Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

O objetivo geral deste procedimento é rastrear mosquitos coletados em campo para infecção viral por ensaio de cultura de células Vero. Primeiro, os mosquitos coletados no campo são classificados de acordo com as espécies. Os mosquitos são então homogeneizados usando um moinho misturador.

Uma vez que os homogeneizados de mosquitos tenham sido feitos, as células Vero são cultivadas em preparação para testes virais, cada cultura de células Vero é então inoculada com um único homogeneizado de mosquito colocado em um agitador por cinco minutos e, em seguida, incubada a 37 graus Celsius para permitir que os vírus se propaguem. Em última análise, as culturas são examinadas visualmente em busca de evidências de efeitos citopáticos induzidos por vírus. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o RTPC, é que permite rastrear mosquitos para uma ampla diversidade de agentes virais que crescem em cultura de células.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da entomologia médica, como os papéis que diferentes espécies de mosquitos desempenham no apoio à transmissão do vírus. Use uma instalação de nível de biossegurança dois para o procedimento a seguir. Coloque o saco coletor contendo mosquitos vivos a menos 20 graus Celsius por 15 minutos para anestesiá-los.

Depois que os insetos estiverem anestesiados, transfira a bolsa para um recipiente isolado contendo gelo seco e exponha os mosquitos ao dióxido de carbono por um a três minutos para garantir a eliminação completa. Em seguida, coloque os mosquitos em uma panela pré-resfriada em uma cama de gelo seco. Usando uma pinça de ponta fina, identifique os insetos fêmeas e transfira-os para copos plásticos.

As fêmeas podem ser distinguidas dos machos examinando as partes bucais e as antenas. Feche os copos e coloque-os sobre gelo úmido. Usando um microscópio de dissecação estéreo montado em uma mesa de resfriamento eletrônica e uma chave taxonômica.

Identifique as espécies de cada mosquito da mesma espécie em frascos rotulados de dois mililitros contendo uma bola de cobre. Até 50 indivíduos podem ser agrupados em um único tubo à medida que são preenchidos. Coloque os frascos em sacos rotulados em um recipiente de isopor sobre gelo seco.

Uma vez que todos os mosquitos tenham sido identificados, eles podem ser armazenados a 80 graus Celsius negativos até a homogeneização. Use uma instalação de nível três de biossegurança para este procedimento e trabalhe em um gabinete de biossegurança de classe dois. Adicione cerca de um mililitro de PBSG por tubo e coloque os tubos contendo mosquitos dentro de um de moinho misturador pré-resfriado.

Prenda o carregado em um moinho misturador e homogeneize as piscinas de mosquitos por quatro minutos a 25 ciclos por segundo. Assim que os mosquitos estiverem homogeneizados, transfira os tubos para uma micro centrífuga refrigerada à prova de aerossóis e centrifugue. O mosquito homogêneo a 7.000 RPM por seis minutos.

Após a centrifugação, os tubos podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius até o teste do vírus. Transvasar o meio de cultura de um balão T 1 75 de células de parto confluentes para um copo de resíduos contendo lixívia. Adicionar cinco mililitros de PBS ao balão e lavar as células uniformemente antes de decantar o PBS para o copo de resíduos.

Depois de lavar as células, adicione 2,5 mililitros de tripsin EDTA e incube o frasco a 37 graus Celsius e 5%CO2 por cinco minutos para separar as células. Assim que as células estiverem separadas, adicione cinco mililitros de MEM e pipete as células para cima e para baixo várias vezes para quebrar os aglomerados. Em seguida, adicione mais 15 mililitros de MEM.

Colocar os frascos 40 T 25 em duas prateleiras dentro da cabine de biossegurança e remover as tampas dos frascos, colocando-as diretamente na frente de cada frasco usando uma alíquota de pipeta estéril, quatro mililitros de MEM em cada frasco. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de células vari suspensas e tampe os frascos. Empilhar os frascos num tabuleiro e agitá-los suavemente para se certificar de que o meio cobre uniformemente o fundo dos frascos.

Incube as culturas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 durante a noite ou até que as células se tornem 80 a 90% confluentes. Remova 20 frascos pequenos da incubadora e etiquete-os com o número de acesso correspondente de cada pool de mosquitos. Transvase a maior parte do meio de cada frasco para o alto-falante de cintura, deixando apenas o meio suficiente para revestir a monocamada da célula.

Transfira 100 microlitros de sobrenadante de cada homogeneizado de mosquito para o frasco correspondentemente rotulado e feche bem os frascos. Uma vez transferidos os sobrenadantes, colocar os balões num agitador regulado para 35 a 40 PVP M durante cinco minutos. Traga os frascos de volta para o gabinete de biossegurança e adicione quatro mililitros de meio de crescimento a cada um.

Volte a tampar os frascos e incube-os a 37 graus Celsius e 5%CO2 durante três a sete dias. Quando as culturas estiverem prontas para serem rastreadas, primeiro inspecione visualmente a mídia. O meio turvo indica efeitos citopáticos induzidos por vírus ou contaminação com outros micróbios, ou ambos examinam as culturas, exibindo meios turvos sob um microscópio de luz invertida.

Os vírus normalmente fazem com que as células se deformem e se desprendam dos frascos de cultura. Se for detectada contaminação por bactérias, leveduras ou fungos, ou se a cultura contiver detritos pesados de mosquitos, teste novamente o pool de mosquitos original após filtrá-lo com uma seringa de 0,22 mícron. Filtre assepticamente um a dois mililitros de meio de culturas positivas para vírus não contaminadas com outros microrganismos em tubos criogênicos rotulados.

Armazenar o vírus contendo amostras a 80 graus Celsius negativos até à identificação, utilizando os ensaios de diagnóstico adequados utilizando este ensaio. Nove tipos diferentes de vírus de quatro famílias taxonômicas foram recuperados de mosquitos coletados em Connecticut durante um período de vigilância contínua em todo o estado de 1997 a 2010. Vários desses vírus, incluindo o vírus da encefalite equina oriental e o vírus do Nilo Ocidental, são conhecidos por causar doenças humanas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como classificar, processar e rastrear mosquitos para infecção viral por ensaio de cultura de células virais.