Name: Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda o método VIGS mediado por Agrobacterium para silenciamento gênico em algodão usando vetores TRV. Esta técnica permite estudar funções gênicas através do fenótipo albino observável em plântulas.

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Somos gratos aos Drs.. Dinesh Kumar-SP e Yule Liu para TRV-VIGS vetores, e as Dras. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr e Bayer CropScience para o fornecimento de sementes de algodão. Este trabalho foi financiado pela NSF para LS e NIH para PH

1. Crescer mudas de algodão <ol><li> Semear as sementes do algodão herbáceo (Gossypium hirsutum) variedade Fibermax 832, PhytoGen 425RF, PhytoGen 480WR e Deltapine 90 em vasos (7 cm de diâmetro) contendo Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Manter os vasos em uma bandeja coberta com uma cúpula de plástico a 23 ° C, 120 μE m -2 S luz -1, com um fotoperíodo 12 horas horas light/12 escuros em sala de crescimento. </li><li> Remova a cúpula quando dois cotilédones têm surgido. </li><li> Aproximadamente duas semanas depois, use as plantas com dois cotilédones totalmente expandidos para o ensaio VIGS. Nesta fase, as folhas verdade ainda não surgiram (Figura 1). </li></ol> 2. Construir vector VIGS carregando GrCLA1 ​​gene <ol><li> Amplificar o Cloroplastos alterados 1 gene de algodão (GrCLA1) por PCR com primers GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'e GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' a partir de uma biblioteca de cDNA de G. tecidos raimondii folha. </li><li> Digerir os produtos de PCR GrCLA1 ​​com EcoRI e KpnI e inserir em pYL156 (pTRV-RNA2) vetor por ligadura. </li><li> Tela os clones em placas LB ágar contendo 50 mcg / mL de canamicina. Verifique se as construções de digestão por enzimas de restrição e seqüenciamento. </li><li> Transformar o plasmídeo em Agrobacterium tumefaciens GV3101 por eletroporação e recuperar em meio líquido LB a 28 ° C. Selecione o transformantes em placas com LB + canamicina (50 mg / mL) + Gentamicina (25 mg / mL). As bactérias podem ser armazenados em glicerol 25% a -80 ° C para o uso a longo prazo. </li></ol> 3. Executar VIGS inoculação <ol><li> Três dias antes da inoculação, raia stocks glicerol congelados de Agrobacterium tumefaciens carregando pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (vetor sozinho) e pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​em placas de LB ágar contendo 50 mcg / mL de canamicina e 25 mg / mL de gentamicina. Incubar as placas a 28 ° C por 24 horas. </li><li> Dois dias antes da infiltração VIGS, escolher uma única colônia de cada construção das placas acima e inocular-lo em 5 mL de meio LB suplementado com 50 mg / mL de canamicina e 25 mcg / ml de Gentamicina; Incubar a cultura bacteriana em 28 ° C para a noite em um tambor de rolo a uma velocidade de 50 rpm. </li><li> Transferir a cultura acima para um frasco com 50 ml de meio LB suplementado com 50 mg / mL de canamicina e 25 mcg / ml de gentamicina, acrescido de 10 mM MES (2 - (4 morfolino) etano-sulfônico) e 20 mM acetosyringone. Crescer a cultura a 28 ° C para a noite em uma coqueteleira com uma velocidade de 50 rpm. </li><li> No dia seguinte, girar as células agro-bacteriana a 4000 rpm por 5 minutos; re-suspender a cultura no buffer de infiltração contendo 10 mM MgCl 2, 10 mM MES e 200 acetosyringone mM. Ajustar o OD 600 da cultura para 1,5. </li><li> Deixe a cultura no banco em temperatura ambiente por 3 horas. </li><li> Antes de infiltração Agrobacterial, soco a parte de baixo cotilédones de plantas de algodão com uma agulha G 25 sem perfurar através dos cotilédones. Um ou dois furos (depende da maciez do tecido) foram perfurados em cada seção do cotilédone (Figura 2). </li><li> Mix suspensão cultura Agrobacterial de pYL192 (TRV): RNA1 e pYL156 (TRV): RNA2 ou pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​na proporção de 1:1; mão infiltrar a mistura do lado de cotilédones através dos sites ferindo usando a 1 mL seringa sem agulha (Figura 3). </li><li> Cobrir as plantas com uma cúpula de plástico e deixe as plantas se infiltraram em temperatura ambiente sob condições de luz fraca para pernoite. </li><li> Transferência de plantas para sala de crescimento com a temperatura de 23 ° C, 120 μE m -2 S luz -1 com um ciclo de 12 horas horas de luz / 12 escuro. </li></ol> Nota: VIGS funciona quando as plantas estão sob ou 23 ° C ou em estufa (25-28 ° C). Quando a temperatura é relativamente baixa (23-25 ​​° C), é mais fácil para inoculação e fenótipo é mais uniforme em comparação com maior (28-30 ° C) ou temperatura oscilou. Cobrindo as plantas com uma cúpula também faz VIGS mais eficiente. <ol start="10"><li> Examine o fenótipo silenciar a 7 ~ infiltração pós 8 dias. As folhas de plantas verdade silenciada por pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​começou a exibir o fenótipo albino (Figura 4). As plantas infiltradas com transporte Agrobacterium pYL156 (TRV): RNA2 servir como controle. </li><li> Verificar a eficiência silenciamento do gene ao examinar o nível de expressão de genes endógenos com transcrição reversa reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) com RNA isolado de controle de plantas de algodão e silenciados. </li></ol> Nota: As plantas VIGS-ed devem ser mantidos sob quarentena e condições contidas plantas devem ser devidamente esterilizado e descartado após os ensaios como TRV tem uma ampla gama de hospedeiros e é um patógeno de notificação obrigatória. 4.Resultados representativos: Aproximadamente duas semanas após a mão-de infiltração com mistura Agrobacterial, o fenótipo albino causada por GrCLA1 ​​silenciamento foi claramente observado nas folhas verdadeiras. A eficiência silenciar atinge quase 100% em múltiplas experiências com mais de 50 plantas. As plantas silenciadas exibir um fenótipo uniformemente distribuída e muito forte em novos albino desenvolvimento folhas com um mosaico nas folhas mais velho (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um mudas de algodão em cerca de duas semanas de estágio de idade com dois cotilédones totalmente expandidos utilizado para infiltração Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Perfuração de pequenos orifícios na parte inferior do cotilédones de plantas de algodão com uma agulha de 25 G para facilitar a infiltração Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Infiltração Mão de mistura Agrobacterial na cotilédones de algodão através dos sites ferindo usando uma seringa sem agulha <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Fenótipo Albino apareceu na VIGS silenciados plantas de algodão. Quatro cultivares são mostrados. A) Fibermax 832; B) PhytoGen 480WR; C) PhytoGen 425RF; D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

VIGS foi provado ser uma ferramenta poderosa na análise genômica funcional por transitoriamente derrubando a expressão de genes endógenos. Neste estudo, desenvolvemos um VIGS Agrobacterium mediada pela utilização de um vetor binário TRV-based. O algodão CLA1 gene (GrCLA1) foi desenvolvido como um marcador visual para monitorar a eficiência silenciar. Temos consistentemente obteve 100% de eficiência silenciamento gênico, demonstrado pelo fenótipo albino aparecendo nas folhas verdadeiras em todas as vari...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome dos reagentes e equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Catálogo / número de série </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Rolo de tambor </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bactéria cultura </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bactéria cultura </td></tr><tr><td> UV / Vis espectrofotômetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modelo: DU530 </td><td> Medição OD </td></tr><tr><td> Gene Pulser </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652076; Serial: 154BR3880 </td><td> Eletroporação </td></tr><tr><td> Pulsador Controlador </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652098; Serial: 232BR4833 </td><td> Eletroporação </td></tr><tr><td> Micropulser Eletroporação cuvete </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Eletroporação </td></tr><tr><td> 1 Seringa ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> Inoculação de bactéria agro- </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Mudas em crescimento </td></tr><tr><td> Terra Cotta pot </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Mudas em crescimento </td></tr><tr><td> Monohidratada MES </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> Buffer de infiltração </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> Buffer de infiltração </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced assay silenciamento gênico em cotton

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Algodão (Gossypium hirsutum) é uma das culturas mais importantes do mundo. Esforços consideráveis ​​têm sido feitos sobre melhoramento molecular de novas variedades. A análise de genes em larga escala funcional em algodão tem sido ficado para trás a maioria das espécies de plantas modernas, provavelmente devido a seu grande tamanho do genoma, o gene duplicação e poliploidia, ciclo de crescimento longo e recalcitrância à transformação genética 1. Para facilitar o estudo funcional de alto rendimento genética / genômica em algodão, tentamos desenvolver rápida e eficiente ensaios transitórios para avaliar as funções dos genes do algodão. Virus-Induced silenciamento gênico (VIGS) é uma poderosa técnica que foi desenvolvida com base no host silenciamento pós-transcricional Gene (PTGS) para reprimir a proliferação viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS tem sido aplicado com sucesso em uma ampla gama de espécies como dicotiledôneas Solanaceae, Arabidopsis e espécies de leguminosas, e as espécies monocotiledôneas incluindo trigo, cevada e milho, por vários estudos genômicos funcionais 3,4. Como esta abordagem rápida e eficiente evita transformação de plantas e supera redundância funcional, é particularmente atraente e adequado para o estudo do genoma funcional de espécies de culturas como o algodão não passíveis de transformação. Neste estudo, relatamos o protocolo detalhado de Agrobacterium mediada sistema VIGS em algodão. Entre os vários vetores virais VIGS, o vírus chocalho tabaco (TRV) invade uma ampla gama de hospedeiros e é capaz de espalhar vigorosamente em toda a planta ainda produzir sintomas leves na hosts5. Para monitorar a eficiência silenciamento, GrCLA1, um gene homólogo de Cloroplastos Arabidopsis alterados um gene (AtCLA1) em algodão, foi clonado e inserido no vetor binário VIGS pYL156. CLA1 gene está envolvida no desenvolvimento do cloroplasto 6, e estudos anteriores demonstraram que perda de função de AtCLA1 resultou em um fenótipo albino em folhas verdadeiras 7, proporcionando um excelente marcador visual para silenciar eficiência. Em aproximadamente duas semanas infiltração Agrobacterium post, o fenótipo albino começaram a aparecer nas folhas verdadeiras, com eficiência de 100% em silenciar todos os experimentos replicados. O silenciamento da expressão do gene endógeno também foi confirmada por RT-PCR. Significativamente, silenciando poderia potently ocorrer em todas as cultivares testadas, incluindo diversas variedades comercialmente cultivadas em Texas. Essa rápida e eficiente mediada por Agrobacterium ensaio VIGS fornece uma ferramenta muito poderosa para a análise em larga escala rápida de funções dos genes no genoma nível em algodão.

Apresentamos o protocolo detalhado para Agrobacterium mediada induzida pelo vírus ensaio de silenciamento de genes (VIGS) em algodão. O vírus chocalho tabaco (TRV) derivados de vetores VIGS foram mobilizados para induzir silenciamento de RNA de algodão GrCLA1, Cloroplastos alterados um gene. O fenótipo albino causada pelo silenciamento GrCLA1 ​​foi observada na fase de mudas dentro de 2 semanas após a inoculação.

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton

O algodão (Gossypium hirsutum) é uma das culturas mais importantes do mundo. Esforços consideráveis têm sido dedicados ao melhoramento molecular de novas variedades. O ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um ensaio de silenciamento gênico induzido por vírus mediado por agrobactérias no algodoeiro para estudar a função gênica. Isso é realizado primeiramente cultivando plântulas de algodoeiro até a fase de 10 dias a duas semanas de idade. Em seguida, o gene rados dos cloroplastos do algodoeiro é clonado em um vetor baseado no vírus do mosaico do tabaco (tobacco rattle virus).O terceiro passo é preparar culturas de agrobactérias contendo P-T-R-V-R-N-A um e P-T-R-V-G-R-C-A um. O passo final é inocular manualmente as culturas de agrobactérias nas folhas jovens do algodoeiro. Por fim, os resultados de silenciamento gênico podem ser observados por meio do fenótipo albino nas folhas verdadeiras das plantas de algodão cerca de duas semanas depois.A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a transformação, é que os VIGs oferecem uma plataforma rápida e eficiente para o estudo da função gênica no algodoeiro. Embora este método possa se revelar uma ferramenta poderosa para análise rápida em larga escala da função gênica em nível de genoma completo no algodoeiro, ele também pode ser aplicado a outras espécies de culturas importantes. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentarão dificuldades, pois é complicado realizar a inoculação manual das culturas de agrobactérias e do coan do algodoeiro.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de genética e genômica do algodão, como a exploração de funções gênicas para o cultivo de plântulas de algodão para silenciamento gênico induzido por vírus. Adicione o substrato Metro Mix 700 a diversos vasos de sete centímetros e coloque os vasos cheios em uma bandeja. Em seguida, plante as sementes de várias variedades de algodão de terras altas, como Fiber Max 832 Phyto, Gen 4, 25, RF Phyto, Gen Four 80 WR e Delta Pine 90.Nas bandejas preparadas, cubra a bandeja contendo os potes com uma cúpula de plástico e coloque a bandeja em uma câmara de crescimento, a 23 graus Celsius, com luz de 120 micro Einsteins por metro quadrado por segundo e fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Após três a quatro dias, assim que duas folhas oleanas tiverem emergido, remova a cúpula de plástico. Deixe as plantas de algodão crescerem por cerca de 10 dias, até atingirem o estágio em que duas cotilédones totalmente expandidas tiverem se desenvolvido, mas antes do surgimento das folhas verdadeiras. Nesse momento, as plantas estarão prontas para serem utilizadas no ensaio de silenciamento gênico induzido por vírus.Esses procedimentos de clonagem devem ser realizados durante o período de duas semanas em que as plantas de algodão estão atingindo o estágio de expansão total. Primeiro, amplifique um gene dos cloroplastos de algodão a partir de uma biblioteca de CD NA de tecidos foliares de CACI remondi utilizando os iniciadores fornecidos no protocolo escrito, de acordo com os procedimentos-padrão de PCR. Em seguida, digira o produto de PCR de GCA um com Eco R um e K PN um, conforme os protocolos do fabricante das enzimas.Visualize o produto de PCR de 500 pares de bases em um gel de brometo de etídio. Recorte a faixa e extraia o ligante de DNA, o produto de PCR purificado, para o vetor PYL 1 56. Usando a ligase de DNA T4, transforme células de E. coli competentes com o vetor ligado e, em seguida, espalhe de 10 a 50 microlitros das células transformadas em placas de ágar LBA contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina.Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Escolha colônias da placa e cultive durante a noite em dois mililitros de caldo LB contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina. Recolha as bactérias por centrifugação e realize preparações de DNA de acordo com procedimentos padrão. Para purificar o DNA plasmidial, verifique os construtos por digestão com enzimas de restrição e sequenciamento.Uma vez confirmada a presença e orientação do inserto no vetor PYL 1 56, eletroporar o plasmídeo em agrobactéria tumefaciens GV 3 1 0 1 e recuperar em meio líquido LB a 28 graus Celsius. Selecionar os transformantes em placas de ágar LBI contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina e 25 microgramas por mililitro de gentamicina. Se desejado, as bactérias podem ser armazenadas em glicerol 25% a menos 80 graus Celsius.Três dias antes da inoculação, faça estrias a partir de estoces glicerol de agrobactérias tumefaciens carregando PYL 1 9 2 RNA um PY, 1 56 RNA dois e PY 1 56 RNA dois GLA um em placas de ágar LB com antibiótico; incube as placas a 28 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, escolha uma colônia isolada para cada construto e inocule cada colônia em cinco mililitros de meio LB suplementado com 50 microgramas por mililitro de canamicina e 25 microgramas por mililitro de gentamicina.Cultive a cultura bacteriana a 28 graus Celsius durante a noite em um agitador ajustado a uma velocidade de 50 rotações por minuto. Transfira a cultura PYL 1 56 RNA dois GLA um e as culturas controle para frascos separados contendo 50 mililitros de meio LB suplementado com 50 microgramas por mililitro de canamicina e 25 microgramas por mililitro de gentamicina mais 10 milimolar de MES e 20 micromolar de acetosiringuona. Cultive a cultura a 28 graus Celsius durante a noite em um agitador ajustado a uma velocidade de 50 rotações por minuto.No dia seguinte, transfira as culturas para tubos de centrífuga e centrifugue as células bacterianas agro a 4.000 rotações por minuto durante cinco minutos; re-suspenda a cultura no tampão de infiltração contendo cloreto de magnésio 10 milimolar, MES 10 milimolar e acetosirina 200 micromolar. Meça a DO600 da cultura e ajuste-a para 1,5 com o tampão de infiltração. Incube a cultura em bancada, à temperatura ambiente, por três horas antes da infiltração foliar com bactérias agro.Fure a parte inferior do capulho dos algodoeiros com uma agulha de 25 graus sem perfurar completamente o capulho. Um ou dois furos são feitos em cada seção do Capulho. Em seguida, misture a cultura bacteriana agro de RNA PYL 1 92 com RNA PYL 1 56 ou RNA PY 1 56 GRCA 1 numa proporção de um para um.Em seguida, utilizando uma seringa ou agulha de um mililitro, introduza a mistura na face inferior das folhas do cotilédone através dos orifícios perfurados. Cubra as plantas com uma cúpula de plástico e mantenha as plantas infiltradas em temperatura ambiente, sob luz fraca, durante a noite.Transfira as plantas para uma câmara de crescimento com temperatura de 23 graus Celsius, luz de 120 micro Einstein por metro quadrado por segundo e ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. Examine o fenótipo de silenciamento entre sete e oito dias após a infiltração. Nesse momento, as folhas verdadeiras das plantas silenciadas por PY 1 56 RNA dois GLA um começam a exibir o fenótipo albino.As plantas infiltradas com bactérias agrobacterianas portando PYL 1 56 RNA dois servem como controle. Verifique a eficiência do silenciamento gênico analisando o nível de expressão dos genes endógenos por meio da reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa utilizando RNA isolado de plantas de algodão controle e silenciadas, conforme procedimentos padrão.Esta imagem mostra uma cultivar fiber max 8 3 2 após o silenciamento gênico induzido por vírus do gene GLA one. Observe as folhas de cor branca onde o silenciamento gênico ocorreu aqui. Uma cultivar PHYTO four 80 WR também exibe o fenótipo albino após o silenciamento gênico induzido por vírus.Da mesma forma, esta cultivar phyto 4 2 5 RF exibe folhas brancas onde ocorreu o silenciamento gênico induzido por vírus. Por fim, esta imagem mostra outro experimento bem-sucedido de silenciamento gênico induzido por vírus, desta vez em cultivares Delta PINE 90. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de adicionar acetona às culturas de agrobactérias antes de deixá-las em bancada pelas três horas seguintes a este procedimento.Outros métodos, como o clonagem de biblioteca de CD NA vig, podem então ser realizados para responder perguntas adicionais, como explorar novas funções gênicas após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de genética de plantas explorarem a função gênica e a resposta de defesa contra estresses antibióticos e bióticos em plantas cultivadas economicamente importantes. Uma vez mascarados os dados, essa técnica pode ser realizada em dois a três dias se for executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o silenciamento gênico induzido por vírus no algodoeiro.

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Biologia

Descrição de um vírus induzida silenciamento de genes método (VIGS) para knock-down da expressão gênica...

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

Fonte: Shi, J., et al. Triagem e identificação de supressores silenciadores de RNA a partir de efetores secretados de patógenos vegetais. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra um ensaio de coinfiltração para identificar proteínas efetoras de patógenos que suprimem o silenciamento de RNA na Nicotiana benthamiana 16c. Um repórter fluorescente e um gene efetor candidato são entregues às folhas da planta via Agrobacterium. Normalmente, o silenciamento de RNA degrada os transcritos repórteres,...

Ensaio de Co-Infiltração para Triagem de Efetores de Patógenos que Suprimem o Silêncio do RNA Vegetal

Fonte: Shi, J., et al., Triagem e Identificação de Supressores de Silenamento de RNA de Efetores Secretados de Patógenos Vegetais. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento para preparar uma cultura de Agrobacterium tumefaciens induzindo a expressão gênica de virulência com acetosiringona, seguida pela remoção do antibiótico por lavagem e ressuspensão, para gerar uma suspensão pronta para transformação e entrega de genes nos tecidos vegetais.

Preparação de Cultura de Agrobacterium para entrega de genes em células vegetais

Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculação direta de mudas de milho por injeção com clones infecciosos do Vírus do Mosaico do Rabo-de-Raposa Recombinante e do Vírus do Mosaico da Cana-de-Açúcar. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a entrega mediada por Agrobacterium de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico. Ele descreve o processo de infecção por Agrobacterium , disseminação viral sistêmica e mudanças fenotípicas impulsionadas pela interferência de RNA.

Entrega mediada por agrobactérias de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico

Induzida por vírus silenciamento de genes é uma ferramenta útil para a identificação de genes envolvidos na resistência de plantas não hospedeiras. Nós demonstramos o uso de bactérias patogênicas que expressam GFPuv em identificar plantas silenciados genes suscetíveis a agentes patogênicos não hospedeiras. Esta abordagem é simples, rápido e facilita a triagem em grande escala e protocolo semelhante pode ser aplicado ao estudo de várias outras interacções planta-microorganismo.

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras

Produção de proteína transiente em plantas de Nicotiana baseado na infiltração de vácuo com Agrobacterium levando vetores de lançamento (Tobacco mosaic vírus-base) é uma abordagem rápida e econômica para a produção de antígenos vacinais e proteínas terapêuticas. Nós simplificamos o processo e melhorado acumulação alvo, otimizando as condições de cultivo de bactérias, a seleção de espécies hospedeiras, e co-introdução de RNA silenciar supressores.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente para a preparação de grandes quantidades de protoplastas de soja estudar mecanismos complexos regulatórios e sinalização em células vivas.

Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.

Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Aqui, apresentamos o primeiro protocolo de infiltração localizada a vácuo para estudos in vivo da transformação genética de plantas de grande porte. Utilizando esta metodologia, obteve-se pela primeira vez a transformação transitória do cacau mediada por Agrobacterium em planta.

Agroinfiltração Forçada a Vácuo para Transformação In planta de Plantas Recalcitrantes: Cacau como Estudo de Caso

Aprenda o método VIGS mediado por Agrobacterium para silenciamento gênico em algodão usando vetores TRV. Esta técnica permite estudar funções gênicas através do fenótipo albino observável em plântulas.

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton

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