Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

"E-DNA" sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

O objetivo geral deste procedimento é preparar e empregar sensores eletroquímicos de DNA. Isso é feito primeiro reduzindo o DNA da sonda e, em seguida, limpando os eletrodos de ouro sobre os quais os sensores são construídos. O próximo passo do procedimento é depositar um tiol na monocamada auto-montada de ouro contendo a sonda, DNA, nos eletrodos de ouro.

Em seguida, a superfície do eletrodo de ouro é preenchida com mercaptoetanol. Para garantir que uma monocamada completa e bem formada seja criada, a etapa final do procedimento é empregar os sensores e amostras como tampão, urina, soro ou sangue. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as concentrações do analito por meio de mudanças na corrente de pico de onda quadrada ou volts de corrente alternada.

Essa técnica tem amplas implicações no diagnóstico molecular porque esses sensores podem detectar muitos biomarcadores e moléculas de drogas diferentes diretamente na urina ou no soro. O Sr. Aaron Rowe, um estudante de pós-graduação do meu grupo de pesquisa, demonstrará o procedimento. Ele será auxiliado por dois bolsistas de pós-doutorado que trabalham conosco, Dr. Ryan White e Dr. Andrew Bonham.

Para começar a comprar a sonda relevante, DNA de uma empresa de síntese de oligonucleotídeos personalizada, a sonda é modificada durante a síntese pela adição de um tiol de seis carbonos em suas cinco extremidades primárias e um azul de metileno ativo redox em suas três extremidades primárias dissolvem o DNA da sonda para produzir uma solução com uma tonalidade azul visível decorrente da porção azul de metileno. Verificar a sua concentração medindo a sua absorvância a 260 nanómetros, utilizando um espectrofotómetro para reduzir quaisquer ligações dissulfeto que possam estar presentes na solução de ADN da sonda. Combine um microlitro da solução de estoque de DNA da sonda com dois microlitros de solução TEP recém-preparada.

Misture delicadamente a solução resultante com uma pipeta. Incube a mistura por uma hora em um recipiente escuro e refrigerado. Durante a incubação, a solução azul deve tornar-se límpida, uma vez que a PTE reduz reversivelmente o azul de metileno.

Em seguida, dilua a solução de sonda de DNA reduzida com tampão PBS até a concentração desejada, que geralmente está entre 25 e 1000. A preparação do sensor molar começa com a combinação de pó Illumina de 0,05 mícron com água em um pano de polimento fino. Use este pano para polir um conjunto de eletrodos de disco de ouro pressionando a superfície dourada firmemente no pano úmido e movendo-os em um padrão de figura oito por aproximadamente três minutos por eletrodo.

Enxágue os eletrodos polidos com água deionizada após o enxágue. Mergulhe-os em tubos EOR cheios de água deionizada. Em seguida, sonice os eletrodos por cinco minutos para remover qualquer pó residual de Illumina.

Após a sonicação, coloque os eletrodos em uma solução de ácido sulfúrico 0,5 molar. Em seguida, coloque um contra-eletrodo de platina e um eletrodo de referência de prata e cloreto de prata na solução e conecte-os a um stat potencial. Em seguida, execute uma série de vol gramas para limpar eletroquimicamente as superfícies dos eletrodos.

Os detalhes desses procedimentos estão incluídos no suplemento escrito deste vídeo e em um documento de protocolos da natureza publicado anteriormente por este grupo. Em seguida, execute uma segunda limpeza eletroquímica em uma solução de KCL em ácido sulfúrico de acordo com o procedimento descrito anteriormente. Em seguida, organize um conjunto de dois tubos einor de mililitros no Iraque e encha cada um com 200 microlitros da solução de DNA da sonda.

A concentração do DNA da sonda nesta solução definirá a densidade com a qual o DNA da sonda é embalado na superfície do sensor e deve ser otimizada para cada novo tipo de sensor. Enxágue os eletrodos de disco de ouro com água deionizada. Em seguida, mergulhe-os na sonda relevante, solução de DNA em um tubo einor por uma hora.

Neste ponto, o DNA da sonda se ligará à superfície do eletrodo de ouro por meio da formação de um tiol na monocamada automontada de ouro. Depois de enxaguar novamente os eletrodos com água deionizada, mergulhe-os em dois milimolares de mercaptoetanol em um tubo einor. Isso preenche a superfície, garantindo uma monocamada completa e estável auto-montada.

Para evitar a evaporação, vede os eletrodos no tubo einor com paraform. Armazene os eletrodos imersos em um local escuro em temperatura ambiente por três horas a durante a noite para garantir a formação completa da monocamada automontada. Para preparar o sensor para uso após a incubação, lave-o com água deionizada e mergulhe-o em tampão por pelo menos 10 minutos.

A detecção de DNA com sensores é demonstrada usando uma fita de sonda de 17 nucleotídeos afixada a um eletrodo de ouro por meio de um tiol em suas cinco extremidades principais, a sonda contém um repórter redox azul de metileno em suas três extremidades principais. Quando a molécula da sonda hibridiza com uma fita de captura, a corrente eletroquímica produzida pelo sensor diminui. Para começar, enxágue um sensor novo com água deionizada e mergulhe-o em uma amostra em branco.

Para registrar o sinal de fundo, ele produz uma medição de onda quadrada de zero a 0,6 volts negativos com uma amplitude de 25 milivolts e uma tensão de passo de um milivolt. A frequência ideal da onda quadrada dependerá dos detalhes da arquitetura da sonda. Um pico arredondado deve aparecer em aproximadamente 0,25 volts negativos, o potencial redox do azul de metileno.

A altura da corrente de linha de base para este pico é proporcional à eficiência da transferência de elétrons entre o azul de metileno e o eletrodo de ouro. Salve esta medição de fundo. Em seguida, mova os eletrodos para uma solução que contenha a molécula de DNA alvo de interesse e permita que eles se equilibrem.

Alternativamente, o DNA alvo pode ser adicionado à solução na qual os sensores estão imersos. Colete um segundo volt de onda quadrada Graham. A altura do pico em 0,25 volts negativos mudará em relação à medição inicial de fundo.

A magnitude dessa mudança está relacionada à concentração do analito. São os principais dados de saída do sensor. Após a medição, calcule a mudança relativa do sinal.

Essa porcentagem geralmente é mais reprodutível do que medir a mudança absoluta na corrente, pois corrige as variações de área de superfície de eletrodo para eletrodo. Após a conclusão do procedimento, o sensor pode ser regenerado conforme descrito no procedimento escrito que acompanha a detecção de anticorpos. Usando os sensores, o DNA modificado com azul de metileno e tiol serve como uma fita de ancoragem e é anexado diretamente ao eletrodo de ouro.

Isso é então hibridizado com uma segunda fita de DNA de reconhecimento que foi conjugada covalentemente ao antígeno relevante. Isso é seguido pela adição de uma incubação com um alvo de anticorpo específico. Realizar a etapa de hibridização transferindo um sensor pré-fabricado para um tubo einor contendo 100 nano molares do reconhecimento relevante.

A fita de DNA em PBS incuba o sensor por uma hora. Em seguida, mergulhe em tampão PBS para remover qualquer sonda não hibridizada antes de passar para a solução em branco. Em seguida, coloque o sensor na solução em branco relevante e coloque um contador de platina e um eletrodo de referência de prata e cloreto de prata na solução.

Conecte os eletrodos ao stat de potencial. Execute a telemetria de vol de onda quadrada conforme descrito anteriormente, a frequência de onda quadrada ideal para a arquitetura de sonda específica usada neste exemplo é de 60 hertz. Um pico arredondado deve aparecer em torno de 0,25 volts negativos.

Salve esta medição de fundo. Transferir os eléctrodos para uma solução que contenha a substância a analisar a meta, após uma incubação de cinco a 60 minutos, recolher uma segunda onda quadrada volta. Se o anticorpo alvo estiver presente, o pico em 0,25 volts negativos diminuirá.

A magnitude dessa mudança está relacionada à concentração de anticorpos. Para demonstrar a detecção de pequenas moléculas, o DNA da sonda na superfície do sensor é um aptr. Um aptr é uma molécula de DNA ou RNA que foi selecionada in vitro para se ligar a um analito molecular específico.

Os aptâmeros geralmente podem ser reprojetados para alterar sua estrutura. Mediante tal encadernação. O aptima empregado aqui muda sua confirmação ao se ligar à droga cocaína.

Para começar, enxágue um sensor novo com água deionizada e mergulhe-o em uma amostra em branco, sem o alvo, para registrar o sinal de fundo que ele produz. Em seguida, coloque um contador de platina e uma referência de prata e cloreto de prata na solução. Conecte os eletrodos aos fios de um stat de potencial, execute a telemetria de onda quadrada ou de abóbada de corrente alternada.

Como foi descrito anteriormente, a frequência de onda quadrada ideal para a arquitetura de sonda específica usada aqui é de 60 hertz. Novamente, um pico arredondado deve aparecer em torno de 0,25 volts negativos e deve ser salvo como a medição de fundo. Em seguida, transfira os eletrodos para uma solução contendo o analito alvo.

Após uma 32ª incubação, colete uma segunda onda quadrada ou volt de corrente alternada Graham. A altura do pico em menos 0,25 volts mudará. A magnitude dessa mudança está relacionada à concentração do analito alvo.

Quando biossensores eletroquímicos de DNA são usados para detectar DNA com a arquitetura da sonda descrita aqui, o sinal deve diminuir em pelo menos 60%Quando equilibrado com um alvo de 200 nanomolares após três breves enxágues em água deionizada, o sinal deve retornar a 0,1 a 5% de seu valor original. Da mesma forma, quando os sensores descritos aqui são usados para detectar anticorpos, o sinal deve diminuir entre 40 e 80% após a ligação do anticorpo. Por outro lado, os sensores baseados em aptima para a detecção de cocaína exibem um aumento de sinal de até 200% após a ligação de pequenas moléculas.

A magnitude dessa mudança depende da frequência de interrogação eletroquímica e da cobertura da superfície nos sensores. Para o sensor de cocaína. Uma cobertura de superfície relativamente baixa é melhor Uma vez dominado, a fabricação e o uso desses sensores podem ser realizados em um único dia.

É importante lembrar ao realizar este procedimento que parâmetros como frequência quadrada ou densidade da sonda na superfície do eletrodo afetam muito o desempenho do sensor. Depois de assistir a este vídeo, você saberá como preparar eletroquímicos, biossensores de DNA, biossensores aptâmeros e biossensores de andaime, e saberá como usá-los para uma ampla variedade de medições básicas. Os únicos perigos significativos neste protocolo são o uso de ácido sulfúrico, que obviamente é uma proteção cáustica para os olhos e as luvas são obrigatórias.