Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

O objetivo geral do seguinte experimento é fabricar nanossensores de sódio para aplicações in vitro e in vivo. Isso é alcançado preparando uma mistura opto contendo os componentes do sensor para os nanossensores. Como segundo passo, o surfactante é sonicado em solução aquosa para se distribuir uniformemente, o que permitirá a formação dos nanossensores quando a mistura opto for adicionada.

Em seguida, a mistura opto é adicionada à mistura aquosa de surfactante sob sonicação para formar os nanossensores em solução. Este vídeo demonstra que a resposta do sensor é ajustável. Os sensores podem ser microinjetados em miócitos cardíacos e também podem ser injetados subcutaneamente em camundongos.

A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como corantes indicadores fluorescentes, é que podemos ajustar os sensores a uma faixa dinâmica que corresponda ao ambiente fisiológico, medir uma gama mais ampla de analitos e realizar medições ratiométricas para análise quantitativa. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica podem ter dificuldades, pois, uma vez que os sensores são produzidos, pode parecer desafiador introduzi-los em um ambiente biológico. Estoques de ionoforo seco quatro vezes seco de TFPB de sódio e cromo quatro três precisam ser preparados com antecedência antes de fabricar o opto, de acordo com o protocolo escrito.

Em uma capela de exaustão, combine todos os materiais em um vial de vidro de 1,5 mililitro. Com uma tampa rosqueada revestida de teflon, agite suavemente o vial em vórtex até que todo o PVC tenha se dissolvido. A solução deve apresentar-se vermelha.

Comece a preparar os nanossensores adicionando 100 microlitros de 10 miligramas por mililitro de lipídio Peg em um frasco de vidro de quatro gramas. Em seguida, adicione quatro mililitros da solução aquosa desejada, como 10 milimolar de hippies.

Sincronize uma ponta de fornicar a sete milímetros do frasco utilizando um macaco de laboratório e aplique uma potência baixa de sonicação por 30 segundos. Em um tubo de 0,6 mililitro, combine 50 microlitros do material óptico e 50 microlitros de diclorometano usando a pipeta para garantir uma mistura homogênea. Em seguida, inicie uma sonicação de três minutos.

Quando a sonicação começar, adicione 100 microlitros da mistura opto imergindo a ponteira da pipeta e dispensando todo o volume em uma única injeção rápida e uniforme. A solução ficará azul se o pH subir acima de sete, e se não houver sódio para remover o THF residual e o metileno dicloro da solução. Mova a ponteira do sonificador para uma profundidade de dois milímetros.

À medida que os três minutos restantes passam, a solução se tornará opaca. Após a conclusão da sonicação, aspire a solução do nanossensor para dentro de uma seringa de cinco mililitros. Acople um filtro e distribua a solução do nanossensor em um frasco de vidro com tampa de rosca.

Inicie preparando 10 soluções com concentrações progressivamente crescentes de sódio, contra as quais a sensibilidade do nanossensor poderá ser medida. Combine soluções estoque de sódio zero molar e um molar em tubos cónicos de 50 mililitros. Agora, em uma placa óptica de fundo 96, adicione 100 microlitros de cada concentração de sódio a três poços em uma coluna.

Em seguida, adicione 100 microlitros de nanossensores recém-preparados a cada poço, carregue a placa em um fluorímetro de microplacas e insira os comprimentos de onda de excitação, emissão e corte ideais para o cromóforo utilizado. A escolha dos comprimentos de onda medidos depende da aplicação. Esses comprimentos de onda permitem medições intracelulares de dinâmicas rápidas ou redução de ruído.

Para obter os valores de alfa, divida a razão da intensidade em 570 nanômetros pela intensidade em 670 nanômetros ou 680 nanômetros. Represente graficamente os valores de alfa em função do logaritmo da concentração de sódio. Defina o logaritmo da concentração zero de sódio como menos um.

Agora, ajuste uma curva sigmoide à resposta e, a partir dessa curva, calcule a concentração de sódio na qual o valor alfa é 0,5. Isso representa a concentração de sódio na qual o sensor responde de forma ideal. Com base nessas informações, ajuste a proporção de íon sódio quatro x sódio TFPB e cromo íon quatro três na opto para criar nanossensores com a concentração ideal de sódio.

Por exemplo, curvas de resposta de herói de cinco conjuntos diferentes de nanossensores representando diferentes formulações ópticas, variando apenas na quantidade de sódio de quatro 10. Para imagem intracelular, substitua o meio celular por um meio transparente como a solução de Tyro e transfira as células para uma câmara de imagem. Agora, preencha novamente uma pipeta de vidro puxada com solução de nanossensor preparada em cinco miligramas por mililitro de glicose em água.

Em seguida, acople a pipeta a um micromanipulador e conecte-a a um sistema de injeção controlado por pressão. Abaixe a pipeta sobre a célula e dentro do citoplasma. Às vezes, é necessário tocar levemente no suporte do micromanipulador para perfurar a membrana.

Injete algumas centenas de picolitros da solução de nanossensor e retire rapidamente a pipeta. Anestesie um camundongo CD-1 nu com isoflurano utilizando uma câmara de anestesia. Após a anestesia, coloque o camundongo na câmara de imagem desinfetada.

Em seguida, encha uma seringa estéril de insulina de 31 gauge com 10 microlitros de nanossensores com o KD apropriado em PBS 10 milimolar. Certifique-se de remover todas as bolhas de ar utilizando pinça. Segure uma pequena dobra de pele ao longo das costas do camundongo no local desejado para a injeção, enquanto segura a pele.

Insira a seringa na pele com o bisel voltado para cima e a agulha paralela à pele. Agora, puxe suavemente o êmbolo da seringa para trás para garantir que a agulha não tenha sido inserida em um vaso sanguíneo. Para minimizar a pressão contrária, mova suavemente a agulha para a direita e para a esquerda, criando um espaço dentro da pele.

Em seguida, injete os sensores e remova suavemente a seringa. Aplique suavemente pressão no local da injeção e limpe qualquer solução que possa ter vazado pelo local da injeção. Normalmente, são realizadas seis injeções igualmente espaçadas ao longo das costas.

Se o procedimento for realizado em camundongos diferentes, troque a agulha para minimizar doenças, transmissão e contaminação cruzada. Após as injeções, obtenha imagens em campo claro e fluorescentes utilizando conjuntos de filtros que correspondam de perto ao espectro de emissão de excitação dos nanossensores. Isso também minimiza a autofluorescência da pele.

Esses miócitos cardíacos neonatais foram cultivados em um lamínula e injetados com nanossensores de sódio. Esta imagem fluorescente foi obtida com um comprimento de onda de excitação de 639 nanômetros. Esta é uma imagem de campo claro das mesmas células, e esta é uma sobreposição das duas imagens.

Existe uma certa agregação dos sensores, mas as células apresentam morfologia normal. Os sensores difundiram-se por todo o citosol e não há captação nuclear. Esta sobreposição de uma imagem de campo claro e uma imagem fluorescente mostra nove injeções subcutâneas diferentes de nanosensores de sódio no espaço subcutâneo de um camundongo nu.

Uma vez que a fabricação de nanossensores por Masten pode ser realizada em minutos, se executada corretamente, e aplicada a qualquer pesquisa para medir o fluxo reversível de analitos em tempo real. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como carregar nanossensores no espaço intracelular ou subcutâneo para medições quantitativas em um ambiente biológico.