Imunomarcação de ouro de cortes exossômicos: uma técnica para visualizar marcadores diagnósticos no lúmen exossômico

Os exossomos são pequenas vesículas extracelulares que envolvem uma variedade de biomoléculas que servem como biomarcadores de câncer.

Para visualizar biomarcadores exossômicos, comece com seções exossômicas ultrafinas embebidas em resina suportadas em grades metálicas de microscopia eletrônica adequadas. Incube as grades em gotas de glicina. A glicina se liga e neutraliza grupos aldeídos reativos nas seções para superar sua interferência no ensaio.

Enxágue a amostra com água para remover os reagentes residuais. Em seguida, incubar a amostra em um tampão de bloqueio. O tampão transporta proteínas séricas que bloqueiam locais de ligação de anticorpos não específicos na amostra.

Em seguida, incube a amostra na solução de anticorpo primário desejada. Esses anticorpos reconhecem e se ligam aos seus biomarcadores alvo localizados no lúmen exossômico. Lave quaisquer anticorpos não ligados com um tampão adequado.

Agora, transfira as grades de suporte de amostra para gotas contendo anticorpos secundários conjugados com ouro que se ligam aos anticorpos primários. As nanopartículas de ouro servem como marcadores densos de elétrons para visualizar a localização fina das moléculas-alvo. Lave quaisquer anticorpos secundários não ligados com um tampão adequado.

Finalmente, em condições escuras, incubar as grades sequencialmente em soluções de acetato de uranilo e citrato de chumbo. Esses reagentes de metais pesados coram e aumentam o contraste de moléculas orgânicas como lipídios, proteínas e glicogênios na amostra, diferenciando-os do fundo.

Observe as seções coradas sob um microscópio eletrônico de transmissão. Os biomarcadores marcados com ouro aparecem como partículas escuras dentro do lúmen de estruturas de exossomos manchadas de metais pesados.

Para começar, incube grades contendo seções não coradas de 60 nanômetros de espessura em gotas de 50 microlitros de glicina 0,02 M por 10 minutos para extinguir os grupos aldeídos livres. Em seguida, enxágue as seções em 100 microlitros de água destilada três vezes por 10 minutos cada. Após o último enxágue, incube as seções por 1 hora em temperatura ambiente em PBS contendo 1% de BSA. Em seguida, incube as grades em gotas de 50 a 100 microlitros de um anticorpo anti-KRS por 1 hora.

Em seguida, lave as grades cinco vezes por 10 minutos cada em uma gota de PBS contendo 0,1% de BSA. Em seguida, transfira as grades para uma gota de um anticorpo secundário apropriado e incube as seções por 1 hora em temperatura ambiente. Agora, lave as grades cinco vezes por 10 minutos cada com uma gota separada de PBS contendo 0,1% de BSA. Coloração dupla das seções com acetato de uranila a 2% por 20 minutos no escuro, seguido pelo citrato de chumbo de Reynold por 10 minutos. Coloque a seção corada em um microscópio eletrônico de transmissão e visualize a amostra usando 80 kV e visualize-a usando o software do microscópio.

• Exosomes - Small extracellular vesicles enclosing cancer biomarkers.
• Glycine - A compound used to bind and neutralize reactive aldehyde groups.
• Blocking Buffer - A solution containing serum proteins that block non-specific antibody binding sites.
• Primary Antibody - A protein that recognizes and binds to target biomarkers in the exosomal lumen.
• Secondary Antibodies - Proteins tagged with gold-nanoparticles used to visualize primary antibodies.

• Introduce Exosomes - Definition and importance in cancer diagnosis (e.g., exosomes).
• Outline Glycine's Role - Its function in stabilizing exosomal structures (e.g., glycine).
• Explain Blocking Buffer - Serum proteins preventing unwanted reactions (e.g., blocking buffer).
• Educate on Antibody Tagging - Importance in visualizing exosomal biomarkers.

• What are exosomes and how do they serve as cancer biomarkers?
• What is the role of glycine in visualizing exosomal biomarkers?
• Why is a blocking buffer used in this process?

• Practical Application - Exosomes as diagnostic tools in cancer studies (e.g., exosome detection).
• Industry Impact - Enhancement of diagnostic accuracy in healthcare (e.g., cancer diagnostics).
• Societal Importance - Improving early detection and treatment strategies (e.g., personalized medicine).
• Scientific Advancements - Advancements in biomarker detection techniques.