Hibridização de sonda e amplificação de sinal em hibridização in situ de RNA: uma técnica para detectar sequências específicas de RNA em seções de tecido

Para detectar uma sequência específica de RNA em uma célula, comece fazendo uma seção de tecido em uma lâmina de vidro. Cubra a seção de tecido com um tampão de hibridização adequado contendo as sondas de RNA alvo.

Essas sondas são moléculas de RNA em forma de Z com uma porção de reconhecimento de alvo em uma extremidade e uma sequência de cauda em outra extremidade. Um braço espaçador liga essas duas extremidades.

Agora, incube a lâmina em um forno de hibridização a uma temperatura ideal. As sondas de RNA em forma de Z entram na célula e hibridizam com a sequência de mRNA alvo correspondente em pares.

Retire a corrediça do forno. Mergulhe a lâmina em uma solução de lavagem para remover quaisquer sondas não ligadas e o excesso de tampão de hibridização.

Em seguida, adicione uma solução de pré-amplificador e incube. A molécula pré-amplificadora se liga à sequência de cauda de duas sondas Z adjacentes. Esta molécula não se liga a uma única sonda Z, garantindo especificidade.

Em seguida, adicione a mistura de reagentes do amplificador e incuba. Várias moléculas amplificadoras hibridizam com a única sequência de pré-amplificador.

Por fim, rotule a seção de tecido com as sondas de marcação desejadas para detectar a presença de uma sequência de RNA específica na célula.

Para iniciar a hibridização, toque e mova os slides para remover o excesso de líquido e coloque-os de volta no rack de slides. Remova a sonda de HPV pré-aquecida do forno e adicione aproximadamente quatro gotas para cobrir totalmente cada seção. Cubra a bandeja com uma tampa e leve ao forno por 2 horas a 40 graus Celsius. Após concluir a incubação, retire a bandeja do forno e remova a grade deslizante.

Uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina em um suporte de lâminas submerso em uma mancha cheia de 1x tampão de lavagem, lavando as lâminas por 2 minutos em temperatura ambiente com agitação constante e repita com 1x tampão de lavagem fresco. Toque e mexa para remover o excesso de líquido das lâminas e coloque-as novamente no suporte de lâminas. Adicione aproximadamente quatro gotas de AMP1 em temperatura ambiente por seção para cobrir totalmente cada seção. Cubra a bandeja com uma tampa e leve ao forno por 30 minutos a 40 graus Celsius.

Depois de retirar a bandeja do forno, remova a grade deslizante. Trabalhando uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina no suporte de lâminas submersa em um prato de coloração cheio de 1x tampão de lavagem, lavando por 2 minutos em temperatura ambiente com agitação constante e repita com 1x tampão de lavagem fresco.

• RNA probe - Z-shaped molecules used to detect target RNA sequences in cells.
• RNAScope Technique - RNA sequence detection using probe hybridization and signal amplification.
• In Situ Probes - Probes applied directly to a section of tissue on a slide for analysis.
• RNA Hybridization - The process where RNA probes bind with target RNA sequences.
• Cell Signal Amplification - Increasing the signal strength for detecting RNA sequences.

• Introduce RNA probe - Z-shaped molecule used to detect specific RNA sequences in a cell (e.g., rna probe).
• Key Concepts - The RNA probe hybridizes with the target mRNA sequence using the RNA Scope Technique (e.g., probe hybridization).
• Underlying Mechanisms - Includes steps like incubation, washing, and adding of pre-amplifier and amplifier (e.g., cell signal amplification).
• Connect to Experiment – Experiments involve applying the techniques in carefully controlled conditions on a slide.

• What is an RNA probe and how is it used in the RNA Scope Technique (in situ probes)?
• What steps are involved in the RNA hybridization process?
• How is cell signal amplification achieved in this process?

• Practical Applications - RNA probes are widely used in scientific research and clinical diagnostics (e.g., RNA probe).
• Industry Impact - It impacts healthcare, pharmaceutical, and biotechnological sectors (e.g., RNA Scope Technique).
• Societal Importance - It contributes to understanding diseases and development of treatments (e.g., cell signal amplification).
• Link to Scientific Advancements - Its development marked an advancement in RNA detection and analysis.