Microondas Assistida Diagnóstico Rápido de Doenças vírus de planta por Microscopia Eletrônica de Transmissão

O objetivo geral deste procedimento é diagnosticar doenças de vírus de plantas em poucas horas por microscopia eletrônica de transmissão. Este procedimento começa com a fixação assistida por micro-ondas e incorporação do material vegetal infectado. O próximo passo é extrair e corar as partículas de vírus das amostras de plantas por coloração negativa, seguida pelo seccionamento das amostras de plantas incorporadas.

As amostras são então investigadas no microscópio eletrônico de transmissão e o tamanho das partículas do vírus é medido por análise de imagem. Em última análise, os resultados mostram alterações ultraestruturais típicas induzidas por vírus e o tamanho das partículas virais por meio de métodos de microscopia eletrônica de transmissão. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como fixação convencional e incorporação em temperatura ambiente, que pode levar vários dias, é que o tempo de preparo da amostra para microscopia eletrônica de transmissão pode ser reduzido para cerca de duas horas, permitindo assim um diagnóstico claro da doença viral em cerca de meio dia.

Demonstrando este procedimento junto comigo estará Gerhard Kaba, um técnico e o professor Zelnik, um colega do nosso laboratório Antes do início do programa de preparação de amostras, o processador automático de tecidos de microondas para microscopia eletrônica LA A-E-M-A-M-W com os protocolos apropriados. Prepare as soluções para as diferentes etapas descritas no protocolo programado para fixação, desidratação e infiltração, e encha-as nos frascos designados de acordo com o protocolo, carregue os frascos no carrossel. Insira o carrossel no processador de tecidos de micro-ondas e, em seguida, carregue o primeiro frasco na câmara monomodo.

Em seguida, corte pequenas seções de folhas de tabaco nicotiana infectado com o vírus do mosaico do tabaco, ou TMV com uma lâmina de barbear em uma placa de cera de modelagem em uma gota de glutaraldeído em sorens e tampão fosfato à temperatura ambiente. Durante a colheita das amostras e o carregamento das amostras nos cestos, é importante certificar-se de que eles estejam sempre cobertos com solução fixadora para que não experimentem o uso de pinças finas. Transfira as seções imediatamente para os cestos designados com uma largura de malha de aproximadamente 200 micrômetros.

Empilhe os cestos uns sobre os outros e insira-os na câmara de modo mono. Inicie o protocolo de preparação de amostras assistido por micro-ondas previamente programado para fixação, desidratação e infiltração. Pouco antes do término do protocolo de preparação da amostra, preencha a resina epóxi ágar 100 recém-preparada nas formas de polimerização designadas.

Após a conclusão do protocolo, libere as cestas empilhadas contendo as amostras infiltradas da câmara monomodo no último frasco do carrossel. Retire o carrossel do dispositivo de micro-ondas e retire o frasco contendo as amostras do carrossel. Em seguida, retire os cestos do frasco e desempilhe-os com uma pinça fina.

Carregue as amostras nas formas de polimerização designadas. Em seguida, empilhe as formas de polimerização umas sobre as outras e remova os frascos usados anteriormente do carrossel do processador de tecidos de micro-ondas. Carregue o carrossel com os cestos empilhados e insira o carrossel no dispositivo de micro-ondas.

Agora inicie o protocolo de polimerização previamente programado. Após o término do protocolo, remova as formas de polimerização da câmara monomodo e desempilhe-as. Remova os blocos polimerizados contendo as amostras, que agora estão prontos para seccionamento com um micrótomo para iniciar o procedimento de seccionamento dos blocos contendo as amostras.

Insira um ou mais blocos em porta-amostras separados para corte ultrafino. Com a amostra no topo, saindo cerca de um centímetro do suporte. Apare o bloco com um aparador de amostras para TEM de modo a obter uma face de bloco de no máximo um milímetro de comprimento e 200 micrômetros de largura contendo o máximo de material foliar possível.

Defina o ultramicrótomo para cortar seções de cerca de 70 a 90 nanômetros de espessura a uma velocidade de corte de cerca de um milímetro por segundo. Divida o bloco usando uma faca de diamante em um ângulo de faca de 45 graus. Pegue várias seções com uma grade de malha quadrada de cobre ou níquel 200 revestida com VAR pós-manchar as seções da grade com citrato de chumbo por cinco minutos em uma placa de Petri, parcialmente preenchida com NAOH para criar um ambiente livre de CO2.

Lave as grelhas com água destilada durante um minuto. Por fim, pós-coloração por 15 minutos com acetato de urinol a 1% dissolvido em água destilada em temperatura ambiente após lavar as grades com água destilada por um minuto, secar ao ar em uma caixa de grade. A coloração negativa do material vegetal restante é realizada enquanto a preparação da amostra está sendo realizada automaticamente pelo processador de tecidos de micro-ondas.

Primeiro, colha cerca de 100 miligramas de material foliar infectado com TMV e prepare o SAP bruto homogeneizando o material por dois minutos com uma lâmina de barbear em um microscópio. Deslize em sorens e tampão fosfato. Transfira 20 microlitros do homogeneizado resultante para o primeiro poço de um microscópio revestido de Teflon.

Slide com quatro ou mais poços. Em seguida, coloque uma grade revestida com VAR em cima do homogeneizado com o lado revestido com VAR voltado para a gota incubar por cinco minutos. Lave a grade por dois minutos, colocando-a em cima de uma gota de sorens e tampão fosfato.

Repita a lavagem por mais dois minutos. Em seguida, incube a grade por um minuto com uma solução de ácido fosfóbico recém-preparada. Após um minuto, remova a grade e deixe-a secar ao ar.

Em uma caixa de grade, coloque a grade corada negativamente no porta-amostras e examine-a com um microscópio eletrônico de transmissão. Enquanto a polimerização está sendo realizada automaticamente pelo processador de tecidos de micro-ondas, tire pelo menos 10 imagens de íons corados negativamente escolhidos aleatoriamente. Pelo menos 10 ou mais íons devem estar visíveis em cada imagem.

Com o microscópio eletrônico de transmissão com uma ampliação primária de 21.000 x ou mais, deve-se tomar cuidado para que todas as imagens tenham a mesma ampliação. As seções contendo as amostras de tecido que foram processadas automaticamente pelo processador de tecidos de micro-ondas também são examinadas com um microscópio eletrônico de transmissão. A análise das imagens adquiridas pelo TEM pode ser realizada usando qualquer análise de imagem.

Software de computador com ferramenta de análise de partículas. Meça o comprimento e o tamanho de pelo menos 100 partículas de vírus individuais escolhidas aleatoriamente nas micrografias retiradas das amostras coradas negativamente. Calcule as médias e desvios padrão para obter um comprimento e largura médios das partículas virais visualizadas por métodos de coloração negativa e MET após a preparação da amostra assistida por micro-ondas.

Alterações ultraestruturais típicas induzidas por TMV, como grandes áreas contendo íons alinhados em forma paralela, puderam ser observadas com o microscópio eletrônico de transmissão no citosol de células infectadas de tabaco nicotiana. Nesta micrografia eletrônica de transmissão, C representa o cloroplasto com amido. St.M é para mitocôndria e é para núcleo, e V é para vacúolo.

Além disso, no SAP bruto de folhas infectadas por TMV, as partículas de TMV podem ser observadas como estruturas em forma de bastonete após coloração negativa. Figura um B. Este gráfico mostra a distribuição relativa de comprimento e largura de 100 partículas de TMV conforme apareceram no microscópio eletrônico. Após a coloração negativa, a análise da imagem da seiva das folhas infectadas das partículas do vírus revelou um tamanho médio para TMV de 280 nanômetros de comprimento e 17 nanômetros de largura Após seu desenvolvimento para diagnosticar rapidamente doenças virais cerebrais.

Essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores nas áreas de patologia animal e humana diagnosticarem rapidamente doenças animais e humanas por microscopia eletrônica de transmissão.