Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:20 min. • April 30th, 2023
Os esferoides são culturas in vitro de células auto-agregadas para formar estruturas esféricas tridimensionais. Para propagar esferoides tumorais, comece com esferoides cultivados em uma matriz extracelular adequada, ou MEC, contida em uma placa de cultura.
Triturar usando uma micropipeta para quebrar a ECM mecanicamente e soltar os esferoides. Transfira a mistura esferoide-ECM para um tubo de microcentrífuga.
Centrifugue em baixa velocidade para peletizar os esferoides e separá-los da ECM no sobrenadante. Descarte o sobrenadante contendo ECM gasto. Transfira o tubo contendo o pellet esferóide no gelo para evitar a solidificação do ECM durante as etapas subsequentes.
Completar o pellet com ECM liquefeito fresco. Para subcultura, misture o conteúdo pipetando para cima e para baixo repetidamente para dissociar as células esferóides e liberá-las em suspensão.
Semeie esta mistura contendo células formadoras de esferóides e ECM em uma placa de cultura fresca. A ECM se solidifica, permitindo o aprisionamento de células tumorais. Adicione o meio de crescimento desejado. Incubar para facilitar o crescimento de células aprisionadas em novos esferoides.
Para efeitos de expedição, transferir a mistura esferoide-ECM para um balão de cultura. Permita que o ECM solidifique e prenda os esferoides dentro.
Encher o balão com meios de cultura para evitar o cisalhamento celular e manter a viabilidade dos esferoides. Transfira o balão para uma embalagem de envio.
Quebre mecanicamente o ECM com uma pipeta P1000 e transfira-o para um tubo estéril de 1,5 milímetro. Centrifugue o tubo a 1.000 x g a 4 graus Celsius. Em seguida, remova todo o sobrenadante e coloque o tubo no gelo. Adicione duas a quatro vezes o volume do novo ECM ao pellet e misture o conteúdo do tubo pipetando para cima e para baixo 10 vezes, certificando-se de evitar a introdução de bolhas de ar.
Transfira 5 a 20 microlitros do ECM na mistura SBNET para uma nova placa de 96 poços e permita que o ECM solidifique. Em seguida, cubra o ECM solidificado com novo meio SBNET e coloque a placa na incubadora. Se estiver enviando esferoides SBNET para outro laboratório, transfira os esferoides com o novo ECM para um frasco T25 e permita que o ECM solidifique. Encha o frasco com meio esferóide SBNET, aperte bem a tampa e prepare o pacote de envio.