A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

A microscopia de força atômica ou um FM usam sondagem mecânica de uma superfície para gerar imagens de alta resolução sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. Neste vídeo, as bactérias são imobilizadas em mica revestida de gelatina e fotografadas em um ambiente líquido por um FM. Primeiro, os quadrados MICA são cortados para caber na plataforma do microscópio A FM. A camada superior do MICA é removida e os quadrados de mica são revestidos com gelatina.

Em seguida, uma gota de suspensão bacteriana é colocada na mica revestida com gelatina e espalhada. Usando uma ponta de pipeta, as amostras são incubadas por 10 minutos. Em seguida, as bactérias não ligadas são lavadas da superfície.

A amostra é colocada na célula úmida A FM e fotografada para obter imagens de alta resolução de bactérias vivas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a mobilização de filtros porosos ISO, é que tanto as bactérias em forma de bastonete quanto as esféricas podem ser imobilizadas de forma confiável. Além disso, uma porcentagem maior da superfície celular é acessível à sonda A FM.

Uma das principais vantagens da microscopia de força atômica sobre outras microscopias é que estudos de células únicas podem ser conduzidos, investigações sobre morfologia celular, formação de septo e citocinese podem ser realizadas. Indivíduos novos neste método terão dificuldades porque tendem a usar gelatina que não é comprovada para imobilizar bactérias ou as bactérias usadas cultivadas em um meio complexo onde os componentes competirão com a adesão das bactérias à superfície da gelatina. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez em experimentos na década de 1970, onde as bactérias eram imobilizadas.

Lâminas de vidro revestidas com gelatina para experimentos usando microscopia de luz e auto-radiografia. Nesta demonstração, bactérias gram-negativas vivas são imobilizadas para uma imagem FM, mas o método também é aplicável a bactérias gram-positivas. Para preparar o MICA, comece cortando-o com uma tesoura para caber no estágio do microscópio A FM e acomodar a célula úmida A FM.

Em seguida, coloque a fita adesiva na superfície do MICA e remova-a para descascar a camada externa do MICA da peça cortada. Continue a remover a camada externa de ambos os lados até que apenas camadas lisas e contínuas permaneçam. Para preparar a solução de gelatina, adicione 100 mililitros de água destilada a uma garrafa de laboratório e aqueça no micro-ondas.

Quando a água começar a ferver, retire-a do micro-ondas, adicione 0,5 gramas de gelatina e inche suavemente a garrafa até que a gelatina se dissolva. Observe que as gelatinas bovinas não funcionam bem para este procedimento. Gelatinas suínas são recomendadas.

Coloque a garrafa na bancada e deixe esfriar de 60 a 70 graus Celsius. Em seguida, despeje uma quantidade suficiente da solução de gelatina em um copo pequeno para garantir que o MICA possa ser submerso completamente usando uma pinça. Mergulhe um quadrado de MICA na solução de gelatina quente e retire-o rapidamente. Imediatamente.

Coloque o MICA em sua borda em uma toalha de papel encostado em um rack de microcentrífuga para secar ao ar ambiente durante a noite. O MICA revestido com gelatina pode ser usado por pelo menos duas semanas. Se o MICA revestido de gelatina não for usado por algumas semanas.

Coloque-o em papel de filtro em uma placa de Petri coberta e guarde-o em temperatura ambiente. O excesso de solução de gelatina pode ser mantido refrigerado e usado por aproximadamente um mês, simplesmente reaquecendo a solução estoque entre 60 e 70 graus. Deve-se tomar cuidado para garantir que a gelatina não seja fervida durante o reaquecimento.

Antes de montar as bactérias no MICA revestido com gelatina, certifique-se de que a concentração bacteriana seja adequada. Use um espectrofotômetro para obter uma leitura de densidade óptica da amostra bacteriana em 600 nanômetros. Um OD de 0,5 para um é o ideal.

Em seguida, transfira um mililitro da cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugue-o para pellet após a centrifugação. Use uma pipeta para remover o sobrenadante e, em seguida, lave o pellet em um mililitro de água deionizada filtrada ou tampão. Pipetando suavemente para cima e para baixo para resus.

Suspenda o pellet, centrifugue seu ganho e ressuspenda imediatamente o pellet. Em 500 microlitros de água deionizada nano pura, a suspensão bacteriana deve ser visivelmente cocô para ter uma concentração adequada de células. Para uma imagem FM.

Se o choque osmótico for uma preocupação, sacarose 0.25 molar pode ser adicionada à solução de imagem. Eu ressuspendi essa bactéria na água, mas não tenha medo de experimentar outros líquidos. Por exemplo, fizemos isso com 0,25% de sacarose, então experimente outros líquidos e veja se isso também funcionará.

Prepare duas lâminas para cada amostra. Usando um micropipetador, adicione 10 a 20 microlitros de suspensão celular à superfície revestida de gelatina. Em seguida, para fornecer uma área de cobertura adequada para uma imagem FM, use uma ponta de micropipeta para espalhar a gota nas direções X e Y.

Tomando cuidado para não tocar fisicamente na superfície da gelatina com a ponta da pipeta, incube a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue com um jato de água que absorva o excesso de líquido da amostra tocando a borda da amostra em uma toalha de papel ou papel de filtro. Seque rapidamente uma das lâminas usando um jato de gás nitrogênio.

Em seguida, inspecione visualmente o slide. Uma mancha opaca indica que as bactérias não foram removidas na etapa de lavagem. A outra lâmina, que agora será usada para imagens não deve secar.

Coloque-o no A FM úmido stage e prenda-o usando os clipes, usando uma micro pipeta adicione água ao molhado stage. É uma boa ideia preparar o microscópio de força atômica antes da imagem em líquido. Certifique-se de que o cantilever para imagens em líquido esteja colocado no A FM e esteja alinhado com o laser.

Prossiga com a imagem por microscopia de força atômica usando um microscópio de força atômica pico plus, equipado com uma cabeça de varredura de 100 mícrons e sondas de nitreto de silício vico com constantes de mola nominais variando de 0,01 a 0,1 nano newton por nanômetro. Depois que o microscópio estiver preparado, insira o scanner FM e o estágio no microscópio. Normalmente, começamos em 0,5 linhas por segundo até uma linha por segundo como nossa velocidade de imagem e a resolução é definida de 1 28 pontos de dados por linha para 512.

Defina o instrumento para coletar imagens usando 128 a 512 pixels por linha. Digitalize a uma velocidade de digitalização de 0,5 a uma linha por segundo. Em seguida, se necessário, ajuste o ponto de ajuste e os ganhos no A FM para obter imagens ideais.

Por fim, colete as imagens. As bactérias E coli foram montadas em MICA revestida com gelatina, conforme descrito neste vídeo, e depois fotografadas em PVS de 0,005 molar. Usando este método.

O cetro é claramente visível na imagem coletada e as superfícies celulares são lisas, não mostrando sinais de desidratação. Em comparação, as imagens tiradas da mesma E. coli no ar, como mostrado aqui, geralmente mostram estruturas não vistas no líquido. Nesse caso, as células apresentam uma aparência de anel devido à desidratação e apêndices bacterianos, como FIA, podem ser vistos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras bacterianas para uma imagem FM em um ambiente líquido. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente uma hora se as microsuperfícies revestidas com gelatina tiverem sido previamente preparadas no leito. Ao tentar este procedimento, é importante escolher a gelatina correta e ter uma concentração adequada de bactérias Após este procedimento.

Outras medições, como o uso do cantilever FN como uma ferramenta de detecção de força para reter medições de força em superfícies bacterianas, podem ser realizadas. Além disso, moléculas de sonda específicas podem ser amarradas à ponta A FM para interagir com alvos específicos na superfície bacteriana para identificar e medir as forças de interação. Geralmente, não se esqueça de que, se você estiver trabalhando com bactérias patogênicas, sempre deve ser tomado cuidado ao trabalhar com esse método.