Forma Polímeros Memória da Cultura célula ativa

O objetivo geral deste procedimento é cultivar células em um substrato com uma topografia que muda com o tempo. Isso é feito primeiro programando um polímero com memória de forma em uma forma permanente que possa ser lembrada. O polímero com memória de forma é então programado em uma forma temporária na qual as células são posteriormente revestidas.

A etapa final do procedimento é acionar o polímero com memória de forma para retornar à sua forma permanente aumentando a temperatura, em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram uma mudança no comportamento celular por meio de microscopia de fluorescência. Olá, meu nome é Pat Mather. Sou professor de engenharia biomédica e química e diretor do Syracuse Biomaterials Institute aqui na Syracuse University.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos aparelhos comerciais ou personalizados para esticar células é que, em um único sistema polimérico, podemos aplicar uma ampla variedade de cepas complexas às células. Meu nome é Jay Henderson. Sou professor assistente de Engenharia Biomédica e Química e membro do Syracuse Biomaterials Institute.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Mecanobiologia, como a forma como as células respondem a mudanças dinâmicas em seu ambiente físico. Meu nome é Kevin Davis e sou estudante de doutorado na Syracuse University no Departamento de Engenharia Biomédica e Engenharia Química. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia mecânica 2D, ele também pode ser usado para outros sistemas, como andaimes de mudança de forma 3D para engenharia de tecidos.

Antes do início deste procedimento, prepare uma câmara de cura personalizada usando uma lâmina de vidro, um espaçador de Teflon de um milímetro de espessura e uma placa de alumínio. Prenda a câmara usando pequenos clipes de fichário para começar, injete NOA 63 na câmara através de um orifício no espaçador de Teflon usando uma agulha de calibre 18. Em seguida, coloque a câmara em uma placa quente ajustada a 125 graus Celsius.

Deixe a câmara aquecer a uma temperatura uniforme durante cinco minutos após o aquecimento da câmara. Adquira o NOA 63 por 20 minutos posicionando uma lâmpada UV a 6,5 centímetros da superfície do vidro. Remova o NOA 63 da câmara ainda quente usando uma lâmina de barbear.

Em seguida, pós-polimerize o polímero com memória de forma sob luz ultravioleta por três horas e 40 minutos diretamente na placa quente a 125 graus Celsius. Para caracterizar a memória de forma do NOA 63, prepare uma amostra de haltere pressionando a quente o filme curado com um punção personalizado. Finalmente, deteste a amostra em um analisador mecânico dinâmico com fixação de tração.

Defina o instrumento para forçar o modo controlado e programe o procedimento de teste conforme encontrado no protocolo escrito que acompanha este vídeo. O resultado do procedimento é polímero de memória em forma de cura isotérmica ou filme SMP, coloque o CSMP em uma placa quente e defina a temperatura mais alta do que a temperatura de transição vítrea, a fim de reduzir o módulo e facilitar o corte. Para preparar amostras individuais do filme s e p curado isotermicamente.

Corte o filme s e p com uma navalha no tamanho de amostra desejado. A forma temporária pode ser corrigida de várias maneiras diferentes. Aqui. Uma prensa hidráulica de bancada com placas que podem ser aquecidas e resfriadas é usada para gravar uma topografia temporária.

Primeiro, defina a temperatura dos PLAs em uma temperatura acima do tg. Para esta demonstração, uma impressora foi feita curando epóxi em um disco de vinil para produzir uma forma temporária de ranhuras paralelas. A impressora pode ser feita de outros materiais e com topografias diferentes, mas deve ser mais rígida que a NOA 63.

Na temperatura de gravação, coloque as amostras s e p voltadas para baixo na impressora. Em seguida, coloque as amostras e a impressora na prensa. Aplique aproximadamente 100 quilos de pré-carga pascal para fazer contato entre os PLAs de aquecimento e as amostras por cerca de cinco minutos para permitir que as amostras atinjam uma temperatura uniforme.

Quando uma temperatura uniforme for atingida, aplique de um a seis megapascais às amostras e mantenha por um minuto. O SMP vai fraturar. Se uma tensão maior for aplicada.

Aplique tensões menores para introduzir topografias com amplitudes menores. Após a aplicação da pressão, reduza a temperatura abaixo do TG usando a capacidade de resfriamento a água das placas de prensa. Quando a temperatura estiver abaixo de tg, remova a força aplicada antes de iniciar o experimento de cultura de células ativas.

A luz UV do gabinete de segurança biológica é usada para esterilizar as amostras. Disponha as amostras viradas para baixo em pratos estéreis sem tampas e acenda a luz ultravioleta por seis horas. Em seguida, vire as amostras para novos pratos estéreis na posição virada para cima.

Ligue a luz UV por mais seis horas. As amostras precisam ser equilibradas para um estado relativamente estável antes de serem plaqueadas com células. Coloque as amostras em uma placa de 96 poços e adicione 150 microlitros de crescimento completo.

Médio por poço. Coloque a placa em uma incubadora de 30 graus Celsius com 5%CO2 até atingir a recuperação parcial desejada. Para esta demonstração, as amostras são incubadas por 30 horas para produzir uma amplitude grande o suficiente para alinhar as células.

Uma vez alcançada a recuperação parcial, as amostras podem ser revestidas com células. Coloque as amostras em uma nova placa de 96 poços. Em seguida, adicione 150 microlitros de solução celular a cada uma das amostras aqui, C3 H 10 t e meia.

A maioria dos fibroblastos embrionários é usada a 20.000 células por mililitro. Para obter células isoladas, permita que as células se fixem e se espalhem na topografia temporária incubando a 30 graus Celsius por 9,5 horas. Em seguida, analise a morfologia celular antes da transição, removendo amostras e realizando coloração e imagem de fluorescência das amostras.

Este material exibe autofluorescência através da maioria dos quatro fluorados da faixa UV e visível na extremidade vermelha do espectro, como Alexa Fluor 6 47 são recomendados para reduzir o fundo para acionar a recuperação de amostras, mover a placa para uma incubadora de 37 graus Celsius e continuar a cultura por 19 horas. Isso permite que o material se recupere e as células adaptem sua morfologia à nova topografia. Após a incubação, aplique as colorações apropriadas, como fallin para imagens de actina filamentosa.

Como etapa final, as células podem ser visualizadas na nova topografia mostrada aqui é a memória de forma unidirecional em massa de uma única cura NOA 63. Repetido três vezes onde o asterisco indica início experimental curado. O NOA 63 é um sólido transparente e vítreo que possui excelentes propriedades de memória de forma.

Neste caso, o material foi curado e apresenta um TG uniforme de 51,1 graus Celsius, conforme determinado a partir do início da queda do módulo de armazenamento. A queda na deformação observada aqui ocorre no tg medido. Uma grande porcentagem da deformação aplicada de 4,7% foi fixada após a descarga de 20 graus Celsius, correspondendo a uma taxa de fixação de 89,3% A deformação fixa foi então recuperada a uma proporção de 84,4% em uma faixa de temperatura relativamente pequena durante o aquecimento.

O desempenho da memória de forma não mostrou deterioração até três ciclos, como evidenciado por todas as curvas seguindo quase exatamente o mesmo caminho. A amplitude da topografia temporária diminui com o tempo a 30 graus Celsius em 30 horas. A 30 graus Celsius.

A amplitude foi reduzida em aproximadamente 50% indicada aqui no tempo zero. Reduz mais 10% nas próximas 9,5 horas. Quando a recuperação é desencadeada pelo aumento da temperatura para 37 graus Celsius, a amplitude reduz para 0,5% da amplitude inicial dentro de 9,5 horas para a impressora usada e uma tensão de gravação de 4,9 megapascais.

Isso corresponde a uma mudança funcional de ranhuras de 13 micrômetros para uma superfície quase plana. Este polímero se recupera na faixa de temperatura de 30 a 37 graus em condições de cultura de células. Isso se deve à absorção de água do meio de cultura, o plástico da água dimensiona o polímero, o que reduz o tg, permitindo a recuperação em temperaturas abaixo do TG seco de 51 graus.

Um exemplo de comportamento celular controlado pelo uso de substratos ativos de cultura de células é uma mudança na organização do citoesqueleto em substratos sulcados temporários. Antes que a recuperação seja acionada, os microfilamentos de actina se alinham ao longo da direção das ranhuras. Após a recuperação por aumento de temperatura, os microfilamentos se reorganizaram e são orientados aleatoriamente.

Por outro lado, as amostras de controle que possuem ranhuras estáticas, planas ou estáticas não se reorganizam após o aumento da temperatura. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a geometria da câmara de cura, a temperatura de transição do polímero, o método de fixação por deformação e a composição do próprio polímero podem ser ajustados para alcançar a transição desejada em seu próprio experimento Seguindo este procedimento. Outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como como a expressão gênica muda em resposta à estimulação mecânica do substrato após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da mecanobiologia celular investigarem o citoesqueleto celular, o rearranjo e a física da matéria mole em duas dimensões. Obrigado pelo seu interesse em nosso trabalho e obrigado por assistir.