Isolamento de células endoteliais da aorta suína (pAEC): um método baseado em enzimas para isolar células endoteliais da aorta abdominal suína colhida

A aorta - a principal artéria que transporta sangue oxigenado do coração para o corpo - é composta por três camadas ou 'túnicas': uma íntima interna, uma média média e uma adventícia externa. As células endoteliais ou CEs estão presentes na íntima como uma monocamada fina e contínua sobre uma membrana basal de suporte que consiste em proteínas estruturais, principalmente colágeno.

Para isolar CEs, comece com uma aorta suína colhida em uma placa de cultura. Extirpar suas extremidades e qualquer tecido aderente circundante para evitar a contaminação das células não endoteliais. Lave a aorta com tampão contendo antibióticos para inibir o crescimento microbiano.

Passe uma sutura cirúrgica estéril pela aorta e amarre uma de suas extremidades, mantendo a sutura dentro do lúmen. Prenda a extremidade amarrada e retraia a sutura para inverter completamente a aorta. Isso expõe a íntima contendo CE à digestão enzimática. Trate a aorta com solução de colagenase pré-aquecida e de baixa concentração para uma atividade enzimática ideal e incube.

A colagenase decompõe as proteínas de colágeno presentes na membrana basal subjacente aos CEs, iniciando sua dissociação. Após a incubação, adicione tampão resfriado para inativar as enzimas colagenase.

Raspe suavemente a superfície íntima da aorta e enxágue-a com tampão para liberar os CEs na solução. Centrifugue esta solução para peletar os CEs. Ressuspenda o pellet em meio adequado. Semear a suspensão celular num balão de cultura e incubar. Os ECs aderem ao fundo do frasco e proliferam.

Para o isolamento das células endoteliais da aorta suína, transfira a aorta do porco para uma placa de Petri de 150 milímetros em condições assépticas e remova suavemente ambas as extremidades do vaso. Apare qualquer excesso de tecido adicional onde o vaso foi clampeado, com pinças e tesouras estéreis, e use 20 a 50 mililitros de tampão de lavagem fresco para enxaguar a parte externa e interna da aorta.

Em seguida, passe uma sutura cirúrgica pela aorta e amarre frouxamente uma extremidade do vaso, mantendo a sutura dentro do lúmen. Fixe suavemente a aorta perto da extremidade amarrada com uma pinça e, em seguida, puxe as suturas cirúrgicas lentamente para reverter a aorta até que a superfície endotelial da aorta esteja exposta.

Lave a superfície endotelial da aorta três vezes com 10 mililitros de tampão de lavagem fresco por lavagem e coloque a aorta em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Cubra a amostra com 10 mililitros de solução digestiva de colagenase IV a 0,005% aquecida a 37 graus Celsius e incube o tecido a 37 graus Celsius por 15 minutos.

No final da incubação, transfira todo o conteúdo do tubo para uma placa de cultura de 100 milímetros e interrompa a digestão com 10 a 15 mililitros de tampão de parada pré-resfriado. Usando um raspador de células, remova suavemente as células endoteliais da aorta da superfície interna do vaso e lave o vaso três vezes com 5 mililitros de tampão de lavagem por lavagem.

Após a última lavagem, transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e lave o fundo da placa de cultura duas vezes com 5 mililitros de tampão de lavagem fresco por lavagem, acumulando as lavagens no tubo de 50 milímetros.

Colete as células por centrifugação e descarte todas, exceto os últimos 10 mililitros de sobrenadante. Adicione 20 mililitros de tampão de lavagem para ressuspender os pellets, tomando cuidado para evitar bolhas, e colete as células com outra centrifugação.

Ressuspenda o pellet em 1 mililitro de meio de cultura de células para contagem e coloque as células em uma concentração de 1 x 10 a 6 células por frasco quadrado de 25 centímetros. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, atualizando o meio a cada 2 a 3 dias.