Cultura de salispheres a partir de tecido de glândulas salivares: um método para desenvolver salispheres a partir de células epiteliais derivadas de glândulas salivares humanas

Os salispheres são culturas in vitro, auto-agregadoras, de células epiteliais derivadas da glândula salivar. Para cultivar salispheres, comece retirando o tecido da glândula salivar humana em uma placa de cultura.

Usando uma tesoura, pique o tecido em pedaços finos. Em seguida, complemente essas peças com uma solução de dissociação contendo enzimas colagenase e dispase e incuba. Essas enzimas digerem a matriz extracelular presente no tecido.

Além disso, triturar para homogeneizar o tecido. Esta etapa libera as células epiteliais e as hemácias na solução. Em seguida, use um filtro de células e filtre o homogeneizado de tecido em um tubo cônico fresco para remover pedaços de tecido não digeridos e detritos. Centrifugue para pellet as células.

Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular no tampão de lise das hemácias. Este tampão rompe as hemácias presentes na suspensão celular.

Agora, centrifugue para peletizar as células epiteliais. Ressuspenda o pellet em um meio de crescimento de células epiteliais apropriado. Além disso, prepare a placa de cultura do salisphere revestindo seu poço com uma matriz de membrana basal liquefeita ou BMM. Incube para permitir que a matriz se solidifique.

Finalmente, adicione a suspensão de células epiteliais nos poços revestidos com BMM. Na presença de meios de crescimento, as células epiteliais se ligam à camada BMM e proliferam em salispheres esféricas.

Dentro de duas a quatro horas após a remoção do paciente, em uma placa de cultura, use uma tesoura de dissecação esterilizada em autoclave e uma pinça cirúrgica para picar o tecido da glândula salivar em pedaços finos do tamanho de 1 a 2 milímetros. Adicione 6 mililitros da solução de dispase/colagenase ao tecido picado. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos a uma hora.

Rompa o tecido pipetando com a pipeta sorológica de 5 mililitros, 15 a 20 vezes. Incube a 37 graus Celsius por mais 30 minutos a uma hora. Repita a etapa de pipetagem e incubação mais duas a três vezes ou até que o tecido se assemelhe a uma pasta e possa passar facilmente pela abertura da pipeta.

Para revestir os poços com BMM, pipete lentamente 500 microlitros de BMM descongelado durante a noite em cada poço de uma placa de 6 poços. Gire lentamente a placa para distribuir uniformemente o BMM sobre os poços. Em seguida, incube as placas revestidas a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos antes de usar para permitir que o BMM solidifique.

Transfira a solução de dispase/colagenase contendo tecido homogeneizado para um tubo cônico de 15 milímetros. Lave a parede da placa uma vez com 6 mililitros de DPBS para transferir as células restantes para o tubo cônico. Em seguida, através de um filtro de células de malha de náilon de 70 micrômetros, filtre o homogeneizado em um novo tubo cônico de 50 milímetros para remover o tecido não digerido.

Centrifugue as células filtradas por 5 minutos a 500 x g. Aspire o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de tampão de lise de hemácias 1x. Incube por 5 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 20 a 25 milímetros de DPBS para neutralizar o tampão de lise de hemácias e minimizar a lise das células salivares.

Centrifugue por 5 minutos a 500 x g. O glóbulo branco indica lise completa de todas as hemácias. Se o pellet tiver cor vermelha, repita o tratamento com tampão de lise de hemácias. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 a 2 mililitros de BEGM e, em seguida, transfira as células ressuspensas para poços revestidos com BMM.

Incube a 37 graus Celsius. Uma vez plaqueadas no BMM, as células se formarão em estruturas esféricas ou salispheres em um período de dois a três dias. As células podem ser mantidas como salispheres por cerca de cinco a sete dias antes que o BMM comece a se degradar, permitindo que as células acessem e adiram ao plástico e cresçam como uma monocamada.