A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

A microscopia de força atômica ou AFM utiliza a sondagem mecânica de uma superfície para gerar imagens de alta resolução sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. Neste vídeo, bactérias são imobilizadas sobre mica recoberta com gelatina e visualizadas em um ambiente líquido por AFM. Primeiro, quadrados de mica são cortados para se adaptarem à plataforma do microscópio de AFM. A camada superior da mica é removida e os quadrados de mica são recobertos com gelatina.

Em seguida, uma gota de suspensão bacteriana é colocada sobre a mica revestida com gelatina e espalhada. Usando a ponta de uma pipeta, as amostras são incubadas por 10 minutos. Então, as bactérias não ligadas são removidas pela lavagem da superfície.

A amostra é colocada na célula úmida de MFA e imageada para obter imagens de alta resolução de bactérias vivas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imobilização em filtro poroso ISO, é que bactérias com formato de bastonete e esféricas podem ser imobilizadas de forma confiável. Além disso, uma porcentagem maior da superfície celular está acessível à sonda de MFA.

Uma vantagem fundamental da microscopia de força atômica em comparação com outras microscopias é que estudos em células individuais podem ser realizados, permitindo investigações sobre a morfologia celular, formação de septo e citocinese. Indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque tendem a usar gelatina que não comprovadamente imobiliza bactérias ou utilizam bactérias cultivadas em meio complexo, cujos componentes competirão com a adesão das bactérias à superfície de gelatina. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método a partir de experimentos realizados na década de 1970, nos quais bactérias foram imobilizadas.

Lâminas de vidro revestidas com gelatina para experimentos utilizando microscopia óptica e auto-radiografia. Nesta demonstração, bactérias vivas gram-negativas são imobilizadas para uma imagem de MF, mas o método também é aplicável a bactérias gram-positivas. Para preparar a MICA, comece cortando-a com tesoura para ajustá-la à platina do microscópio de MF e acomodar a célula úmida de MF.

Em seguida, coloque fita adesiva sobre a superfície da MICA e remova-a para destacar a camada externa da MICA do pedaço cortado. Continue removendo a camada externa de ambos os lados até que apenas camadas lisas e intactas permaneçam. Para preparar a solução de gelatina, adicione 100 mililitros de água destilada a um frasco de laboratório e aqueça-o em um forno de micro-ondas.

Quando a água começar a ferver, retire-a do micro-ondas, adicione 0,5 gramas de gelatina e agite suavemente o frasco até que a gelatina se dissolva. Observe que gelatinas bovinas não funcionam bem para este procedimento. Recomendam-se gelatinas suínas.

Coloque o frasco sobre a bancada e deixe esfriar até 60 a 70 graus Celsius. Em seguida, despeje uma quantidade suficiente da solução de gelatina em um béquer pequeno para garantir que a MICA possa ser submersa completamente com o auxílio de pinça. Mergulhe um quadrado de MICA na solução morna de gelatina e retire-o imediatamente.

Coloque a MICA na borda, apoiada em uma toalha de papel contra um suporte de centrífuga microtubos, para secar ao ar ambiente durante a noite. A MICA revestida com gelatina pode ser utilizada por pelo menos duas semanas. Caso a MICA revestida com gelatina não seja usada nas próximas duas semanas.

Coloque sobre papel filtro em uma placa de Petri tampada e armazene em temperatura ambiente. A solução excedente de gelatina pode ser mantida sob refrigeração e utilizada por aproximadamente um mês, bastando reaquecer a solução estoque a uma temperatura entre 60 e 70 graus Celsius. É necessário ter cuidado para garantir que a gelatina não entre em ebulição durante o reaquecimento.

Antes de montar as bactérias em MICA revestida com gelatina, certifique-se de que a concentração bacteriana seja adequada. Utilize um espectrofotômetro para obter a leitura de densidade óptica da amostra bacteriana em 600 nanômetros. Uma DO entre 0,5 e 1 é ideal.

Em seguida, transfira um mililitro da cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugue para formar o pellet após a centrifugação. Utilize uma pipeta para remover o sobrenadante, depois lave o pellet com um mililitro de água desionizada filtrada ou tampão. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender.

Suspenda o pellet, centrifugue o seu ganho e ressuspenda imediatamente o pellet em 500 microlitros de água desionizada nano pura. A suspensão bacteriana deve apresentar aparência turva à vista para garantir uma concentração adequada de células. Para uma imagem de MF.

Se a choque osmótico for uma preocupação, pode-se adicionar sacarose 0,25 molar à solução de imagem. Eu re-suspendi esta bactéria em água, mas não tenha receio de experimentar outros líquidos. Por exemplo, já realizamos este procedimento com sacarose a 0,25%, portanto, teste outros líquidos e veja se eles também funcionam.

Prepare dois lâminas para cada amostra. Usando uma micropipeta, adicione de 10 a 20 microlitros de suspensão celular à superfície revestida com gelatina. Em seguida, para obter uma área de cobertura adequada para a microscopia de FM, use a ponteira de micropipeta para espalhar a gota nas direções X e Y.

Tomando cuidado para não tocar fisicamente a superfície da gelatina com a ponteira da pipeta, incube a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave com um fluxo de água, removendo o líquido em excesso ao tocar a borda da amostra em uma toalha de papel ou papel de filtro. Seque rapidamente uma das lâminas usando um jato de gás nitrogênio.

Em seguida, inspecione visualmente a lâmina. Uma mancha opaca indica que as bactérias não foram removidas na etapa de lavagem. A outra lâmina, que agora será usada para imageamento, não deve ser deixada secar.

Coloque-o no estágio úmido A FM e fixe-o usando os clipes; com uma pipeta microliterada, adicione água ao estágio úmido. É recomendável preparar o microscópio de força atômica antes da imagem em líquido. Certifique-se de que a alavanca para imageamento em líquido esteja colocada no A FM e alinhada com o laser.

Prossiga com a imagem por microscopia de força atômica utilizando um microscópio de força atômica pico plus, equipado com uma cabeça de varredura de 100 mícrons e sondas de nitreto de silício vico com constantes elásticas nominais variando de 0,01 a 0,1 nano newton por nanômetro. Uma vez que o microscópio estiver preparado, insira o scanner FM e o estágio no microscópio. Normalmente, iniciamos com velocidade de varredura de 0,5 linhas por segundo até uma linha por segundo, e a resolução é definida entre 128 pontos de dados por linha até 512.

Configure o instrumento para coletar imagens usando de 128 a 512 pixels por linha. Faça a varredura em uma velocidade de 0,5 a uma linha por segundo. Em seguida, se necessário, ajuste o ponto de ajuste e os ganhos no modo FM-A para obter imagens ideais.

Por fim, colete as imagens. As bactérias E coli foram montadas sobre MICA revestida com gelatina conforme descrito neste vídeo e, em seguida, imagens foram obtidas em PVS 0,005 molar. Utilizando este método.

Scepter são claramente visíveis na imagem coletada e as superfícies celulares são lisas, não apresentando sinais de desidratação. Em comparação, imagens obtidas do mesmo E. coli no ar, como mostrado aqui, frequentemente revelam estruturas não vistas em meio líquido. Neste caso, as células apresentam uma aparência anelar devido à desidratação, e apêndices bacterianos, como FIA, podem ser observados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras bacterianas para uma imagem de MF em um ambiente líquido. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente uma hora, caso as microsuperfícies recobertas com gelatina já tenham sido previamente preparadas. Ao tentar este procedimento, é importante escolher a gelatina correta e ter uma concentração apropriada de bactérias seguindo este protocolo.

Outras medições, como o uso do cantilever de FN como uma ferramenta de detecção de força para obter medições de força em superfícies bacterianas, podem ser realizadas. Além disso, moléculas de sonda específicas podem ser ligadas à ponta de MF-A para interagir com alvos específicos na superfície bacteriana, a fim de identificar e medir forças de interação. Geralmente, não se esqueça de que, se você estiver trabalhando com bactérias patogênicas, precauções sempre devem ser tomadas ao utilizar este método.