Isolamento de células cerebrais de larvas de peixe-zebra: uma técnica para obter neurônios, macrófagos e microglia intactos do tecido cerebral do peixe-zebra

O cérebro do peixe-zebra consiste em neurônios - células nervosas que desempenham um papel proeminente no processamento de informações. Além disso, compreende uma população de células imunes de suporte, incluindo macrófagos e micróglia, que habitam o espaço interneuronal.

Para isolar todos esses tipos de células cerebrais de um peixe-zebra, primeiro pegue as larvas de peixe-zebra anestesiadas em uma placa de Petri contendo meios apropriados.

Visualize o peixe-zebra sob um estereomicroscópio e corte as cabeças larvais acima do saco vitelino para manter o cérebro intacto.

Transferir as cabeças excisadas para um homogeneizador cheio de meios pré-refrigerados, colocados sobre gelo. A baixa temperatura ajuda a prevenir a degradação das células cerebrais.

Com um pilão, homogeneizar o tecido cerebral do peixe-zebra. A homogeneização desintegra a matriz extracelular e inicia a dissociação de neurônios, macrófagos e micróglia do tecido cerebral.

Esta etapa também separa a mielina - uma camada isolante rica em lipídios - dos neurônios.

Passe o homogeneizado por uma peneira para prender grandes aglomerados de células.

Centrifugue o filtrado para peletizar as células e os fragmentos da bainha de mielina. Descarte o sobrenadante contendo detritos.

Ressuspenda o pellet em um meio de gradiente de densidade apropriado e cubra-o com um tampão.

Gire para baixo no tubo em baixa velocidade. Os fragmentos de mielina mais leves formam uma banda distinta na interface do tampão e do meio de gradiente de densidade, enquanto as células mais densas se depositam na parte inferior.

Aspire as camadas superiores e ressuspenda as células cerebrais em meio fresco para uso posterior.

Adicione 1,5 mililitros de 15 milimolares de tricaína por 50 mililitros de média a 50 larvas para preparar a anestesia. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de 3 mililitros para transferir 10 larvas de cada vez para uma placa de Petri de 55 milímetros cheia de meio E3 gelado com tricaína para anestesiá-las terminalmente.

Sob um estereomicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da placa de Petri. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, corte as cabeças das larvas acima do saco vitelino.

Com uma pipeta Pasteur de 3 mililitros, pegue todas as cabeças e, com o mínimo de líquido possível, transfira-as para um homogeneizador de vidro com gelo contendo 1 mililitro de meio A gelado.

Substitua cada pequena placa de Petri contendo E3 mais Tricaína gelada por uma nova a cada 30 minutos para garantir que a transecção seja realizada em meio E3 mais Tricaína frio.

Substitua a Mídia A gelada no homogeneizador de vidro quando a cor começar a desbotar. Uma vez recolhido todo o grupo de cabeças, retirar todo o meio A do homogeneizador de vidro e substituí-lo por 1 mililitro de meio A fresco gelado.

Com o homogeneizador ainda no gelo, use um pilão bem ajustado para romper o tecido cerebral realizando 40 rodadas de esmagamento e voltas para larvas de 3 a 5 dpf e 50 rodadas para larvas de 7 e 8 dpf.

Em seguida, adicione 2 mililitros de Meio A à suspensão celular para diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina. Elimine a aglomeração celular passando a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons em um tubo de falcão frio de 50 mililitros no gelo. Repita esta etapa três vezes.

Transfira alíquotas de 1 mililitro de suspensão celular para tubos frios de 1,5 milímetro e gire-os a 300 x g e 4 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, usando uma seringa de 10 mililitros com a agulha 23G x 1", remova o sobrenadante.

Com 1 mililitro de meio de gradiente de densidade de 22% gelado, suavemente sobreposto por 0,5 mililitros de 1x DPBS gelado, ressuspenda suavemente o pellet celular. Gire os tubos a 950 x g sem interrupção e acelere lentamente a 4 graus Celsius por 30 minutos.

Após a centrifugação, descarte o meio de gradiente de densidade DPBS e a mielina presa na interface. Em seguida, use 0,5 milímetros de Mídia A com 2% de NGS para lavar as células e gire os tubos a 300 x g a 4 graus Celsius por 10 minutos.

Remover o máximo de sobrenadante possível e, em seguida, puxar os grânulos celulares da mesma condição experimental em 1 mililitro de Meio A com 2% de NGS.

Se as células de interesse expressarem uma proteína fluorescente, passe a suspensão celular por uma tampa de filtro de célula de 35 mícrons e transfira-as para tubos FACS frios de 5 mililitros em gelo protegido da luz.