Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Pesquisa sobre o Câncer
0 visualizações • 3:26 min. • April 30th, 2023
Para detectar uma sequência específica de RNA em uma célula, comece fazendo uma seção de tecido em uma lâmina de vidro. Cubra a seção de tecido com um tampão de hibridização adequado contendo as sondas de RNA alvo.
Essas sondas são moléculas de RNA em forma de Z com uma porção de reconhecimento de alvo em uma extremidade e uma sequência de cauda em outra extremidade. Um braço espaçador liga essas duas extremidades.
Agora, incube a lâmina em um forno de hibridização a uma temperatura ideal. As sondas de RNA em forma de Z entram na célula e hibridizam com a sequência de mRNA alvo correspondente em pares.
Retire a corrediça do forno. Mergulhe a lâmina em uma solução de lavagem para remover quaisquer sondas não ligadas e o excesso de tampão de hibridização.
Em seguida, adicione uma solução de pré-amplificador e incube. A molécula pré-amplificadora se liga à sequência de cauda de duas sondas Z adjacentes. Esta molécula não se liga a uma única sonda Z, garantindo especificidade.
Em seguida, adicione a mistura de reagentes do amplificador e incuba. Várias moléculas amplificadoras hibridizam com a única sequência de pré-amplificador.
Por fim, rotule a seção de tecido com as sondas de marcação desejadas para detectar a presença de uma sequência de RNA específica na célula.
Para iniciar a hibridização, toque e mova os slides para remover o excesso de líquido e coloque-os de volta no rack de slides. Remova a sonda de HPV pré-aquecida do forno e adicione aproximadamente quatro gotas para cobrir totalmente cada seção. Cubra a bandeja com uma tampa e leve ao forno por 2 horas a 40 graus Celsius. Após concluir a incubação, retire a bandeja do forno e remova a grade deslizante.
Uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina em um suporte de lâminas submerso em uma mancha cheia de 1x tampão de lavagem, lavando as lâminas por 2 minutos em temperatura ambiente com agitação constante e repita com 1x tampão de lavagem fresco. Toque e mexa para remover o excesso de líquido das lâminas e coloque-as novamente no suporte de lâminas. Adicione aproximadamente quatro gotas de AMP1 em temperatura ambiente por seção para cobrir totalmente cada seção. Cubra a bandeja com uma tampa e leve ao forno por 30 minutos a 40 graus Celsius.
Depois de retirar a bandeja do forno, remova a grade deslizante. Trabalhando uma lâmina de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque a lâmina no suporte de lâminas submersa em um prato de coloração cheio de 1x tampão de lavagem, lavando por 2 minutos em temperatura ambiente com agitação constante e repita com 1x tampão de lavagem fresco.