Name: A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a imobilizar bactérias Gram-negativas e Gram-positivas em mica revestida com gelatina para microscopia de força atômica em ambiente líquido. Este método permite obter imagens de alta resolução de células vivas.

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Esta pesquisa é patrocinada pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental, Departamento de Energia dos EUA e por subvenções do Conselho de Pesquisa em Saúde da Virginia Commonwealth. Oak Ridge National Laboratory é gerenciado por UT-Battelle, LLC, para o Departamento de Energia dos EUA sob o n º do contrato DE-AC05-00OR22725.

1. Preparação Mica: <ol><li> Corte a mica (Ciências Microscopia Eletrônica) com uma tesoura para o tamanho necessário para caber o microscópio AFM (cerca de 22 × 30 mm). </li><li> Cleave a mica em ambos os lados, geralmente usando a fita para remover a camada externa, até que apenas suaves camadas ininterrupta permanecem. </li></ol> 2. Preparação da solução de gelatina: <ol><li> Adicione 100 ml de água destilada para um frasco de laboratório. </li><li> Aqueça a garrafa em um forno de microondas até que a água começa a ferver. (Se um microondas não está disponível, a água pode ser aquecido em um copo sobre uma chapa quente.) </li><li> Pesar 0,5 gramas de gelatina (Sigma G-6144, G-2625-2500 ou G) e adicione à água quente destilada. </li><li> Agite suavemente o frasco até que a gelatina esteja completamente dissolvido. </li><li> Arrefecer a solução de gelatina a 60-70 ° C. </li><li> Despeje aproximadamente 15 mL para um copo pequeno (20 mL) em que a mica clivada corte podem ser mergulhados. </li></ol> 3. Mica revestimento: <ol><li> Submergir as praças mica na solução aquecida gelatina e retirar rapidamente de modo que a mica é revestido (Fig. 1a). </li><li> Após o revestimento, o apoio da mica imediatamente, no limite, sobre um papel toalha para secar no ar ambiente (Figura 1b). A mica revestidas de gelatina pode ser usada por pelo menos duas semanas. O excesso de solução de gelatina pode ser mantido refrigerado e usado por aproximadamente um mês, basta aquecer a solução de ações para entre 60-70 ° C. Cuidados devem ser tomados para assegurar que a gelatina não é fervida durante o aquecimento. </li></ol> 4. Montagem de bactérias em mica revestidas de gelatina: <ol><li> Pellet 1 mL de uma cultura bacteriana (0,5-1,0 OD a 600 nm) em 800 a 4500 rcf. Dependendo da bactéria, use o mínimo rcf que irá agregar as células em ~ 5 minutos. </li><li> Lavar o sedimento em um mesmo volume de água filtrada ou deionizada buffer. </li><li> Coletar as células por centrifugação novamente. </li><li> Ressuspender o sedimento em 500 mL de imediato de água deionizada NanoPure ou buffer. (A suspensão bacteriana deve ser visivelmente turva, a fim de ter uma concentração adequada de células para AFM). </li><li> Aplicar a suspensão de células (10-20 mL) para a mica revestidas de gelatina e espalhe sobre a superfície usando uma ponteira de pipeta (Fig. 1c). Cuidados devem ser tomados para não tocar fisicamente a superfície da gelatina com a ponta da pipeta enquanto aplica ou espalhar a solução bacteriana. </li><li> Permitir que a superfície em repouso por 10 minutos e enxágüe com um fluxo de água ou tampão (Fig. cd 1). Durante todo o procedimento, tome cuidado para assegurar que a amostra não é permitida para secar. </li></ol> 5. Resultados representativos: A Figura 2 mostra imagens de exemplo de células bacterianas que foram montadas em gelatina-revestido mica e fotografada pela AFM. Em nossos laboratórios, amostras são tipicamente fotografada usando um microscópio de força atômica PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) equipado com uma cabeça de digitalização 100 mm. O instrumento é operado em 128-512 pixels por linha de varredura a uma velocidade de varredura de linhas de 0,5-1,0 / s. As vigas que são normalmente utilizados são sondas Veeco nitreto de silício (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) com constantes primavera nominal variando ,01-0,1 nN / nm. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gelatina a uma temperatura de 60-70 ° C é colocado em um copo de 20 ml. Usando um par de pinças recém clivada quadrados de mica são totalmente imerso na gelatina (a) retirada e colocada na vertical sobre uma toalha de papel encostado a um rack de micro centrífuga (b). Uma gota de amostra bacteriana é colocada sobre a mica e espalhar com a ponta da pipeta em ambas as direções X e Y (c). Depois de permitir que a amostra para incubar na superfície mica de pelo menos 10 minutos, lavar a amostra em um fluxo de água destilada. Se a imobilização trabalhou você será capaz de ver uma mancha opaca na mica, como mostrado no painel direito de (d). Se a imobilização não trabalho que você vai pegar um pedaço de mica clara como no painel esquerdo. A mancha opaca na balança mica para a concentração das bactérias na gota que você coloque na mica gelatina tratada. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Imagens figura 2. AFM da E. coli. No painel (a), as células são montadas em gelatina-mica revestidas e fotografada em 0,005 M PBS. Para efeito de comparação, uma imagem de células bacterianas montados em gelatina-mica e revestido com imagens no ar é mostrado no painel (b). Embora septos são claramente visíveis em imagens coletadas no estado líquido, maior a resolução, como indicado pela presença de pili (painel inset (b)), podem ser obtidas no ar.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vários fatores podem afetar célula microbiana de montagem e de imagem por AFM. A gelatina que é usado para o revestimento da mica é importante. Comercial de gelatina é isolado a partir de um número de vertebrados, incluindo peixes, vacas e porcos. Tanto a origem eo método de processamento de determinar a adequação da gelatina para imobilização de bactérias. Várias fontes e tipos de gelatina foram avaliados quanto à sua eficácia em bactérias imobilizar [1]. As duas gelatinas mais eficazes foram encontrados para ser Sigma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> G6144, G2625 ou G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus Microscópio de Força Atômica </td><td> Agilent Technologies, Tempe, AZ </td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers AFM </td><td> Veeco, Santa Barbara, CA </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

a imobilização de bactérias for imaging por microscopia de força atômica

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM é um de alta resolução (escala nm) ferramenta de imagem que mecanicamente um sondas de superfície. Ele tem a capacidade de células e biomoléculas imagem, em um ambiente líquido, sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. A fim de atingir esse objetivo, a amostra deve suficientemente aderir à superfície de montagem para evitar a remoção por forças exercidas pela ponta cantilever digitalização AFM. Em muitos casos, a imagem de sucesso depende de imobilização da amostra à superfície de montagem. Idealmente, a imobilização deve ser minimamente invasivo para a amostra de tal forma que os processos metabólicos e atributos funcionais não sejam comprometidas. Por superfícies de revestimento recém clivada com mica suína (porco) gelatina, bactérias carga negativa pode ser imobilizada na superfície e fotografada em líquido por AFM. Imobilização de células bacterianas em gelatina-mica revestida é mais provável devido à interação eletrostática entre as bactérias com carga negativa e positivamente carregada a gelatina. Vários fatores podem interferir com a imobilização de bactérias, incluindo componentes químicos do líquido em que as bactérias estão suspensos, o tempo de incubação da bactéria na gelatina mica revestidas características, superfície da estirpe bacteriana e do meio em que as bactérias são gravadas. No geral, o uso de gelatina revestido mica é encontrado para ser geralmente aplicável para as células microbianas imagem.

Vivem as bactérias Gram-negativas e Gram-positivos podem ser imobilizadas em gelatina-mica revestidas com imagens e em líquido usando Microscopia de Força Atômica (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

O AFM é uma ferramenta de imageamento de alta resolução (escala nm) que sonda mecanicamente uma superfície. Ele possui a capacidade de realizar o imageamento de células e biomoléculas, em líquido...

A microscopia de força atômica ou AFM utiliza a sondagem mecânica de uma superfície para gerar imagens de alta resolução sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. Neste vídeo, bactérias são imobilizadas sobre mica recoberta com gelatina e visualizadas em um ambiente líquido por AFM. Primeiro, quadrados de mica são cortados para se adaptarem à plataforma do microscópio de AFM. A camada superior da mica é removida e os quadrados de mica são recobertos com gelatina.Em seguida, uma gota de suspensão bacteriana é colocada sobre a mica revestida com gelatina e espalhada. Usando a ponta de uma pipeta, as amostras são incubadas por 10 minutos. Então, as bactérias não ligadas são removidas pela lavagem da superfície.A amostra é colocada na célula úmida de MFA e imageada para obter imagens de alta resolução de bactérias vivas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imobilização em filtro poroso ISO, é que bactérias com formato de bastonete e esféricas podem ser imobilizadas de forma confiável. Além disso, uma porcentagem maior da superfície celular está acessível à sonda de MFA.Uma vantagem fundamental da microscopia de força atômica em comparação com outras microscopias é que estudos em células individuais podem ser realizados, permitindo investigações sobre a morfologia celular, formação de septo e citocinese. Indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque tendem a usar gelatina que não comprovadamente imobiliza bactérias ou utilizam bactérias cultivadas em meio complexo, cujos componentes competirão com a adesão das bactérias à superfície de gelatina. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método a partir de experimentos realizados na década de 1970, nos quais bactérias foram imobilizadas.Lâminas de vidro revestidas com gelatina para experimentos utilizando microscopia óptica e auto-radiografia. Nesta demonstração, bactérias vivas gram-negativas são imobilizadas para uma imagem de MF, mas o método também é aplicável a bactérias gram-positivas. Para preparar a MICA, comece cortando-a com tesoura para ajustá-la à platina do microscópio de MF e acomodar a célula úmida de MF.Em seguida, coloque fita adesiva sobre a superfície da MICA e remova-a para destacar a camada externa da MICA do pedaço cortado. Continue removendo a camada externa de ambos os lados até que apenas camadas lisas e intactas permaneçam. Para preparar a solução de gelatina, adicione 100 mililitros de água destilada a um frasco de laboratório e aqueça-o em um forno de micro-ondas.Quando a água começar a ferver, retire-a do micro-ondas, adicione 0,5 gramas de gelatina e agite suavemente o frasco até que a gelatina se dissolva. Observe que gelatinas bovinas não funcionam bem para este procedimento. Recomendam-se gelatinas suínas.Coloque o frasco sobre a bancada e deixe esfriar até 60 a 70 graus Celsius. Em seguida, despeje uma quantidade suficiente da solução de gelatina em um béquer pequeno para garantir que a MICA possa ser submersa completamente com o auxílio de pinça. Mergulhe um quadrado de MICA na solução morna de gelatina e retire-o imediatamente.Coloque a MICA na borda, apoiada em uma toalha de papel contra um suporte de centrífuga microtubos, para secar ao ar ambiente durante a noite. A MICA revestida com gelatina pode ser utilizada por pelo menos duas semanas. Caso a MICA revestida com gelatina não seja usada nas próximas duas semanas.Coloque sobre papel filtro em uma placa de Petri tampada e armazene em temperatura ambiente. A solução excedente de gelatina pode ser mantida sob refrigeração e utilizada por aproximadamente um mês, bastando reaquecer a solução estoque a uma temperatura entre 60 e 70 graus Celsius. É necessário ter cuidado para garantir que a gelatina não entre em ebulição durante o reaquecimento.Antes de montar as bactérias em MICA revestida com gelatina, certifique-se de que a concentração bacteriana seja adequada. Utilize um espectrofotômetro para obter a leitura de densidade óptica da amostra bacteriana em 600 nanômetros. Uma DO entre 0,5 e 1 é ideal.Em seguida, transfira um mililitro da cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugue para formar o pellet após a centrifugação. Utilize uma pipeta para remover o sobrenadante, depois lave o pellet com um mililitro de água desionizada filtrada ou tampão. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender.Suspenda o pellet, centrifugue o seu ganho e ressuspenda imediatamente o pellet em 500 microlitros de água desionizada nano pura. A suspensão bacteriana deve apresentar aparência turva à vista para garantir uma concentração adequada de células. Para uma imagem de MF.Se a choque osmótico for uma preocupação, pode-se adicionar sacarose 0,25 molar à solução de imagem. Eu re-suspendi esta bactéria em água, mas não tenha receio de experimentar outros líquidos. Por exemplo, já realizamos este procedimento com sacarose a 0,25%, portanto, teste outros líquidos e veja se eles também funcionam.Prepare dois lâminas para cada amostra. Usando uma micropipeta, adicione de 10 a 20 microlitros de suspensão celular à superfície revestida com gelatina. Em seguida, para obter uma área de cobertura adequada para a microscopia de FM, use a ponteira de micropipeta para espalhar a gota nas direções X e Y.Tomando cuidado para não tocar fisicamente a superfície da gelatina com a ponteira da pipeta, incube a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave com um fluxo de água, removendo o líquido em excesso ao tocar a borda da amostra em uma toalha de papel ou papel de filtro. Seque rapidamente uma das lâminas usando um jato de gás nitrogênio.Em seguida, inspecione visualmente a lâmina. Uma mancha opaca indica que as bactérias não foram removidas na etapa de lavagem. A outra lâmina, que agora será usada para imageamento, não deve ser deixada secar.Coloque-o no estágio úmido A FM e fixe-o usando os clipes; com uma pipeta microliterada, adicione água ao estágio úmido. É recomendável preparar o microscópio de força atômica antes da imagem em líquido. Certifique-se de que a alavanca para imageamento em líquido esteja colocada no A FM e alinhada com o laser.Prossiga com a imagem por microscopia de força atômica utilizando um microscópio de força atômica pico plus, equipado com uma cabeça de varredura de 100 mícrons e sondas de nitreto de silício vico com constantes elásticas nominais variando de 0,01 a 0,1 nano newton por nanômetro. Uma vez que o microscópio estiver preparado, insira o scanner FM e o estágio no microscópio. Normalmente, iniciamos com velocidade de varredura de 0,5 linhas por segundo até uma linha por segundo, e a resolução é definida entre 128 pontos de dados por linha até 512.Configure o instrumento para coletar imagens usando de 128 a 512 pixels por linha. Faça a varredura em uma velocidade de 0,5 a uma linha por segundo. Em seguida, se necessário, ajuste o ponto de ajuste e os ganhos no modo FM-A para obter imagens ideais.Por fim, colete as imagens. As bactérias E coli foram montadas sobre MICA revestida com gelatina conforme descrito neste vídeo e, em seguida, imagens foram obtidas em PVS 0,005 molar. Utilizando este método.Scepter são claramente visíveis na imagem coletada e as superfícies celulares são lisas, não apresentando sinais de desidratação. Em comparação, imagens obtidas do mesmo E. coli no ar, como mostrado aqui, frequentemente revelam estruturas não vistas em meio líquido. Neste caso, as células apresentam uma aparência anelar devido à desidratação, e apêndices bacterianos, como FIA, podem ser observados.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras bacterianas para uma imagem de MF em um ambiente líquido. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente uma hora, caso as microsuperfícies recobertas com gelatina já tenham sido previamente preparadas. Ao tentar este procedimento, é importante escolher a gelatina correta e ter uma concentração apropriada de bactérias seguindo este protocolo.Outras medições, como o uso do cantilever de FN como uma ferramenta de detecção de força para obter medições de força em superfícies bacterianas, podem ser realizadas. Além disso, moléculas de sonda específicas podem ser ligadas à ponta de MF-A para interagir com alvos específicos na superfície bacteriana, a fim de identificar e medir forças de interação. Geralmente, não se esqueça de que, se você estiver trabalhando com bactérias patogênicas, precauções sempre devem ser tomadas ao utilizar este método.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um modo de tocar microscópio de força atômica método (AFM) para a visualização de DNA plasmídeo, proteínas citoplasmáticas e proteína-DNA complexos é descrito. O método inclui abordagens alternativas para a preparação de amostras para AFM imagem após a manipulação bioquímica. DNA contendo regiões específicas interagindo proteínas são observados em condições quase fisiológica buffer.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Informações espaço-temporais sobre proteínas dinâmicas dentro de células vivas são cruciais para a compreensão da biologia. Um tipo de microscopia de super-resolução chamada microscopia de iluminação rápida estruturada em 3D (f3D-SIM) revela informações únicas sobre o anel Z citocinético em bactérias: tanto sua aparência semelhante a um grânulo quanto a dinâmica rápida do FtsZ dentro do anel.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Nós apresentamos um protocolo para funcionalizar cantialavancas do microscópio de força atômica (AFM) com uma única pilha de T e partícula do grânulo para estudos imunológicos. Os procedimentos para sondar a ligação Cell-dendritic do único-par célula T por AFM e monitorar a resposta celular em tempo real dos macrófagos a uma única partícula contínua pelo AFM com imagem latente da fluorescência são mostrados.

Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha

Este protocolo visa automatizar as medições de AFM em centenas de células microbianas. Primeiro, micróbios são imobilizados em microestruturas de selo PDMS e, em seguida, as medições de espectroscopia de força são realizadas automaticamente em centenas de células imobilizadas.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

A Espectroscopia De Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) fornece uma plataforma poderosa para estudos bacterianos, permitindo alcançar a resolução de nanoescala. Ambos, o mapeamento de alterações subcelulares (por exemplo, na divisão celular) quanto estudos comparativos de composição química (por exemplo, decorrentes da resistência a medicamentos) podem ser conduzidos a um único nível celular em bactérias.

Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar as propriedades mecânicas intracelulares de células isoladas de zebrafish em bidimensionais com medição direta de força por uma armadilha óptica.

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

Este estudo apresenta um novo protocolo para aplicar diretamente força mecânica no núcleo celular através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas.

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

Aqui, apresentamos a aplicação da microscopia de força atômica (AFM) como um método simples e rápido para caracterização bacteriana e analisamos detalhes como o tamanho e a forma bacteriana, biofilmes de cultura bacteriana e a atividade de nanopartículas como bactericidas.

Microscopia de Força Atômica em Modo de Contato como Técnica Rápida para Observação Morfológica e Análise de Danos Celulares Bacterianos

Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.

Método de imobilização vertical para análise de microscopia time-lapse em cianobactérias filamentosas

Aprenda a imobilizar bactérias Gram-negativas e Gram-positivas em mica revestida com gelatina para microscopia de força atômica em ambiente líquido. Este método permite obter imagens de alta resolução de células vivas.

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

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