Cultura de células endoteliais de microvasos cerebrais de ratos: um procedimento para isolar e cultivar células endoteliais de microvasos de cérebro de ratos

Para isolar as células endoteliais cerebrais, primeiro, transfira um cérebro de rato colhido para um prato contendo tampão resfriado.

Depois de remover o cerebelo e os nervos ópticos, divida o cérebro em hemisférios cerebrais. Em seguida, separe o mesencéfalo do prosencéfalo.

Remova as meninges e a substância branca contendo mielina do prosencéfalo, deixando para trás o córtex cerebral para isolar os microvasos.

Em seguida, homogeneizar o córtex para quebrar o tecido nervoso e os constituintes.

Centrifugue o homogenato para remover os detritos celulares e a mielina.

Posteriormente, trate o pellet de tecido com um coquetel de digestão contendo enzimas colagenase, dispase e desoxirribonuclease.

As colagenases e dispases digerem a matriz extracelular que incorpora os microvasos, soltando os fragmentos de microvasos do tecido. As desoxirribonucleases degradam qualquer DNA livre liberado das células lisadas.

Misturar o volume desejado do homogenato digerido com um meio de gradiente de densidade adequado e centrifugar.

Descarte a mielina e a camada superior contendo células parenquimatosas cerebrais, seguidas pelo sobrenadante.

Agora, trate o pellet contendo microvasos com o coquetel de digestão para liberar completamente os fragmentos de microvasos que compreendem células endoteliais e pericitos.

Centrifugue a suspensão. Ressuspenda o pellet contendo fragmento de microvaso em um meio adequado suplementado com puromicina - um antibiótico.

Semeie a suspensão em uma placa revestida de proteína de matriz extracelular e incuba.

Os fragmentos de microvasos aderem ao revestimento da placa. A puromicina elimina seletivamente os pericitos, enquanto os componentes do meio facilitam a proliferação das células endoteliais.

Remova o cérebro do crânio de três ratos Wistar de 5 semanas e transfira os cérebros para uma placa de Petri cheia de tampão de dissecação a frio mantido no gelo.

Disseque os cérebros sem o cerebelo e os nervos ópticos. Em seguida, corte cada cérebro ao meio para separar os dois hemisférios cerebrais.

Sob o estereomicroscópio, faça outro corte para remover o mesencéfalo e transfira todos os prosencéfalos para uma placa de Petri limpa no gelo com tampão de dissecação.

Em seguida, transfira um prosencéfalo para uma nova placa de Petri cheia de tampão de dissecação a frio. Segure-o com o grampo e retire cuidadosamente as meninges das bordas do prosencéfalo.

Depois, vire o prosencéfalo e retire cuidadosamente as meninges sem rasgá-las. Certifique-se de que o prosencéfalo esteja limpo de meninges e corte a parte restante dos nervos ópticos. O objetivo desta etapa é remover o edredom da substância branca para obter uma concha de córtex.

Comece prendendo o prosencéfalo na borda e, em seguida, arraste cuidadosamente a pinça ao longo da superfície, tomando cuidado para não rasgar a superfície do córtex.

Em seguida, certifique-se de que o cérebro esteja livre das meninges, rolando-o para verificar se não há meninges residuais ou grandes vasos superficiais.

Em seguida, começando com a extração dos três cérebros do crânio, o tempo total para a dissecção não deve levar mais de 2 horas para preservação do tecido e sobrevivência celular. Transfira os córtices de três cérebros para 6 mililitros de tampão de dissecção a frio em um homogeneizador Dounce de 7 mililitros.

Posteriormente, dissocie os córtices com 10 movimentos para cima e para baixo com o primeiro pilão de maior folga, seguido por 10 movimentos para cima e para baixo com o segundo pilão de menor folga.

Em seguida, transfira 6 mililitros da suspensão para um novo tubo Falcon de 50 mililitros e lave o homogeneizador Dounce com 24 mililitros de tampão de dissecção a frio. Divida a suspensão em três tubos Falcon para obter o equivalente a um córtex por tubo.

Em seguida, centrifugue a 1000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. A observação do pellet mostra um gradiente de cor rosa, que representa a parte microvaso do homogeneizado dos córtices.

Agora, descarte o sobrenadante e homogeneize o pellet de um córtex com 1 mililitro de solução enzimática contendo uma mistura de colagenases, dispase, DNase tipo 1 e gentamicina.

Coloque os tubos em uma coqueteleira por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, misture 1 mililitro de digestão com 10 mililitros de 25% BSA / HBSS 1X e subtraia suavemente os tubos. Em seguida, separe-os por centrifugação dependente da densidade a 3.600 x g por 15 minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação dependente da densidade, o pellet contém os microvasos e o disco superior contém mielina, parênquima cerebral e microvasos residuais.

Transfira cuidadosamente o disco superior e o sobrenadante para tubos Falcon limpos de 50 mililitros; tome cuidado para não aspirar o pellet de microvasos.

Vortex suavemente o tubo e repita a centrifugação dependente da densidade. Durante esta segunda centrifugação, mantenha o pellet resultante contendo os microvasos a 4 graus Celsius.

Após a segunda centrifugação dependente da densidade, rejeitar cuidadosamente o disco superior e o sobrenadante. Misture e ressuspenda os pellets resultantes contendo os microvasos de ambas as centrifugações com 1 mililitro de HBSS 1X frio.

Em seguida, lave os microvasos com 20 mililitros de HBSS 1X frio e centrifugue a 1.000 x g por 5 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante, tomando cuidado para não perder o pellet de microvasos.

Homogeneizar o pellet de microvasos de um córtex com 1 mililitro da mesma solução enzimática seguindo um vórtice suave dos tubos. Além disso, digerir os microvasos por 1 hora a 37 graus Celsius em uma coqueteleira. Depois disso, misture os microvasos digeridos dos três córtices em um tubo.

Novamente, separe a mistura em dois tubos Falcon de 50 mililitros para obter os microvasos extraídos do equivalente a um córtice e meio por tubo. Em seguida, centrifugue a 1.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.

Imediatamente antes de plaquear os microvasos, retire dois frascos T75 revestidos da incubadora e aspire o excesso de revestimento. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de microvasos em 1 mililitro de MEC.

Leve cada tubo a 10 mililitros com ECM suplementado com 4 microgramas por mililitro de puromicina para iniciar o processo de purificação e colocar os microvasos no frasco.

Em seguida, coloque os frascos na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a adesão dos microvasos à matriz colágeno-fibronectina.

• Endothelial Cells - Cells that line the inside of blood vessels.
• Rat Endothelial Cells - Endothelial cells extracted from a rat's brain.
• Brain Microvessels - Tiny blood vessels in the brain tissue.
• Dispases - Enzymes used to dissociate cells in tissue.
• Microvessels - Small blood vessels, including arterioles, venules, and capillaries.

• The Endothelial Cells lining the inner layer of blood vessels are critical for regulating vascular functions (e.g., endothelial cells).
• Rat Endothelial Cells are used in brain research to understand various neurological issues(e.g., rat endothelial cells).
• Through the isolation of brain microvessels, researchers can study cerebral circulation and disease mechanisms (e.g., brain microvessels).
• Dispase is a bacterial enzyme used in tissue dissociation and cell recovery.
• The isolation of microvessels aids detailed investigation of vessel function and properties in brain tissues (e.g., microvessels).

• What are endothelial cells and how are they important for vascular functions?
• How are rat endothelial cells used in brain research?
• What are brain microvessels and what role do they play in cerebral circulation?
• What is dispase and what is its role in tissue dissociation?
• How are microvessels isolated and what is their significance in studying vessel function?

• Understanding of endothelial cells have direct application in finding vascular dysfunction treatments (e.g., endothelial cells).
• The research on rat endothelial cells paves way for understanding disease mechanisms in human brains (e.g., rat endothelial cells).
• Studying brain microvessels and their functions has vital importance in neurological disease treatment (e.g., brain microvessels).
• Dispase is extensively used in cell culture and regenerative medicine for cell isolation and recovery (e.g., dispase).
• The study of microvessels plays an integral role in circulatory system research and in understanding angiogenesis (e.g., microvessels).