Name: Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a rastrear infecções virais em mosquitos de campo usando ensaio de cultura de células Vero. Este método permite detectar diversidade viral em vetores, aprimorando o entendimento da ecologia viral para saúde pública.

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Agradecemos as importantes contribuições dos drs. John Anderson, Andrew principal e Shirley Tirrell a este estudo. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e do Departamento de Agricultura dos EUA (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).

1. Triagem e identificação de mosquitos <ol><li> Os seguintes procedimentos são realizados em uma bancada de laboratório aberto em uma dedicada biossegurança de nível 2 (BSL-2) por pessoal de laboratório que são treinados para trabalhar com os mosquitos vivos. A &quot;cadeia de frio&quot; é mantida durante todo o procedimento. </li><li> Anestesiar os mosquitos adultos vivem colocando bolsa coletora de mosquito em um freezer -20 ° por 5 minutos. Saco de transferência de coleção para um recipiente isolado contendo gelo seco. Feche a tampa e expor mosquitos para dióxido de carbono durante 1-3 minutos para garantir a completa knock-down. </li><li> Toque mosquitos anestesiados em uma panela pré-refrigerados colocado sobre uma cama de gelo seco. Individual separada mosquitos fêmeas usando uma pinça fina e coloque em copos de plástico. Cubra com tampa e coloque em copos de gelo molhado. </li><li> Identificar as espécies de mosquitos utilizando chaves taxonômicas descritiva com base na morfologia externa mosquito com o auxílio de um microscópio estéreo de dissecação (10-60X zoom) montado em uma mesa de frio eletrônica. </li><li> Combine identificou espécies de mosquito em piscinas de ≤ 50 indivíduos em 2 mL pressão cap-frascos contendo um BB de cobre. Frascos estão identificados com um identificador exclusivo. </li><li> Após a identificação de todos os mosquitos, os frascos são colocados em sacos etiquetados e mantidos em um refrigerador de isopor contendo gelo seco. </li><li> Loja pools de mosquitos em um freezer -80 ° C até que o teste do vírus. </li></ol> 2. Considerações de biossegurança para isolar vírus a partir de mosquitos <ol><li> Os seguintes procedimentos são realizados em um nível de biossegurança 3 (NB-3) de laboratório por funcionários que são treinados para trabalhar com este nível de contenção de 1. Laboratórios, equipamentos, procedimentos e práticas estão sujeitos à fiscalização institucional, estaduais e federais e de inspeção. Buscar a formação adequada e aprovação antes de tentar os seguintes protocolos. </li><li> Usar o equipamento de proteção individual (EPI) para cada procedimento, como batas descartáveis, luvas, protetores faciais, e respiradores. </li><li> Desinfetar superfícies de trabalho com álcool 70% antes e após os procedimentos de completar. </li><li> Culturas de células e materiais potencialmente infecciosos são tratados de Classe II biossegurança gabinete (BSC). </li><li> Pools de mosquitos são homogeneizadas em um misturador-mill que é colocado dentro de um BSC. </li><li> Homogeneizados de mosquito são centrifugadas em uma microcentrífuga anti-aerossol. Se este procedimento não pode ser realizada dentro de um BSC, o operador deve usar um respirador durante a operação e recuperação de amostras da centrífuga. </li><li> Pipetas e pontas de pipeta de manuseio de materiais no BSC (biossegurança gabinete) são embebidos em água sanitária a 10% antes da autoclavagem. Todos os resíduos de laboratório é descontaminados em autoclave antes do descarte. </li></ol> 3. Preparação de células Vero <ol><li> Decantar meios de cultura de um grande frasco de cultura de tecidos (175 cm 2) de células Vero confluentes (Clone E6) em copo resíduos contendo lixívia. </li><li> Lave as células Vero, adicionando uma alíquota de 5 mL de PBS e agite sobre a camada de células e ao longo dos lados do frasco certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro. </li><li> Decantar PBS em copo de resíduos. </li><li> Adicionar 2,5 mL de tripsina-EDTA e agite sobre camada de células certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro. </li><li> Incubar balão em incubadora por 5 minutos a 37 ° C CO, 5% 2. </li><li> Agitar suavemente e frasco agite para remover as células da superfície inferior. As células devem deslizar facilmente; incubar um adicional de 1-5 minutos se as células não são facilmente escorregar. </li><li> Adicionar 5 mL de Minimal Essential Media (MEM), 5% de soro fetal bovino (FBS), usando uma pipeta sorológica e pipeta up-and-down 10-20 vezes para quebrar os aglomerados de células. </li><li> Adicionar um adicional de 15 mL de MEM, 5% FBS para um volume total de 22,5 mL e misture bem. </li><li> Coloque 40 frascos pequenos cultura de tecidos (25 cm 2) na vertical em dois racks (20 frascos / rack). </li><li> Coloque o racks contendo frascos dentro da cabine de segurança biológica e remover capacetes frasco, colocando tampas em frente dos frascos. </li><li> Dispense 4 mL de MEM, FBS 5% em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica. </li><li> Dispense 0,5 mL células em suspensão em cada frasco (~ rácio divisão 1:6) Substitua as tampas frasco. </li><li> Adicionar 50 mL de MEM, 5% FBS de volta para o balão de grande cultura de tecidos de origem, contendo suspensão de células restantes (~ 2,5 ml) e retornar balão até a incubadora. O frasco mesma cultura grande tecido pode ser reutilizado até 5 passagens e, em seguida, um frasco deve ser novo set-up para substituí-lo. </li><li> Coloque pequenos frascos de cultura de tecidos em pilhas de bandeja. Redemoinho da bandeja para se certificar de que a mídia de maneira uniforme cobre o fundo do charlatões. </li><li> Coloque pequenos frascos na incubadora a 37 ° C CO, 5% 2 e crescer durante a noite até confluentes 80-90%. </li></ol> 4. Preparação dos pools de mosquitos <ol><li> Manter pools de mosquitos frio durante os procedimentos de teste. Use pré-refrigeradosracks freezer e liquidificador moinho de cassetes, gelada reagentes e uma centrífuga refrigerada durante o processamento de pools de mosquitos. </li><li> Colocar os tubos contendo os mosquitos em um rack freezer pré-refrigerados e adicionar 1-1,5 mL PBS-G para cada tubo de mosquitos. </li><li> Recuperar misturador moinho de cassetes do freezer. Coloque 24 tubos em cada cassete e depois segura no misturador-mill. </li><li> Homogeneizar as amostras durante 4 minutos a 25 ciclos / segundo. O moinho misturador sacode os tubos em alta velocidade e um BB de metal dentro de cada tubo rompe o tecido do mosquito. </li><li> Centrifugar os tubos por 6 minutos a 7.000 rpm. </li><li> Colocar os tubos de volta para racks freezer até inoculados em células Vero. </li></ol> 5. Inoculação de células Vero com homogenatos piscina mosquito <ol><li> Verifique pelo menos um frasco de cultura de tecido de cada série em microscópio invertido para assegurar a saúde e confluência celular adequada; esperar cerca de 80-90% de cobertura. </li><li> Line up 20 frascos pequenos cultura de tecidos em um rack e frascos de etiquetas com números de adesão correspondente de cada grupo mosquito. </li><li> Solte as tampas e mais decantar dos meios de comunicação de frascos de cultura de tecidos em copo de resíduos. Deixe a mídia o suficiente no frasco completamente monocamada de células do revestimento. </li><li> 100μL alíquota do sobrenadante de cada grupo mosquito processados ​​para o balão correspondente cultura de tecidos. </li><li> Recolocar e apertar cap garrafa de cultura. </li><li> Lay frascos de cultura de apartamento no shaker por 5 minutos (temperatura ambiente) a 35-40 rpm. </li><li> Retorno de 20 frascos de cultura de tecidos para a posição vertical em um rack e coloque no BSC. </li><li> Desoperculação 3 frascos de cultura de tecido de uma só vez, dispensar quatro meios de crescimento mL em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica, recoloque as tampas. </li><li> Certifique-se que a ponta da pipeta não contato com o gargalo do balão cultura ou lábio. Trocar a ponteira, se necessário, se o contato é feito com o frasco. </li><li> Frascos de cultura de tecidos incubar a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 6. Triagem células Vero para o crescimento do vírus <ol><li> Tela inoculados frascos de cultura de tecidos para sinais de infecção viral, o efeito citopático (CPE), 3-7 dias após a inoculação. </li><li> Inspecionar visualmente culturas de células para CPE e / ou contaminação pela inclinação do frascos e examinar os meios de comunicação que reúne na parte inferior do balão. A mídia vai aparecer nublado como as células se deterioram durante o CPE ou devido ao crescimento de leveduras, fungos ou contaminação bacteriana. </li><li> Re-examinar culturas de células que exibem media nublado em microscópio invertido. Vírus fará com que as células se tornam deformadas e libertar-se dos frascos de cultura. Culturas de células com contaminantes visíveis, por exemplo, o fermento, outras bactérias, fungos ou detritos mosquito pesados, são re-testadas, passando a piscina mosquito original através de um filtro de seringa 0.22μM. </li><li> Assepticamente dispensar 1-2 mL de mídia a partir do vírus-positivos culturas de células em criotubos rotulados com uma pipeta sorológica. </li><li> Culturas de vírus são armazenadas a -80 ° C até identificados utilizando os ensaios de diagnóstico apropriado. </li></ol> 7. Preparação de reagentes <ol><li> MEM, 5% FBS. Dissolver 37,6 g de MEM em pó em um volume final de 4 L de dd H 2 0. Dispense solução em 500 mL em frascos de alíquotas de mídia e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 26 inativado pelo calor mL de soro fetal bovino, 5,2 mL L-glutamina, 5,2 anti-biotic/mycotic mL, e 10,4 mL de bicarbonato de sódio 7,5% para cada garrafa. Armazenar a 4 ° C. </li><li> PBS-G. Dissolver 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4, e 4 mL de 0,5% Vermelho Fenol em 1000 mL dd H 2 0. Ajustar o pH a 7,1-7,4 com 2 N NaOH (se necessário). Num copo separado, o calor de 600 mL H 2 0 a ferver. Remover da placa-quente, adicione 10 g de gelatina, e dissolver. Adicione a gelatina dissolvida solução para a solução PBS e ajustar o volume final de 2 L com dd H 2 O. Dispensar 100 mL de solução em garrafas e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 42,8 ml de soro de coelho inativado pelo calor e 1,4 anti-biotic/mycotic mL. Armazenar a 4 ° C. </li><li> PBS lavar celular. Adicionar 50 mL 10X Dulbecco PBS a 400 mL dd H 2 O. Ajustar o pH para 7,1 com NaOH 2 N. Ajustar o volume final de 500 mL com dd H 2 O. Solução de filtro com unidade de vácuo 0.2uM filtro. Dispense em 5 mL em alíquotas de 8 mL tampa de rosca tubos. Armazenar a 4 ° C. </li></ol> 8. Resultados representante Nove diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas foram recuperados a partir de mosquitos coletados durante a vigilância contínua em todo o estado de Connecticut 1997-2010 (tabela 1). Cinco desses vírus são conhecidos por causar doenças no homem, os patógenos mais importantes que estão sendo vírus do Nilo Ocidental e Oriental, vírus da encefalite eqüina. Novas descobertas incluem: o primeiro isolamento do WNV a partir de mosquitos coletados emAmérica do Norte em 1999 2, o primeiro isolamento do vírus Potosi, no nordeste dos EUA em 2000 3, eo ​​primeiro isolamento do vírus La Crosse na Nova Inglaterra em 2005 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Vírus </td><td> Família </td><td> Não. isola </td><td> Locais No. </td><td> Não. ano detectado </td><td> Doença humana </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Vírus do Nilo Ocidental </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Moderada a grave, febre, encefalite </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Oriental vírus da encefalite eqüina </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Encefalite, grave </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J vírus </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Não conhecido </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Canyon vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Leve a moderada, febre, meningite </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Vírus Potosi </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Não conhecido </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Leve a grave, febre, doença neurológica em dois casos documentados </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Não conhecido </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse vírus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Moderada a encefalite, grave </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flanders vírus </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Não conhecido </td><td></td></tr></tbody></table> Vírus tabela 1. Detectado no campo de coleta de mosquitos por Vero ensaio de cultura de células. Os mosquitos foram coletados durante a vigilância em todo o estado de Connecticut 1997-2010.

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<li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes%2C+crows%2C+and+a+Cooper%27s+hawk+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+collected+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+%28Bunyaviridae%29+isolated+from+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+%28Bunyaviridae%3A+Orthobunyavirus%29+from+field-collected+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+ten-year+analysis%2C+1997-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li>
<li>Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaty%2C+BJ+%22Diagnostic+Procedures+for+Viral%2C+Rickettsial%2C+and+Chlamydial+Infections%22">Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections</a>. , American Public Health Association. 189-212 (1995).</li>
<li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarabatsos%2C+N+%22International+Catalogue+of+Arboviruses+Including+Certain+Other+Viruses+of+Vertebrates%22">International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates</a>. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).</li>
<li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens%2C+field-collected+mosquitoes%2C+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li>
<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vero ensaio de cultura celular serve como um método eficaz para mosquitos tela de campo recolhidas para uma diversidade de vírus. Isto contrasta com os métodos moleculares que atingem especificamente a um ou alguns vírus de interesse. Além disso, descobrimos que ensaio de cultura de células Vero é tão ou mais sensível do que a RT-PCR 7 e fornece-nos isolados do vírus que são armazenados em nossa coleção de referência para estudos futuros. No entanto, os sistemas de cultura de células pode não ser apropriada e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> De bicarbonato de sódio NaHCO 3, Soln 7,5%. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200mM 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Meio mínimo essencial em pó (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Soro de coelho </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Células Vero (Clone E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Frascos de cultura de tecido pequena, tampas ventiladas, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Frascos grandes de tecido de cultura, tampões ventilados, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Cobre revestido do BB, 4,5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mixer Moinho </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Freezer racks Isopack </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detecção de vírus infecciosos de campo mosquitos coletados por vero ensaio cultura de células

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Os mosquitos transmitem uma série de vírus diferentes, incluindo importantes patógenos humanos, tais como vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue eo vírus chickungunya. Muitos desses vírus se intensificaram nas suas gamas endêmicas e se expandiu para novos territórios, necessitando de programas eficazes de vigilância e controle para responder a essas ameaças. Uma estratégia para monitorar a atividade do vírus envolve a coleta de um grande número de mosquitos dos locais endêmicos e testá-las para a infecção viral. Neste artigo, descrevemos como lidar, processo e tela de campo coletados mosquitos de vírus infecciosos de células Vero por ensaio de cultura. Os mosquitos são classificadas por localização armadilha e espécies, e agrupados em pools contendo ≤ 50 indivíduos. Espécimes agrupados são homogeneizados em salina tamponada com um misturador-mill ea fase aquosa é inoculada em culturas de células Vero confluentes (Clone E6). Culturas de células são monitorados para efeito citopático do dia 07/03 pós-inoculação e qualquer vírus cresceu em cultura de células são identificadas pelos testes de diagnóstico apropriado. Ao utilizar esta abordagem, temos isolados 9 tipos diferentes de vírus a partir de mosquitos coletados em Connecticut, EUA, e entre estes, cinco são conhecidos por causar doenças no homem. Três destes vírus (vírus do Nilo Ocidental, vírus Potosi e La Crosse vírus) representam novos registros para a América do Norte ou da região da Nova Inglaterra desde 1999. A capacidade de detectar uma grande diversidade de vírus é fundamental para monitoramento ambos estabelecidos e vírus emergentes na população de mosquitos.

Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Os mosquitos transmitem diversos vírus distintos, incluindo patógenos humanos importantes, como o vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue e o vírus chikungunya. Muitos ...

O objetivo geral deste procedimento é triar mosquitos coletados em campo para detecção de infecção viral por meio do ensaio de cultura celular Vero. Primeiro, os mosquitos coletados em campo são separados de acordo com a espécie. Em seguida, os mosquitos são homogeneizados utilizando um moinho de mistura.Uma vez que os homogenatos de mosquito tenham sido preparados, as células Vero são cultivadas em preparação para o teste viral; cada cultura de células Vero é então inoculada com um único homogenato de mosquito, colocada em um agitador durante cinco minutos e, em seguida, incubada a 37 graus Celsius para permitir a propagação dos vírus. Por fim, as culturas são examinadas visualmente em busca de evidências de efeitos citopáticos induzidos por vírus. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a R-T-P-C-R, é que ela permite o rastreamento de mosquitos para uma ampla diversidade de agentes virais que se multiplicam em cultura celular.Esse método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de entomologia médica, como os papéis que diferentes espécies de mosquitos desempenham no suporte à transmissão de vírus. Utilize uma instalação de nível de biossegu

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos para usar os sistemas de alfavírus transdução de expressar repórteres fluorescentes in vitro e em mosquitos adultos são descritos. Esta técnica pode ser adaptada para expressar toda a proteína de interesse em vez de ou em adição a um repórter.

Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

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O vírus Zika (ZIKV), um patógeno emergente, está ligado a anormalidades no desenvolvimento fetal e microcefalia. O estabelecimento de um sistema eficaz de cultura de células infecciosas é crucial para estudos de replicação do ZIKV, bem como para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos. Neste estudo, vários ensaios virológicos relativos ao ZIKV são ilustrados e discutidos.

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Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

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Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

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Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

Essa metodologia, que incluiu alimentação por via oral e infecção por injeção intratorácica, foi capaz de avaliar efetivamente a influência das barreiras do intestino médio e/ou glândulas salivares na infecção por arbovírus.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Numerosas novas sequências semelhantes a vírus foram encontradas em mosquitos devido ao uso extensivo de tecnologias de sequenciamento. Fornecemos um procedimento eficaz para isolar e amplificar vírus usando linhagens celulares de vertebrados e mosquitos, que pode servir de base para estudos futuros sobre vírus associados a mosquitos, incluindo vírus transmitidos por mosquitos e específicos por mosquitos.

Isolamento de vírus associados a mosquitos coletados em campo

O presente protocolo descreve a propagação do vírus Zika (ZIKV) em células Vero African green monkey kidney e a quantificação do ZIKV usando métodos de imunodetecção colorimétrica baseados em células nos formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento).

Propagação de vírus e quantificação colorimétrica baseada em células

Aprenda a rastrear infecções virais em mosquitos de campo usando ensaio de cultura de células Vero. Este método permite detectar diversidade viral em vetores, aprimorando o entendimento da ecologia viral para saúde pública.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

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