Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:10 min. • April 30th, 2023
Para realizar a coloração negativa de exossomos - vesículas esféricas de tamanho nanossuficiente - comece fazendo uma grade de microscopia eletrônica adequada. Prepare a grade usando um descarregador de brilho. Este processo torna a superfície da grade hidrofílica para melhor adesão das amostras.
Simultaneamente, tome uma suspensão de exossomos purificados em um tubo. Complemente o tubo com paraformaldeído - um fixador de amostra - e incuba. O paraformaldeído penetra nos exossomos e reticula as proteínas e os ácidos nucléicos. Esta etapa é vital para preservar a morfologia dos exossomos.
Agora, carregue a suspensão do exossomo na grade pré-preparada e incube para permitir que a adsorção ocorra. Em seguida, adicione algumas gotas de acetato de uranila, uma mancha de metal pesado, sobre a grade. Os íons uranila se ligam às proteínas e lipídios da membrana, formando um depósito ao redor do limite do exossomo.
Por último, lave a grade em água para remover o excesso de mancha. Deixe a grade secar e obter imagens usando microscopia eletrônica de transmissão ou TEM.
Quando um feixe de elétrons atinge os exossomos, a mancha ao redor da amostra espalha mais elétrons. Os exossomos, sendo menos densos em elétrons, permitem que o feixe passe. Esses elétrons espalhados de forma diferente são capturados pelo sistema de imagem para formar uma imagem de alto contraste.
Os exossomos corados negativamente parecem mais claros, com um limite escuro ao seu redor.
Para realizar a coloração negativa, fixe os exossomos purificados após o isolamento com 1 mililitro de paraformaldeído a 2% por 5 minutos. Trate grades EM de cobre de 200 mesh revestidas com formvar/filme de carbono fino com descarga incandescente por 1 minuto. Em seguida, carregue 5 a 7 microlitros da solução de suspensão de exossomo em uma grade e incube-a por 1 minuto. Se a concentração de exossomo for muito alta, dilua a concentração para um nível apropriado.
Imediatamente, core os exossomos com cerca de 20 gotas de uma solução filtrada de acetato de uranila a 1% na superfície da grade EM. Remova o excesso de solução de acetato de uranila da grade entrando em contato com a borda da grade com papel de filtro. Em seguida, enxágue rapidamente a grade com uma gota de água.
Use uma pinça para colocar a grade sobre a mesa e cubra a grade parcialmente com um prato de cultura. Deixe a grade secar por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, fotografe a grade ou armazene-a em uma caixa de grade de microscópio eletrônico para observação futura.