Coloração com ácido periódico de Schiff de células: uma técnica in vitro para detectar níveis de glicogênio em células mononucleares do sangue periférico

As células mononucleares do sangue periférico, ou PBMCs, são células sanguíneas circulatórias com núcleos grandes e únicos, compreendendo linfócitos B e T, células assassinas naturais, monócitos e células dendríticas. As PBMCs armazenam o excesso de glicose na forma polimérica como glicogênio - um polissacarídeo ramificado - em seu citoplasma.

Para detectar a presença de glicogênio em PBMCs, prepare um esfregaço uniforme de PBMCs isolados em uma lâmina de vidro. Trate as células com formalina - uma solução fixadora, que reticula as biomoléculas celulares, preservando a integridade estrutural dos PBMCs.

Mergulhe parcialmente a lâmina em solução de amilase. Esta enzima entra nas células e hidrolisa o glicogênio nas células tratadas. Isso resulta em duas populações de células distintas - células ricas em glicogênio tratadas com enzimas, deficientes em glicogênio e não tratadas com amilase.

Cubra-os com solução de ácido periódico que converte oxidativamente os grupos hidroxila das moléculas de glicogênio em aldeídos.

Enxágue a lâmina em água para interromper a reação de oxidação e remover o excesso de ácido periódico. Trate a lâmina com reagente de Schiff, que reage com os grupos aldeídos do glicogênio tratado com ácido periódico, gerando um complexo insolúvel de cor magenta.

Aplique mídia de montagem para restringir as células durante a geração de imagens. Coloque uma lamínula para espalhar a mídia de montagem por toda a superfície do slide para melhor visualização. Imagem das células coradas.

As células não tratadas com amilase contêm grânulos de glicogênio magenta, ausentes nas células tratadas com enzimas.

Nesta etapa, coloque o slide em uma superfície plana. Aplique 2 mililitros de solução de ácido periódico na amostra e incube por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue a lâmina várias vezes com água destilada. Aplique 2 mililitros de reagente de Schiff na lâmina e incube em temperatura ambiente por 15 minutos.

Em seguida, lave a lâmina com água destilada por 5 minutos e, em seguida, deixe-a secar ao ar. Em seguida, aplique 100 microlitros de mídia de montagem no slide e cubra-o com uma lamínula grande ou aplique 50 microlitros e use duas lamínulas pequenas. Depois disso, aplique esmalte transparente nas bordas da lamínula. Deixe-os secar durante a noite.

Em seguida, obtenha imagens com o microscópio de luz binocular usando a objetiva 100X.