Name: Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Aprenda a fabricar biossensores eletroquímicos de DNA para detecção reagentless de ácidos nucleicos, proteínas e pequenas moléculas em amostras biológicas complexas como sangue e soro.

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Este trabalho foi financiado por uma subvenção (OPP1015402) da Fundação Bill e Melinda Gates Foundation através da Iniciativa Grande Challenges Explorations, e pelo NIH por meio de doações GM062958-01 e 2R01EB002046. Este trabalho foi realizado em parte sob os auspícios do Departamento de Energia dos EUA por Lawrence Livermore National Laboratory no âmbito do contrato DE-AC52-07NA27344.

1. Montando o Palco <ol><li> Compra relevante, DNA sonda quimicamente modificados de uma empresa de costume oligonucleotídeo síntese, tais como Biosearch Technologies (Novato, CA) ou Certified Midland (Midland, TX). A sonda é modificado durante a síntese pela adição de um tiol C6 em sua extremidade 3'-e um azul de metileno redox-ativo em sua extremidade 5'-. </li><li> Dissolver o DNA da sonda em tampão fosfato salina pH 7,4 para uma concentração de 200 mM e verificar a sua concentração, medindo sua absorbância a 260 nm usando um espectrofotômetro. Devido à molécula de azul de metileno na sonda de DNA a solução deve ter uma coloração azul visível. </li><li> Recém preparar 1 mL de uma solução de 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP em água destilada deionizada (DI-água). Em nossa experiência, essas soluções TCEP permanecem frescos por uma semana quando armazenado no escuro a 4 ° C. </li><li> Para reduzir qualquer pontes dissulfeto que podem estar presentes na solução de DNA sonda, combine 1 mL da solução-mãe sonda de DNA com 2 mL da solução TCEP e misture delicadamente com uma pipeta. Incubar a mistura por uma hora em um recipiente escuro e refrigerado. A solução, inicialmente azul deve ficar claro como o TCEP reversivelmente reduz o azul de metileno. Se a solução não se torna claro, repita o procedimento usando uma solução de TCEP frescos ou, possivelmente, à temperatura ambiente. </li><li> Depois de uma hora diluir a solução sonda reduzida DNA com 1 mL de tampão, o que irá diluir a uma concentração de 200nM. Mais tarde, você vai incubar um conjunto de eletrodos de disco de ouro em 200 porções mL desta solução diluída sonda. </li><li> Recém preparar pelo menos 2 mL de 2mm mercaptohexanol em tampão fosfato salino. </li></ol> 2. Preparação de sensor <ol><li> Combine 0,05 micron alumina em pó com água em um pano de polimento fino. Polonês um conjunto de eletrodos de disco de ouro (CH Instruments, Austin, TX), pressionando a superfície de ouro firmemente o pano molhado, e movê-los em uma figura oito padrão por aproximadamente três minutos por eletrodo. </li><li> Enxágüe os eletrodos polido com DI-água e mergulha-as em tubos Eppendorf preenchido com o mesmo. Sonicado por cinco minutos para remover qualquer pó de alumina residual. </li><li> Colocar os eletrodos em uma solução 0,5 M de ácido sulfúrico, anexá-los a um potenciostato, juntamente com um contador de platina e prata / cloreto de prata eletrodo de referência, e executar uma série de voltamogramas para oxidar, reduzir e eletroquimicamente limpa suas superfícies. Seguindo essa executar uma limpeza eletroquímica segundo de uma solução de 0,01 M KCl em 0,1 M de ácido sulfúrico. Os detalhes destes procedimentos de limpeza podem ser encontrados em nosso artigo da Nature Protocols 1, e no suplemento a este vídeo. </li><li> Organizar um conjunto de 2 tubos Eppendorf mL em um rack e preencha cada um com 200 mL da solução de DNA sonda. A concentração do DNA sonda nesta solução irá definir a densidade com que a sonda DNAs pacote na superfície do sensor. Desempenho do sensor é fortemente dependente da densidade de sonda, com a densidade ideal varia de uma arquitetura de sensores para a próxima. A concentração sonda utilizada nesta etapa devem, portanto, ser otimizados para cada novo tipo de sensor 2. Para as arquiteturas sonda temos investigado até o momento, as concentrações de DNA sonda que empregamos nesta faixa de passo de 15 nM de 2 m, com 200 nM de ser um valor típico. </li><li> Enxágüe os eletrodos de disco de ouro com DI-água, e depois mergulha-as na solução de relevantes sonda de DNA em um tubo Eppendorf durante uma hora. Neste ponto, o DNA sonda irá anexar à superfície do eletrodo de ouro através da formação de uma monocamada auto-tiol-on-ouro montado. </li><li> Enxágüe os eletrodos com água DI, mergulha-as na 2mM mercaptohexanol em um tubo Eppendorf e armazená-los em um lugar escuro por 3 horas durante a noite à temperatura ambiente para garantir a formação completa da monocamada auto montado. Esta etapa incorpora o mercaptohexanol como parte de uma monocamada mista para garantir a formação de uma monocamada estável. Para evitar a evaporação que você pode querer fechar o eletrodo dentro do tubo Eppendorf com parafilme. Sensores podem ser armazenados nessa solução por vários dias, se necessário. </li><li> Quando você está pronto para usar o sensor, lave-o com DI-água e, em seguida, mergulhe-o em buffer de pelo menos 10 minutos. Sensores destinados a detecção de anticorpos também deve ser imerso em uma solução de 100 nM da vertente reconhecimento relevantes antes do uso, seguida por uma rápida extremamente enxaguar com buffer. </li></ol> 3. Teste do sensor, detecção de DNA <ol><li> Neste protocolo, a 17 nucleotídeos vertente sonda está afixada a um eletrodo de ouro. Tem um azul de metileno repórter redox em sua extremidade 3'-(Figura 1). Quando a molécula sonda hibridiza com uma fita de captura, a corrente através do circuito do sensor diminui. </li><li> Enxágüe um sensor fresco com DI-água e mergulhe em um espaço em brancoamostra sem o alvo, a fim de gravar o sinal de fundo que produz. Ligue o sensor ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato. Coloque um contra-eletrodo de platina e um de prata / prata eletrodo de referência de cloreto na solução. </li><li> Executar uma medição de onda quadrada de 0 a -0,6 V com uma amplitude de 25 mV e um tamanho de passo de 1mV. A freqüência da onda quadrada ideal vai depender dos detalhes da arquitetura sonda 2,3; para as arquiteturas sonda temos empregado os valores ideais são tipicamente na faixa de 60 a 600 Hz. Você deverá ver um pico arredondado em aproximadamente -0,35 V, o potencial redox do azul de metileno (o potencial de pico pode mudar ligeiramente, dependendo do pH precisa da sua solução de teste). A altura da linha de base atual para este pico é proporcional à eficiência de transferência de elétrons entre o azul de metileno eo eletrodo de ouro (Figura 2). Salve esta medida de fundo. </li><li> Mover os eletrodos a uma solução que contém a molécula de DNA alvo de interesse, equilibrar (5 a 120 min, dependendo do tamanho, estrutura e concentração do target4, 5) e recolher uma voltammagram segunda onda quadrada. A altura do pico em -0,35 V vai mudar a partir da medição de fundo inicial,. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração do analito. É a saída de dados principal deste sensor (Figura 3). </li><li> Medir a mudança de sinal, a diminuição ou aumento do sinal em relação ao pico de fundo, muitas vezes é mais reprodutível de medir a variação absoluta na corrente, pois isso corrige as variações de área de superfície do eletrodo. Para fazer isso, a diferença entre a corrente de pico ea corrente de pico de fundo são divididos pelo pico de fundo actual. </li></ol> 4. Regeneração Sensor <ol><li> Uma vez que suas medições estão completas, mova o sensor em um recipiente cheio de água DI por 30 s, ou esguicho-lo com um fluxo constante de DI-água por 30 s. Repita isso duas vezes mais com água deionizada fresco. Nota: alguns analitos são resistentes a esta abordagem, para eles tentar agressivo de lavagem em 6 de cloridrato de guanidina M ou etanol a 70%. </li><li> Coloque o sensor de volta em uma solução onde as medições serão feitas. Dentro de um minuto, a altura do pico deveria ter retornado ao seu valor original. É interessante notar que esses sensores apresentam frequentemente uma mudança de sinal ligeiramente maior durante seu primeiro teste e ciclo de regeneração, e os resultados altamente consistentes durante os ciclos subseqüentes 6. </li></ol> 5. Teste do sensor, a detecção de anticorpos <ol><li> Neste protocolo, a sonda de DNA-azul de metileno e tiol-modificadas utilizados nestes sensores serve como uma "âncora" vertente 7. Ele está ligado diretamente ao eletrodo de ouro. Este é então hibridizado com uma segunda vertente "reconhecimento", o DNA que foi covalentemente conjugado com o antígeno relevante (Figura 4). Tivemos sorte com casas síntese comerciais, tais como Biosearch Technologies e Panagene, para a síntese de DNA necessária antígeno-quimeras. A hibridação é realizada através da transferência de um sensor de pré-fabricados em um tubo Eppendorf contendo 100 nM da vertente relevante o reconhecimento de DNA em PBS por 1 hora. </li><li> Coloque o sensor na solução relevantes em branco. Anexá-lo ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato e colocar um contra-eletrodo de platina e prata / cloreto de prata eletrodo de referência na solução. </li><li> Executar voltametria de onda quadrada, como descrito acima. Para a arquitetura sonda especial que temos aqui empregada a freqüência de onda ideal quadrado é de 60 Hz. Você deverá ver um pico arredondado em torno de -0,35 V. Salve esta medida de fundo. </li><li> Transferir os eletrodos a uma solução contendo o analito alvo, incubar por 5 a 60 min, e cobrar uma voltammagram segunda onda quadrada. Se o anticorpo alvo é apresentar o pico em -0,35 V irá diminuir. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração de anticorpos. </li></ol> 6. Teste do sensor, detecção de pequenas moléculas <ol><li> Neste caso, a molécula sonda na superfície do sensor é um aptamer, uma molécula de RNA ou DNA que foi selecionado in vitro para vincular um analito específico molecular, que muda sua estrutura (dobras) sobre a ligação ao seu analito alvo 8,9 ( Figura 5). Aqui nós empregamos uma cocaína de ligação aptamer DNA, desenvolvida pelo laboratório 10,11 Stojanovic. </li><li> Enxágüe um sensor fresco com DI-água e mergulhe em uma amostra em branco sem o alvo, a fim de gravar o sinal de fundo que produz. Ligue o sensor ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato. Coloque um contador de platina e um de referência de cloreto de prata / prata na solução. </li><li> Executar voltametria de onda quadrada, como descrito acima. Para a arquitetura sonda especial que temos aqui empregada a freqüência da onda quadrada é ótima 200Hz (Mas 60 Hz também funciona). Você deverá ver um pico arredondado em torno de -0,35 V. Salve esta medida de fundo. </li><li> Transferir os eletrodos a uma solução contendo o analito alvo, incubar por 5 min ~, e cobrar uma voltammagram segunda onda quadrada. A altura do pico em -0,35 V vai mudar. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração do analito alvo. Se você não puder obter uma amostra de cocaína, procaína, cuja utilização é regulamentada, pode ser usado como um substituto. </li></ol> 7. Resultados representativos: Quando usado para a detecção do DNA usando a arquitetura de primeira, o sinal deve diminuir em pelo menos 60%, quando equilibrada em 200 nM alvo. Depois de três lavagens em água deionizada breve, o sinal deve retornar muito perto (dentro de 0,1-5%) ao seu valor original. Sensores de detecção de anticorpos devem ser submetidos a uma diminuição do sinal de 40 a 80%. Aptamer baseado em sensores para a detecção de cocaína apresentam um aumento de sinal de até 200%, dependendo da freqüência e cobertura da superfície na qual eles operam. Para o sensor de cocaína, uma cobertura de superfície de baixa é o melhor 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Detecção de DNA com um biosensor eletroquímico DNA. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura Captura de tela 2. Mostrando o sinal produzido por um biosensor E-DNA durante a voltametria de onda quadrada. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura Captura de tela 3. Mostrando os sinais produzidos por um biosensor E-DNA durante a voltametria de onda quadrada, antes e depois de hibridação com um analito. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Detecção de anticorpos com um biosensor andaime. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Detecção de cocaína ou procaína com um biosensor aptamer eletroquímica. <table border="1"><tbody><tr><td> Personalizado Oligo </td><td> Seqüência </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Probe linear de DNA (LP17) </td><td> 5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 ' </td><td> HPLC purificada, pode ser encomendado com SS </td></tr><tr><td> DNA do analito alvo </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Sem modificações </td></tr><tr><td> Reconhecimento Strand </td><td> 5'-antígeno-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 ' </td><td></td></tr><tr><td> Andaime Anchor </td><td> 5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7-MB </td><td> HPLC purificada, pode ser encomendado com SS </td></tr><tr><td> A4 cocaína Aptamer </td><td> 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 ' </td><td> HPLC purificada, pode ser encomendado com SS </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Sonda e seqüências de DNA alvo.

<ol><li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+electrode-immobilized%2C+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li>
<li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Probe+Length%2C+Probe+Geometry%2C+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li>
<li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-Based+Electrochemical+Biosensors%3A+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li>
<li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Specific%2C+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood%2C+Soil%2C+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless%2C+Reusable+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li>
<li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein%3FSmall+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li>
<li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electronic%2C+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid%2C+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li>
<li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Prada, P. de, Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li>
<li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Reusable%2C+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li>
<li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Specificity%2C+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li>
<li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li>
<li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless%2C+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li>
<li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li>
<li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%2C+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic%2C+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li>
</ol>

Uma observação importante é que nenhum dos experimentos descritos acima irá funcionar corretamente a menos que os eletrodos tenham sido adequadamente limpos. Aqui está um guia para o nosso procedimento de limpeza eletroquímica. Ao trabalhar com potentiostats CH Instruments, corremos estes passos limpeza utilizando um conjunto de três programas de macro. Fase Zero (E-clean O) Mergulhar os eléctrodos na 0.5MH 2 SO 4 e conectá-los para os eletrodos de trabalho de um potenciostato. Também anexar e mergulhe uma referência de Ag / AgCl e contra eletrodo de platina. Comece com uma etapa de oxidação (2 V por 5 s) e, em seguida, uma etapa de redução (0,35 V durante 10 s). Phase One (E-clean 1) Iniciar a oxidação e redução de varreduras nas mesmas condições ácidas (0.5MH 2 SO 4) 0,35-1,5 V (20 scans em uma taxa de varredura de 4 V / s e um intervalo de amostragem de 0,01 V, seguido por quatro varreduras em uma taxa de varredura de 0,1 V / s e um intervalo de amostragem de 0,01 V). Fase Dois (E-clean 2) Realizar um outro conjunto de eletroquímica de oxidação e redução de scans em condições ácidas (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4), abrangendo quatro diferentes faixas de potencial (tudo feito por 10 segmentos em uma taxa de varredura de 0,1 V s 1 e um intervalo de amostragem de 0,01 V ): (i) faixa de potencial 0,2-0,75 V; (ii) alcance potencial 0,2-1,0 V, (iii) faixa de potencial de 0,2-1,25 V; (iv) potencial gama 0,2-1,5 V. Muitos tipos de eletrodos de ouro podem ser usados ​​para realizar esses experimentos. Além de eletrodos de disco de ouro, como aqueles empregados aqui, temos tido sucesso com superfícies de ouro microfabricated, fio de ouro, e ouro em placas de circuito impresso. Juntamente com os sensores descritos neste documento, muitas outras arquiteturas biosensor eletroquímico DNA têm sido relatados. Isto inclui sensores com uma pseudoknot 12, fio triplo 13, 14 sanduíche, sanduíche super-15, ou triplex arquitetura 16. No futuro, esperamos que estes sensores serão utilizados no ponto de diagnósticos de cuidados médicos. Eles foram integrados com sucesso em vários dispositivos microfluídicos 17,18, e oferecem muitas vantagens sobre os sistemas de detecção óptica analito. Em particular, esses sensores podem funcionar em turvas, opticamente denso e altamente auto-fluorescentes amostras.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Eletrodos de ouro Disk </td><td> CH Instruments </td><td> CHI101 </td><td> Podem ser reutilizados </td></tr><tr><td> DNA Probe sintético </td><td> Biosearch Technologies </td><td> Personalizado </td><td></td></tr><tr><td> DNA alvo sintético </td><td> Sigma Genosys </td><td> Personalizado </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> Armazenar em local escuro e fresco </td></tr><tr><td> Eletrodo de platina </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Podem ser reutilizados </td></tr><tr><td> Ag / AgCl de referência </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Podem ser reutilizados </td></tr><tr><td> Pano de polimento </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Polonês Alumina </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão salina tampão fosfato, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instruments 605A </td><td> CH Instruments </td><td> 605A </td><td> Usar qualquer potenciostato </td></tr><tr><td> Serum bezerro recém-nascido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Armazenadas congeladas </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Usar qualquer UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Armazenadas congeladas </td></tr><tr><td> Cocaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA Licença Obrigatório </td></tr><tr><td> Procaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Substituto para a cocaína </td></tr><tr><td> Anticorpos Anti-Flag </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de eletroquímica-dna biossensores para detecção reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Como a medicina é praticada atualmente, os médicos enviar amostras para um laboratório central para testes e, portanto, deve esperar horas ou dias para receber os resultados. Muitos pacientes seriam melhor servidos pela rápida, testes de cabeceira. Para este fim o nosso laboratório e outros desenvolveram uma plataforma versátil, reagentless biosensor que suporta o quantitativo, reagentless, detecção eletroquímica de ácidos nucléicos (DNA, RNA), proteínas (incluindo anticorpos) e analitos pequenas moléculas não transformados diretamente em amostras clínicas e ambientais. Neste vídeo, demonstramos a preparação e utilização de biossensores várias neste &quot;E-DNA&quot; de classe. Em particular, podemos fabricar e demonstrar sensores para a detecção de uma seqüência de DNA alvo em uma mistura de reação em cadeia da polimerase, um anticorpo HIV-específicos e da cocaína de drogas. O procedimento de preparação requer apenas três horas de hands-on esforço seguido por uma incubação durante a noite, e seu uso exige apenas alguns minutos.

&quot;E-DNA&quot; sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

Da forma como a medicina é praticada atualmente, os médicos enviam espécimes para um laboratório central para a realização de testes e, portanto, devem aguardar horas ou dias para receber os resultados. ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar e utilizar sensores eletroquímicos de DNA. Isso é realizado primeiramente reduzindo o DNA sonda e, em seguida, limpando os eletrodos de ouro sobre os quais os sensores são construídos. O próximo passo do procedimento consiste em depositar uma monocamada auto-organizada de tiol sobre ouro contendo a sonda, DNA, nos eletrodos de ouro.Em seguida, a superfície do eletrodo de ouro é preenchida com mercaptoetanol. Para garantir a formação de uma monocamada completa e bem organizada, a etapa final do procedimento consiste em utilizar os sensores e amostras, como tampão, urina, soro ou sangue. Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram as concentrações do analito por meio de alterações na corrente de pico de onda quadrada ou volts de corrente alternada.Essa técnica tem implicações abrangentes em diagnósticos moleculares porque esses sensores podem detectar diversos biomarcadores e moléculas de fármacos diretamente na urina ou no soro. O Sr. Aaron Rowe, um estudante de pós-graduação do meu grupo de pesquisa, demonstrará o procedimento. Ele será auxiliado por dois pesquisadores pós-doutorandos que trabalham conosco, o Dr. Ryan White e o Dr. Andrew Bonham.Para começar, adquira a sonda específica e o DNA de uma empresa de síntese personalizada de oligonucleotídeos; a sonda é modificada durante a síntese pela adição de um tiol de seis carbonos em sua extremidade cinco prima e um grupo de azul de metileno redox-ativo em sua extremidade três prima. Dissolva o DNA da sonda para obter uma solução com uma coloração azulada visível proveniente do grupo de azul de metileno. Verifique sua concentração medindo a absorbância em 260 nanômetros, utilizando um espectrofotômetro. Para reduzir quaisquer ligações dissulfeto que possam estar presentes na solução de DNA da sonda, combine um microlitro da solução estoque de DNA da sonda com dois microlitros de solução TEP recém-preparada.Misture suavemente a solução resultante com uma pipeta. Incube a mistura por uma hora em um recipiente escuro e refrigerado. Durante a incubação, a solução azul deve tornar-se transparente, já que o TEP reduz reversivelmente o azul de metileno.Em seguida, dilua a solução do sonda de DNA reduzida com tampão PBS até a concentração desejada, que geralmente está entre 25 e 1000. A preparação do sensor ano molar começa com a mistura de pó Illumina de 0,05 mícrons com água em um pano de polimento fino. Use este pano para polir um conjunto de eletrodos de disco de ouro pressionando firmemente a superfície de ouro contra o pano úmido e movendo-os em um padrão de oito durante aproximadamente três minutos por eletrodo.Lave os eletrodos polidos com água desionizada após a lavagem. Mergulhe-os em tubos EOR contendo água desionizada. Em seguida, sonique os eletrodos por cinco minutos para remover qualquer resíduo de pó Illumina.Após a sonicação, coloque os eletrodos em uma solução de ácido sulfúrico 0,5 molar. Em seguida, coloque um eletrodo de platina como eletrodo auxiliar e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata na solução e conecte-os a um potenciostato. Em seguida, realize uma série de voltamogramas para limpar eletroquimicamente as superfícies dos eletrodos.Os detalhes desses procedimentos estão incluídos no suplemento escrito deste vídeo e em um artigo do Nature Protocols publicado anteriormente por este grupo. Em seguida, realize uma segunda limpeza eletroquímica em uma solução de KCl em ácido sulfúrico, conforme o procedimento descrito anteriormente. A seguir, organize um conjunto de tubos Eppendorf de dois mililitros no Iraque e preencha cada um com 200 microlitros da solução de DNA sonda.A concentração da sonda, DNA nesta solução, definirá a densidade com que o DNA da sonda é empacotado na superfície do sensor e deve ser otimizada para cada novo tipo de sensor. Enxágue os eletrodos de disco de ouro com água desionizada. Em seguida, imerja-os na solução apropriada da sonda de DNA em um tubo einor por uma hora.Neste ponto, o DNA sonda se ligará à superfície do eletrodo de ouro por meio da formação de uma monocamada auto-organizada de tiol sobre ouro. Após enxaguar novamente os eletrodos com água desionizada, imerja-os em mercaptoetanol dois milimolar em um tubo einor. Esse passo preenche o restante da superfície, garantindo uma monocamada auto-organizada completa e estável.Para evitar evaporação, selar os eletrodos no tubo einor com paraform. Armazenar os eletrodos imersos em local escuro à temperatura ambiente por três horas até a noite seguinte para garantir a formação completa da monocamada auto-organizada. Para preparar o sensor para uso após a incubação, lavar o sensor com água desionizada e, em seguida, mergulhá-lo em tampão por pelo menos 10 minutos.A detecção de DNA com sensores é demonstrada utilizando uma fita sonda de 17 nucleotídeos ligada a um eletrodo de ouro por meio de um tiol na sua extremidade cinco prima; a sonda contém um marcador redox de azul de metileno na sua extremidade três prima. Quando a molécula sonda hibridiza com uma fita de captura, a corrente eletroquímica produzida pelo sensor diminui. Para começar, lave um sensor novo com água desionizada e imerja-o em uma amostra em branco.Para registrar o sinal de fundo, realize uma medida de onda quadrada de zero a -0,6 volts com uma amplitude de 25 milivolts e uma tensão de passo de um milivolt. A frequência ideal da onda quadrada dependerá dos detalhes da arquitetura da sonda. Um pico arredondado deve aparecer em aproximadamente -0,25 volts, o potencial redox do azul de metileno.A altura da corrente de base até este pico é proporcional à eficiência da transferência de elétrons entre o azul de metileno e o eletrodo de ouro. Salve esta medida de fundo. Em seguida, transfira os eletrodos para uma solução que contenha a molécula de DNA alvo de interesse e permita que eles atinjam o equilíbrio.Alternativamente, o DNA alvo pode ser adicionado à solução na qual os sensores estão imersos. Realize uma segunda medida de voltametria com onda quadrada. A altura do pico em -0,25 volts mudará em relação à medição inicial do fundo de escala.A magnitude dessa alteração está relacionada à concentração do analito. É a principal saída de dados do sensor. Após a medição, calcule a variação relativa do sinal.Esta porcentagem é frequentemente mais reprodutível do que a medição da alteração absoluta na corrente, pois corrige as variações entre eletrodos na área da superfície. Após a conclusão do procedimento, o sensor pode ser regenerado conforme descrito no procedimento escrito acompanhante para detecção de anticorpos. Usando os sensores, o azul de metileno e o DNA modificado com tiol servem como uma fita âncora e são ligados diretamente ao eletrodo de ouro.Em seguida, realiza-se a hibridização com uma segunda fita de reconhecimento de DNA que foi conjugada covalentemente ao antígeno relevante. Em seguida, adiciona-se uma incubação com um anticorpo específico para o alvo. Realize a etapa de hibridização transferindo um sensor pré-fabricado para um tubo einor contendo 100 nano molar da sequência de reconhecimento relevante.Incube o sensor por uma hora com a fita de DNA em PBS. Em seguida, imerja o sensor em tampão PBS para remover qualquer sonda não hibridizada antes de transferi-lo para a solução em branco. A seguir, coloque o sensor na solução em branco apropriada e insira um eletrodo de platina como contra-eletrodo e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata na solução.Conecte os eletrodos ao potenciostato. Realize a voltametria com onda quadrada conforme descrito anteriormente; a frequência ideal da onda quadrada para a arquitetura específica da sonda utilizada neste exemplo é de 60 hertz. Um pico arredondado deve aparecer em torno de menos 0,25 volts.Salve esta medição de fundo. Transfira os eletrodos para uma solução contendo o analito-alvo após uma incubação de cinco a 60 minutos e colete um segundo voltamograma de onda quadrada. Se o anticorpo-alvo estiver presente, o pico em menos 0,25 volts diminuirá.A magnitude dessa alteração está relacionada à concentração do anticorpo. Para demonstrar a detecção de moléculas pequenas, o DNA sonda na superfície do sensor é um aptâmero. Um aptâmero é uma molécula de DNA ou RNA que foi selecionada in vitro para ligar um analito molecular específico.Os aptâmeros muitas vezes podem ser reengenharizados para alterar sua estrutura. Após essa ligação. O aptima empregado aqui muda sua conformação ao se ligar à droga cocaína.Para começar, enxágue um sensor novo com água desionizada e imerja-o em uma amostra em branco, sem o alvo, a fim de registrar o sinal de fundo que ele produz. Em seguida, coloque um contra-eletrodo de platina e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata na solução. Conecte os eletrodos aos cabos de um potenciostato e realize a telemetria de onda quadrada ou de corrente alternada.Como foi descrito anteriormente, a frequência de onda quadrada ideal para a arquitetura específica da sonda utilizada aqui é de 60 hertz. Novamente, um pico arredondado deve aparecer em torno de menos 0,25 volts e deve ser salvo como a medição de fundo. Em seguida, transfira os eletrodos para uma solução contendo o analito-alvo.Após uma 32ª incubação, colete um segundo voltagrama de onda quadrada ou corrente alternada. A altura do pico em menos 0,25 volts irá mudar. A magnitude dessa alteração está relacionada à concentração do analito-alvo.Quando sensores eletroquímicos de DNA são usados para detectar DNA com a arquitetura de sonda descrita aqui, o sinal deve diminuir em pelo menos 60%. Após equilíbrio com um alvo de 200 nanomolar, seguido de três lavagens breves em água deionizada, o sinal deve retornar a um valor entre 0,1 e 5% do seu valor original. De forma semelhante, quando os sensores descritos aqui são usados para detectar anticorpos, o sinal deve diminuir entre 40 e 80% após ligação do anticorpo. Por outro lado, sensores baseados em aptamas para detecção de cocaína exibem um aumento do sinal de até 200% após ligação de moléculas pequenas.A magnitude dessa alteração depende da frequência de interrogatório eletroquímico e da cobertura da superfície nos sensores. Para o sensor de cocaína, uma cobertura de superfície relativamente baixa é a melhor. Uma vez dominada, a fabricação e o uso desses sensores podem ser realizados em um único dia.É importante lembrar, ao realizar este procedimento, que parâmetros como a frequência da onda quadrada ou a densidade da sonda na superfície do eletrodo afetam grandemente o desempenho do sensor. Após assistir a este vídeo, você saberá como preparar biossensores eletroquímicos, biossensores de DNA, biossensores de aptâmeros e biossensores com estruturação, e saberá como utilizá-los para uma ampla variedade de medições básicas. Os únicos riscos significativos neste protocolo são o uso de ácido sulfúrico, que obviamente é cáustico, sendo obrigatórios proteção ocular e luvas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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