da célula para estabelecer um selo de célula inteira pode ser realizada em até dois minutos. Após este procedimento, pode-se realizar o selamento em outros tecidos, como ilhotas pancreáticas intactas, ou em células isoladas, como linfócitos ou células em cultura.

gaba-activated-single-channel-and-tonic-currents-in-rat-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

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Registrando correntes de células inteiras com GABA Puffing em uma fatia de cérebro de camundongo

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Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

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Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

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Aqui, apresentamos os protocolos para descobrir compostos ativos nos receptores GABAA , partir de ligação para a fisiologia e farmacologia.

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