Name: A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a imobilizar bactérias Gram-negativas e Gram-positivas em mica revestida com gelatina para microscopia de força atômica em ambiente líquido. Este método permite obter imagens de alta resolução de células vivas.

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Esta pesquisa é patrocinada pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental, Departamento de Energia dos EUA e por subvenções do Conselho de Pesquisa em Saúde da Virginia Commonwealth. Oak Ridge National Laboratory é gerenciado por UT-Battelle, LLC, para o Departamento de Energia dos EUA sob o n º do contrato DE-AC05-00OR22725.

1. Preparação Mica: <ol><li> Corte a mica (Ciências Microscopia Eletrônica) com uma tesoura para o tamanho necessário para caber o microscópio AFM (cerca de 22 × 30 mm). </li><li> Cleave a mica em ambos os lados, geralmente usando a fita para remover a camada externa, até que apenas suaves camadas ininterrupta permanecem. </li></ol> 2. Preparação da solução de gelatina: <ol><li> Adicione 100 ml de água destilada para um frasco de laboratório. </li><li> Aqueça a garrafa em um forno de microondas até que a água começa a ferver. (Se um microondas não está disponível, a água pode ser aquecido em um copo sobre uma chapa quente.) </li><li> Pesar 0,5 gramas de gelatina (Sigma G-6144, G-2625-2500 ou G) e adicione à água quente destilada. </li><li> Agite suavemente o frasco até que a gelatina esteja completamente dissolvido. </li><li> Arrefecer a solução de gelatina a 60-70 ° C. </li><li> Despeje aproximadamente 15 mL para um copo pequeno (20 mL) em que a mica clivada corte podem ser mergulhados. </li></ol> 3. Mica revestimento: <ol><li> Submergir as praças mica na solução aquecida gelatina e retirar rapidamente de modo que a mica é revestido (Fig. 1a). </li><li> Após o revestimento, o apoio da mica imediatamente, no limite, sobre um papel toalha para secar no ar ambiente (Figura 1b). A mica revestidas de gelatina pode ser usada por pelo menos duas semanas. O excesso de solução de gelatina pode ser mantido refrigerado e usado por aproximadamente um mês, basta aquecer a solução de ações para entre 60-70 ° C. Cuidados devem ser tomados para assegurar que a gelatina não é fervida durante o aquecimento. </li></ol> 4. Montagem de bactérias em mica revestidas de gelatina: <ol><li> Pellet 1 mL de uma cultura bacteriana (0,5-1,0 OD a 600 nm) em 800 a 4500 rcf. Dependendo da bactéria, use o mínimo rcf que irá agregar as células em ~ 5 minutos. </li><li> Lavar o sedimento em um mesmo volume de água filtrada ou deionizada buffer. </li><li> Coletar as células por centrifugação novamente. </li><li> Ressuspender o sedimento em 500 mL de imediato de água deionizada NanoPure ou buffer. (A suspensão bacteriana deve ser visivelmente turva, a fim de ter uma concentração adequada de células para AFM). </li><li> Aplicar a suspensão de células (10-20 mL) para a mica revestidas de gelatina e espalhe sobre a superfície usando uma ponteira de pipeta (Fig. 1c). Cuidados devem ser tomados para não tocar fisicamente a superfície da gelatina com a ponta da pipeta enquanto aplica ou espalhar a solução bacteriana. </li><li> Permitir que a superfície em repouso por 10 minutos e enxágüe com um fluxo de água ou tampão (Fig. cd 1). Durante todo o procedimento, tome cuidado para assegurar que a amostra não é permitida para secar. </li></ol> 5. Resultados representativos: A Figura 2 mostra imagens de exemplo de células bacterianas que foram montadas em gelatina-revestido mica e fotografada pela AFM. Em nossos laboratórios, amostras são tipicamente fotografada usando um microscópio de força atômica PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) equipado com uma cabeça de digitalização 100 mm. O instrumento é operado em 128-512 pixels por linha de varredura a uma velocidade de varredura de linhas de 0,5-1,0 / s. As vigas que são normalmente utilizados são sondas Veeco nitreto de silício (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) com constantes primavera nominal variando ,01-0,1 nN / nm. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gelatina a uma temperatura de 60-70 ° C é colocado em um copo de 20 ml. Usando um par de pinças recém clivada quadrados de mica são totalmente imerso na gelatina (a) retirada e colocada na vertical sobre uma toalha de papel encostado a um rack de micro centrífuga (b). Uma gota de amostra bacteriana é colocada sobre a mica e espalhar com a ponta da pipeta em ambas as direções X e Y (c). Depois de permitir que a amostra para incubar na superfície mica de pelo menos 10 minutos, lavar a amostra em um fluxo de água destilada. Se a imobilização trabalhou você será capaz de ver uma mancha opaca na mica, como mostrado no painel direito de (d). Se a imobilização não trabalho que você vai pegar um pedaço de mica clara como no painel esquerdo. A mancha opaca na balança mica para a concentração das bactérias na gota que você coloque na mica gelatina tratada. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Imagens figura 2. AFM da E. coli. No painel (a), as células são montadas em gelatina-mica revestidas e fotografada em 0,005 M PBS. Para efeito de comparação, uma imagem de células bacterianas montados em gelatina-mica e revestido com imagens no ar é mostrado no painel (b). Embora septos são claramente visíveis em imagens coletadas no estado líquido, maior a resolução, como indicado pela presença de pili (painel inset (b)), podem ser obtidas no ar.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vários fatores podem afetar célula microbiana de montagem e de imagem por AFM. A gelatina que é usado para o revestimento da mica é importante. Comercial de gelatina é isolado a partir de um número de vertebrados, incluindo peixes, vacas e porcos. Tanto a origem eo método de processamento de determinar a adequação da gelatina para imobilização de bactérias. Várias fontes e tipos de gelatina foram avaliados quanto à sua eficácia em bactérias imobilizar [1]. As duas gelatinas mais eficazes foram encontrados para ser Sigma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> G6144, G2625 ou G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus Microscópio de Força Atômica </td><td> Agilent Technologies, Tempe, AZ </td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers AFM </td><td> Veeco, Santa Barbara, CA </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

a imobilização de bactérias for imaging por microscopia de força atômica

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM é um de alta resolução (escala nm) ferramenta de imagem que mecanicamente um sondas de superfície. Ele tem a capacidade de células e biomoléculas imagem, em um ambiente líquido, sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. A fim de atingir esse objetivo, a amostra deve suficientemente aderir à superfície de montagem para evitar a remoção por forças exercidas pela ponta cantilever digitalização AFM. Em muitos casos, a imagem de sucesso depende de imobilização da amostra à superfície de montagem. Idealmente, a imobilização deve ser minimamente invasivo para a amostra de tal forma que os processos metabólicos e atributos funcionais não sejam comprometidas. Por superfícies de revestimento recém clivada com mica suína (porco) gelatina, bactérias carga negativa pode ser imobilizada na superfície e fotografada em líquido por AFM. Imobilização de células bacterianas em gelatina-mica revestida é mais provável devido à interação eletrostática entre as bactérias com carga negativa e positivamente carregada a gelatina. Vários fatores podem interferir com a imobilização de bactérias, incluindo componentes químicos do líquido em que as bactérias estão suspensos, o tempo de incubação da bactéria na gelatina mica revestidas características, superfície da estirpe bacteriana e do meio em que as bactérias são gravadas. No geral, o uso de gelatina revestido mica é encontrado para ser geralmente aplicável para as células microbianas imagem.

Vivem as bactérias Gram-negativas e Gram-positivos podem ser imobilizadas em gelatina-mica revestidas com imagens e em líquido usando Microscopia de Força Atômica (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

O AFM é uma ferramenta de imageamento de alta resolução (escala nm) que sonda mecanicamente uma superfície. Ele possui a capacidade de realizar o imageamento de células e biomoléculas, em líquido...

A microscopia de força atômica ou AFM utiliza a sondagem mecânica de uma superfície para gerar imagens de alta resolução sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. Neste vídeo, bactérias são imobilizadas sobre mica recoberta com gelatina e visualizadas em um ambiente líquido por AFM. Primeiro, quadrados de mica são cortados para se adaptarem à plataforma do microscópio de AFM. A camada superior da mica é removida e os quadrados de mica são recobertos com gelatina.Em seguida, uma gota de suspensão bacteriana é colocada sobre a mica revestida com gelatina e espalhada. Usando a ponta de uma pipeta, as amostras são incubadas por 10 minutos. Então, as bactérias não ligadas são removidas pela lavagem da superfície.A amostra é colocada na célula úmida de MFA e imageada para obter imagens de alta resolução de bactérias vivas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imobilização em filtro poroso ISO, é que bactérias com formato de bastonete e esféricas podem ser imobilizadas de forma confiável. Além disso, uma porcentagem maior da superfície celular está acessível à sonda de MFA.Uma vantagem fundamental da microscopia de força atômica em comparaçã

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