Forma Polímeros Memória da Cultura célula ativa

O objetivo geral deste procedimento é cultivar células em um substrato com uma topografia que muda ao longo do tempo. Isso é realizado primeiramente programando um polímero com memória de forma em uma forma permanente que pode ser recordada. Em seguida, o polímero com memória de forma é programado em uma forma temporária na qual as células serão posteriormente semeadas.

O passo final do procedimento é acionar o polímero com memória de forma para que retorne à sua forma permanente mediante aumento da temperatura; os resultados finais podem ser obtidos por meio de microscopia de fluorescência, demonstrando alterações no comportamento celular. Olá, meu nome é Pat Mather. Sou professor de Engenharia Biomédica e Química e diretor do Instituto de Biomateriais de Syracuse aqui na Universidade de Syracuse.

A principal vantagem dessa técnica em relação a aparelhos comerciais ou personalizados para estiramento de células é que, em um único sistema polimérico, somos capazes de aplicar uma ampla variedade de deformações complexas às células. Meu nome é Jay Henderson. Sou professor assistente de Engenharia Biomédica e Química e membro do Instituto de Biomateriais de Syracuse.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da Mecanobiologia, como a forma como as células respondem a mudanças dinâmicas em seu ambiente físico. Meu nome é Kevin Davis e sou aluno de doutorado na Universidade de Syracuse, no Departamento de Engenharia Biomédica e Engenharia Química. Embora este método possa fornecer informações sobre a biologia mecânica em 2D, ele também pode ser utilizado em outros sistemas, como scaffolds tridimensionais com mudança de forma para engenharia de tecidos.

Antes do início deste procedimento, prepare uma câmara de cura personalizada utilizando uma lâmina de vidro, um espaçador de teflon com um milímetro de espessura e uma placa de alumínio. Fixe a câmara usando clipes pequenos inicialmente, injete o NOA 63 na câmara através de um orifício no espaçador de teflon utilizando uma agulha de 18 gauge. Em seguida, coloque a câmara em uma placa aquecedora regulada em 125 graus Celsius.

Deixe a câmara aquecer até uma temperatura uniforme por cinco minutos após o aquecimento da câmara. Adquira o NOA 63 por 20 minutos posicionando uma lâmpada UV a 6,5 centímetros da superfície do vidro. Remova o NOA 63 da câmara enquanto ainda estiver quente, utilizando uma lâmina de barbear.

Em seguida, realize a pós-curagem do polímero com memória de forma sob luz UV por três horas e 40 minutos diretamente sobre a placa aquecedora a 125 graus Celsius. Para caracterizar a memória de forma do NOA 63, prepare um corpo de prova em formato de haltere prensando a película curada a quente com um punção personalizado. Por fim, fixe o corpo de prova em um analisador mecânico dinâmico com acessório de tração.

Configure o instrumento no modo controlado por força e programe o procedimento de teste conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo. O resultado do procedimento é um polímero com memória de forma curado isotermicamente ou filme SMP. Coloque o CSMP em uma placa aquecedora e ajuste a temperatura acima da temperatura de transição vítrea, a fim de reduzir o módulo e facilitar o corte. Para preparar amostras individuais a partir do filme SMP curado isotermicamente.

Corte o filme s e p com uma lâmina ao tamanho de amostra desejado. A forma temporária pode ser fixada de várias maneiras diferentes. Aqui, uma prensa hidráulica de bancada com placas que podem ser aquecidas e resfriadas é utilizada para embossar uma topografia temporária.

Primeiro, ajuste a temperatura das PLA acima da tg. Para esta demonstração, um gravador foi fabricado curando epóxi sobre um disco de vinil para produzir um formato temporário de ranhuras paralelas. O gravador pode ser feito a partir de outros materiais e com diferentes topografias, mas deve ser mais rígido do que o NOA 63.

Na temperatura de prensagem, coloque as amostras s e p com a face voltada para baixo sobre a prensa térmica. Em seguida, posicione as amostras e a prensa térmica na prensa hidráulica. Aplique uma pré-carga de aproximadamente 100 quilopascals para estabelecer o contato entre as placas aquecidas e as amostras, mantendo por cerca de cinco minutos para permitir que as amostras atinjam uma temperatura uniforme.

Uma vez atingida uma temperatura uniforme, aplique um a seis megapascals às amostras e mantenha por um minuto. O SMP se fraturará. Se uma tensão maior for aplicada.

Aplicar tensões menores para introduzir topografias com amplitudes menores. Após a aplicação da pressão, reduzir a temperatura abaixo da TG utilizando a capacidade de resfriamento por água da prensa. Quando a temperatura estiver abaixo da TG, remover a força aplicada antes de iniciar o experimento de cultura celular ativa.

A luz UV do gabinete de segurança biológica é usada para esterilizar as amostras. Organize as amostras com a face voltada para baixo em placas estéreis sem tampas e ligue a luz UV por seis horas. Em seguida, vire as amostras para novas placas estéreis na posição com a face para cima.

Ligue a luz UV por mais seis horas. As amostras precisam ser equilibradas a um estado relativamente estável antes da semeadura com células. Coloque as amostras em uma placa de 96 poços e adicione 150 microlitros de meio de crescimento completo.

Meio por poço. Coloque a placa em um incubador a 30 graus Celsius com 5% de CO₂ até atingir a recuperação parcial desejada. Para esta demonstração, as amostras são incubadas por 30 horas para produzir uma amplitude suficientemente grande para alinhar as células.

Após a recuperação parcial ser alcançada, as amostras podem ser semeadas com células. Coloque as amostras em uma nova placa de 96 poços. Em seguida, adicione 150 microlitros de solução celular a cada uma das amostras aqui, C3 H 10 t e meio.

A maioria dos fibroblastos embrionários é utilizada a 20.000 células por mililitro. Para obter células isoladas, permita que as células adiram e se espalhem sobre a topografia temporária, incubando a 30 graus Celsius por 9,5 horas. Em seguida, analise a morfologia celular antes da transição removendo as amostras e realizando coloração e imagem de fluorescência das amostras.

Este material exibe autofluorescência na maior parte do espectro de luz ultravioleta e visível; fluoróforos na extremidade vermelha distante do espectro, como o Alexa Fluor 647, são recomendados para reduzir o fundo. Para desencadear a recuperação das amostras, mova a placa para um incubador a 37 graus Celsius e continue o cultivo por 19 horas. Isso permite que o material se recupere e que as células adaptem sua morfologia à nova topografia. Após a incubação, aplique as colorações apropriadas, como a faloidina, para a imagem do actina filamentosa.

Como etapa final, as células podem ser imagiadas na nova topografia mostrada aqui, que é a memória de forma monodirecional em bloco de uma única cura de NOA 63. Repetido três vezes, onde o asterisco indica o início experimental da cura. O NOA 63 é um sólido transparente e vítreo que possui excelentes propriedades de memória de forma.

Neste caso, o material foi curado e apresenta uma temperatura de transição vítrea (TG) uniforme de 51,1 graus Celsius, determinada a partir do início da queda do módulo de armazenamento. A queda na deformação observada aqui ocorre na tg medida. Uma grande porcentagem dos 4,7% de deformação aplicada foi fixada após o descarregamento a 20 graus Celsius, correspondendo a uma razão de fixação de 89,3%. A deformação fixada foi então recuperada em uma razão de 84,4% em uma faixa de temperatura relativamente pequena durante o aquecimento.

O desempenho da memória de forma não apresentou deterioração até três ciclos, conforme evidenciado pelo fato de todas as curvas seguirem praticamente o mesmo trajeto. A amplitude da topografia temporária diminui ao longo do tempo a 30 graus Celsius em 30 horas. A 30 graus Celsius.

A amplitude foi reduzida em aproximadamente 50% indicado aqui no tempo zero. Reduz mais 10% nas próximas 9,5 horas. Quando a recuperação é acionada pelo aumento da temperatura para 37 graus Celsius, a amplitude diminui para 0,5% da amplitude inicial dentro de 9,5 horas para o gravador utilizado e uma tensão de gravação de 4,9 megapascal.

Isso corresponde a uma mudança funcional de ranhuras de 13 micrômetros para uma superfície quase plana. Este polímero recupera na faixa de temperatura de 30 a 37 graus sob condições de cultivo celular. Isso ocorre devido à absorção de água do meio de cultura, na qual a água atua como plastificante do polímero, reduzindo a tg, o que permite a recuperação em temperaturas abaixo da tg seca de 51 graus.

Um exemplo de um comportamento celular controlado por meio do uso de substratos de cultura celular ativos é a alteração na organização do citoesqueleto em substratos ranhurados temporários. Antes da recuperação ser desencadeada, os filamentos de actina se alinham ao longo da direção das ranhuras. Após a recuperação mediante aumento de temperatura, os filamentos se reorganizam e passam a ter orientação aleatória.

Por outro lado, amostras controle que possuem superfícies estáticas, planas ou com ranhuras estáticas não se reorganizam após o aumento da temperatura. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a geometria da câmara de cura, a temperatura de transição do polímero, o método de fixação de deformação e a composição do próprio polímero podem todos ser ajustados para alcançar a transição desejada em seu próprio experimento após este procedimento. Outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como como a expressão gênica muda em resposta à estimulação mecânica fornecida pelo substrato após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de mecanobiologia celular investigarem o citoesqueleto celular, o rearranjo e a física da matéria mole em duas dimensões. Agradecemos seu interesse em nosso trabalho e por ter assistido.