Eletroporação ex vivo de fatias cerebelares de embriões de galinha: um método para introduzir DNA de plasmídeo que codifica proteína fluorescente verde para visualizar o desenvolvimento de células granulares

As células granulares cerebelares são o tipo de neurônio mais abundante no cérebro. A camada granular externa, EGL, é composta apenas de precursores de células granulares, GCPs, que se diferenciam e migram para dentro para formar a camada granular interna, IGL.

Para visualizar o desenvolvimento de células granulares, prepare uma câmara de eletroporação anexando um ânodo à base de uma placa de Petri. Adicione meio de cultura para cobrir o eletrodo. Agora, coloque uma inserção de cultura no eletrodo coberto com meio. Transfira as fatias de cerebelo do embrião de galinha para o inserto de cultura em uma orientação sagital.

O plano sagital permite que a camada-alvo EGL seja identificada em diferentes camadas do cerebelo. Adicione uma solução de corante viscoso contendo um DNA de plasmídeo GFP sobre EGL. O DNA do plasmídeo GFP codifica uma proteína fluorescente verde que se distribui homogeneamente dentro do citoplasma da célula e permite a imagem de células vivas.

Em seguida, coloque um cátodo no meio próximo ao EGL, mas não diretamente no tecido. Em seguida, aplique vários pulsos elétricos a diferentes regiões EGL. Os pulsos elétricos induzem poros temporários na membrana celular, permitindo que as células absorvam o DNA do plasmídeo. Posteriormente, o DNA do plasmídeo permite a expressão de GFP em células granulares.

Visualize as fatias cerebelares sob um microscópio de fluorescência para observar a diferenciação celular granular e o padrão de migração em diferentes estágios de desenvolvimento celular.

Construa uma câmara de eletroporação fixando o ânodo de um eletroporador na base de uma placa de Petri de 60 milímetros usando fita isolante. Adicione aproximadamente 1 mililitro de HBSS para cobrir o eletrodo. Em seguida, coloque uma inserção de cultura de 0,4 micrômetro em cima do eletrodo coberto com HBSS.

Use uma pipeta Pasteur de 3 mililitros com ponta cortada para transferir as fatias identificadas, até 5 por inserto para o inserto de cultura. Em seguida, separe as fatias e deixe-as assentar no inserto da cultura em uma orientação sagital. Usando uma pipeta, remova o excesso de meio das fatias do cérebro. Deixe o inserto descansar no eletrodo para que haja contato entre o inserto e o eletrodo.

Nesta configuração, o inserto de cultura com as fatias repousará sobre a superfície do meio, mantendo o circuito, mas permitindo o direcionamento espacial do cátodo. Usando uma ponta de pipeta P10, pipete 5 microlitros de DNA diluído com 20% de Fast Green sobre a superfície de uma região alvo de cada fatia. A adição de Fast Green garante que a solução de DNA seja viscosa o suficiente para proibir a ampla dispersão do DNA.

Em seguida, coloque o cátodo sobre o tecido alvo desejado e eletropore as amostras. Evite o contato direto do cátodo com o tecido, colocando-o o mais próximo possível do tecido, sem realmente tocá-lo. Repita a eletroporação em várias regiões da camada granular externa em cada fatia cerebelar individual, conforme desejado.

Quando terminar, transfira a inserção de cultura para uma placa de Petri de 30 milímetros. Para cada cultura, adicione 1 mililitro de meio de cultura pré-aquecido embaixo do folheto de cultura. Certifique-se de que a pastilha não flutue no meio. A inserção de cultura deve estar em contato com o meio, mas as fatias não devem ser banhadas nele.