Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

O objetivo geral deste procedimento é preparar os olhos adultos de drosófila para seccionamento fino, permitindo a avaliação detalhada dos fenótipos oculares mutantes, como defeitos de polaridade das células planares. Isso é feito cortando primeiro as cabeças das moscas anestesiadas. O tecido ocular é então fixado e incorporado em uma resina epóxi.

Uma vez que a resina é solidificada, os olhos embutidos são aparados. Para o seccionamento, a etapa final é seccionar os olhos usando um micrótomo equipado com uma faca de diamante. Em última análise, a análise da seção do olho permitirá a caracterização de fenótipos oculares de novos mutantes ou a quantificação de interações genéticas entre genes de uma via de sinalização, como a via PCP.

Ambos ajudarão a caracterizar o papel fisiológico dos genes recém-identificados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da drosófila, como como novas mutações afetam o desenvolvimento ocular ou como os genes interagem em ensaios de interação genética. Várias etapas do procedimento de incorporação ocular, como alinhar os olhos em moldes de secção, são muito mais fáceis de entender, o que realmente é mais fácil do que em forma de texto Para começar, coloque um par de luvas em preparação para a fixação das cabeças das moscas e glutaraldeído e ósmio, ambos produtos químicos tóxicos.

Em seguida, anestesiar as moscas usando CO2 e batê-las em uma almofada de mosca protegida por papel watman sob um microscópio de dissecação, normalmente separe seis moscas mais uma mosca adicional para garantir que seis cabeças de mosca embutidas por genótipo segurem e pressionem suavemente o tórax da mosca com uma pinça e, em seguida, remova a cabeça da mosca usando um bisturi, Estabilize a cabeça da mosca tocando o pescoço com a pinça e corte cuidadosamente uma pequena parte de um olho para aumentar a penetração do fixador. Toque a cabeça com uma pinça ou o bisturi na superfície do olho de corte para transferir a cabeça para o fixador de fosfato de glutaraldeído no gelo. Certifique-se de usar luvas durante todo o processo de fixação.

Primeiro rotule todos os fungos para acompanhar os diferentes genótipos. Em seguida, preencha cada molde com 100% de resina, tomando cuidado para não enchê-los demais. A parte superior deve ser plana na superfície.

Usando uma pipeta de transferência, remova a resina de 50% das cabeças. Substitua por 100% de resina e incube por três a quatro horas em temperatura ambiente. À medida que as cabeças se equilibram na resina ao longo da incubação, elas afundam no fundo do tubo.

Bata um palito em uma superfície dura para criar um pequeno gancho. Usando esta ferramenta, transfira uma única cabeça de mosca para cada molde. Coloque papel alumínio na área de trabalho do microscópio de dissecação para protegê-lo contra resina derramada.

Com a ajuda do escopo de dissecação, use a agulha de dissecação para girar a cabeça levemente e com cuidado. Mova-o para o fundo do molde, próximo à extremidade pontiaguda. Alinhe cuidadosamente a superfície do olho intacto com a parede frontal do molde com um pescoço apontando para baixo.

Certifique-se de manter a superfície tangencial do olho, a cerca de meio diâmetro da cabeça de distância da parede do molde. Se os olhos se moverem ao remover a agulha de dissecação, reposicione os olhos desejados, retraia rapidamente a agulha ligeiramente para longe da cabeça e, em seguida, remova lentamente a agulha completamente. Depois que todas as cabeças estiverem alinhadas, verifique novamente todos os olhos para se certificar de que não se moveram.

Quando você removeu a agulha da resina, se houver ou torto, realinhe a cabeça, transfira os moldes para um forno e asse a 70 graus durante a noite. Depois de assar durante a noite, remova os blocos endurecidos dos moldes dobrando os moldes. Acompanhe qual bloco corresponde a qual genótipo, mantendo-os em recipientes rotulados.

Para aparar os blocos, monte um bloco em um mandril de micrótomo, de modo que o olho fique voltado para cima sob o escopo de dissecação. Usando uma lâmina de barbear revestida de Teflon, corte cuidadosamente apenas a camada superior do bloco. Isso deixa uma superfície clara através da qual o olho pode ser visto e o plano de seccionamento pode ser estabelecido.

Em seguida, corte o excesso de plástico em ambos os lados da cabeça e na frente até que a maior parte do plástico ao redor da cabeça seja cortada. É melhor se aproximar lentamente da cabeça, cortando várias camadas finas de plástico usando uma lâmina de barbear limpa. Remova cuidadosamente as camadas finas da parte superior do olho no plano exato desejado de secção.

Certifique-se de usar áreas frescas da lâmina de barbear para cada corte e continue apenas até que a superfície externa do olho seja alcançada. O bloco aparado resultante será uma pirâmide de três lados com um topo de corte ligeiramente inclinado que corresponde ao plano de seccionamento. Monte o bloco no micrótomo e comece a seccionar.

Até que 20 a 30 seções tenham sido geradas, as seções resultantes flutuarão na superfície da água no reservatório. Coloque uma lâmina em uma placa de aquecimento ajustada para 100 graus Celsius. Em seguida, levante o primeiro lote de seções com uma extremidade achatada de um cotonete de madeira sob a superfície da água usando um movimento rotativo e, em seguida, transfira-as para uma gota d'água.

No escorregador, espere até que a água tenha evaporado e as seções estejam presas ao escorregador e repita com mais 20 a 30 seções. Normalmente, seções de três olhos posicionadas em seis gotas de água se encaixam bem em uma lâmina. Uma vez que todas as seções são coletadas na lâmina, elas podem ser coradas e montadas para microscopia em uma seção tangencial através do olho de uma mosca selvagem.

Os AIT exibem polaridade normal e são bem orientados em relação à linha de simetria ventral dorsal, que é ilustrada por uma linha amarela no esquema abaixo. Em contraste com o tia bem orientado do olho do tipo selvagem aqui em um olho mutante de estrabismo, a polaridade tial é perdida e, embora o complemento completo do fotorreceptor esteja presente, a rotação e a alidade são randomizadas. Além disso, observe a ausência do pigmento da rede de células pigmentares e das células fotorreceptoras individuais.

Como o mutante estrabismo estava em um fundo genético branco menos, a drosophila ro quinase ou gota é uma mutação letal homozigótica, que requer análise clonal. Aqui, os clones mutantes Dr.Homozygous são marcados pela ausência de pigmento e apresentam defeitos de rotação, bem como defeitos estruturais, incluindo número ausente ou excessivo de células fotorreceptoras no nível de célula única. Exemplos de fotorreceptores do tipo mutante e selvagem são indicados por pontas de seta azuis abertas ou preenchidas, respectivamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como incorporar e separar os olhos das moscas. Dentro de cerca de três dias. Você deve rotineiramente ser capaz de analisar os fenótipos oculares em detalhes, permitindo que você aborde a função de novos genes durante o desenvolvimento ocular.