Name: Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar exossomos contendo RNA usando ultracentrifugação, microscopia eletrônica e citometria de fluxo. Este método permite analisar o conteúdo molecular e funções biológicas das vesículas.

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Este estudo foi financiado pelo Conselho de Pesquisa sueco (K2008-57x-20 676-01-3).

1. Isolamento exossomo <ol><li> Cultivar células em meio com exossomo livre de soro. Assim, qualquer soro adicionado ao meio de cultura celular deve ser esgotado de exossomos por ultracentrifugação a 120 000 xg durante a noite a 4 ° C antes do uso. </li><li> Transferir a suspensão celular para tubos cônicos. </li><li> Centrifugar a 300 xg por 10 minutos a 4 ° C para sedimentar as células. </li><li> Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação e, se não completamente cheio adicionar PBS. </li><li> Centrifugar a amostra a 16 500 xg por 20 minutos a 4 ° C para continuar a remover as células e restos celulares. </li><li> Filtrar o sobrenadante através de um 0,2 m de filtro para remover partículas maiores que 200 nm. </li><li> Transferir o sobrenadante filtrado para tubos de ultracentrífuga novo e fechar os tubos antes de ultracentrífuga a 120 000 xg por 70 minutos a 4 ° C para agregar as exossomos. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Para recuperação exossomo máxima, ressuspender o exossomo enriquecered pellet repetidamente em um pequeno volume (~ 3 x mL 50) de um tampão apropriado. Esse buffer depende das experiências jusante planejada após o isolamento exossomo. Por exemplo, tampão de lise é usado para a proteína e isolamento de RNA, PBS é usado para microscopia eletrônica e citometria de fluxo e por meio de estudos funcionais podem ser preferidos. </li></ol> Nota; exossomos também pode ser isolado de fluidos corporais diferentes, tais como plasma, usando o mesmo procedimento que para meios de cultura de células. Para fluidos viscosos, pode ser necessário para diluir a amostra com PBS antes da centrifugação e filtração. Em relação à velocidade de centrifugação para o ponto 5 acima, pode ser aumentada para 29 500 xg, ea ultracentrifugação no ponto 7 pode ser estendido para 90 minutos 18. Se a amostra precisa ser mais purificada do pellet exossomo pode ser lançada em um gradiente de sacarose e os exossomos serão principalmente encontrados na fração represeNTING uma densidade de 1,13-1,19 g / ml 2. 2. Identificação exossomo por microscopia eletrônica <ol><li> Para continuar a reduzir proteínas contaminantes, ressuspender o pellet exossomo enriquecido em PBS e ultracentrífuga a 120 000 xg por 70 minutos a 4 ° C para a re-pellet exossomos. </li><li> Dê uma pequena alíquota da amostra para isolamento de proteínas e de medição de proteína total. Certifique-se que apenas uma pequena parte da amostra é lisados ​​e utilizado para a medição de proteína e manter o exossomos intacta, resolvido em PBS, em separado sobre o gelo ou a -80 ° C para novas experiências. </li><li> Colocar uma gota, cerca de 10 mg de proteína exosomal do exossomos intacta ressuspenso em PBS, em uma Parafilm. Então, com uma pinça, com cuidado a posição de uma grade de carbono formvar níquel revestido em cima de cada gota de 30-60 minutos. Garantir que a grade está posicionado com o lado voltado para a queda de revestimento contendo exossomos. </li><li> Coloque três gotas, cada mL 30, da PBS em tele Parafilm e lave a grade sequencialmente, o posicionamento da grade em cima das gotas de PBS, e usar um papel absorvente entre elas. Use o papel absorvendo suavemente apenas mantendo-lo de perto ao lado da grade, sem fazer contato com a área revestida. </li><li> Fixar a amostra por depositar uma gota de paraformaldeído 2% sobre o Parafilm e colocar a grade em cima da queda de 10 minutos. </li><li> Repita a etapa de lavagem no ponto 4, antes de imunomarcação com um anticorpo apropriado. Os anticorpos usados ​​são anti-CD63 e anti-MHC classe II. Microscopia eletrônica também pode ser realizada sem imunomarcação como exossomos podem ser identificados apenas com base no tamanho e morfologia. No entanto, recomendamos para avaliar o tamanho, morfologia e da presença de uma proteína de membrana para uma validação mais conclusivos. </li><li> Transferência da grelha para uma queda de 30 mL do anticorpo primário de escolha e incubar por 40 minutos. Lavar, repetindo o ponto 4, mas o uso de 0,1% de soro albumina bovina na PBS em vez de PBS sozinho. </li><li> Repita o ponto 7, mas com a 10 nm de ouro-anticorpo marcado secundário e lavar com PBS sozinho. </li><li> Pós-fix da amostra pela adição de uma gota de glutaraldeído 2,5% para o Parafilm e incubar a grade em cima da queda de 10 minutos. Repita a lavagem no ponto 4, mas use cinco gotas de água deionizada em vez de três gotas de PBS. </li><li> Contraste da amostra, adicionando uma gota de acetato de uranila 2% para o Parafilm e incubar a grade em cima da queda de 15 minutos. </li><li> Incorporar a amostra pela adição de uma gota de metil-celulose 0,13% e acetato de uranila 0,4% para o Parafilm e incubar a grade em cima da queda de 10 minutos. </li><li> Retire o excesso de líquido com cuidado usando um papel absorvente, antes de posicionar a grade em um papel com o lado revestido para cima e deixe secar por 5 minutos. </li><li> Examine os preparativos com um microscópio eletrônico ou armazenar as redes em uma caixa de grade para trabalhos futuros. </li></ol> 3.Caracterização exossomo por citometria de fluxo Como exossomos são muito pequenos para serem detectados pelo equipamento atual citometria de fluxo, é necessário primeiro não amarrar o exossomos para contas revestidas de anticorpo (Figura 1). Estas contas podem ser comprados como um produto pronto feito ou feito em laboratório com o anticorpo de escolha. Dependendo da origem exosomal celular, diferentes anticorpos pode ser acoplado a grânulos que podem ser tanto de caráter magnético ou látex. Atualmente usamos anti-MHC classe II ou anti-CD63 grânulos revestidos para esta análise. <ol><li> Para o uso de "caseiro" contas revestidas de anticorpo, usamos quatro esferas de látex M revestido com anticorpos anti-CD63. Lavar 25 mL 4 contas de látex M (30 x 10 6 esferas) duas vezes em 100 l MES buffer, 3 000 xg por 15-20 minutos e dissolver o sedimento em 100 mL de buffer MES. Prepare a mistura de anticorpos contendo um volume igual de 12,5 mg de anticorpos com o mesmo volume de tampão MES. Adicione ocontas à mistura anticorpo e incubar sob agitação durante a noite em temperatura ambiente. Lave as contas revestidas de anticorpo três vezes com PBS (3 000 xg por 20 minutos) e dissolver o sedimento em 100 l de tampão de armazenamento (com uma concentração final de 300 000 contas / mL). </li><li> Para cada amostra (cada anticorpo), continue com um volume igual a um mínimo de 30 mg de proteína exosomal (do exossomos intacta resolvido em PBS) por ~ 100 000 contas revestidas de anticorpo. </li><li> Incubar exossomos e contas, em um volume total de 300 mL PBS, durante a noite a 4 ° C em movimentos suaves. </li><li> Bloco, adicionando 300 ml de 200 mM de glicina e incubar por 30 minutos. </li><li> Lavar os complexos exossomo-bead duas vezes em tampão de lavagem (soro 1-3% em PBS), a 600 xg por 10 minutos. </li><li> Incubar os complexos exossomo-talão com 50 mL de anticorpos IgG a 4 ° C. Lavar os complexos exossomo-bead duas vezes em tampão de lavagem, tal como descrito na etapa 5. </li><li> Adicionar 90 mL tampão de lavagem e 10 mlanticorpo de escolha (de preferência anti-CD9, anti-CD63 ou anti-CD81) para os complexos exossomo-talão e incubar por 40 minutos sob movimento suave. Lavar os complexos exossomo-bead duas vezes em tampão de lavagem, tal como descrito na etapa 5. </li><li> Adicionar 300 mL de tampão de lavagem e aquisição de dados usando citometria de fluxo. </li></ol> Como discutido acima, contas diferentes podem ser usados, tais como esferas de látex como descrito no protocolo ou esferas magnéticas. Se esferas magnéticas são usadas em vez, por favor, note que o protocolo é um pouco diferente. A etapa de bloqueio (ponto 4) não é necessária ea lavagem é realizada com a colocação do tubo em um suporte magnético em vez de uma centrifugação. O buffer de armazenamento utilizado para a "homemade" contas revestidas de anticorpo, contém 0,1% de glicina e de sódio a 0,1% Azid em PBS, com um pH de 7,2. Importante, certifique-se usar o soro exossomo esgotados para o tampão de lavagem de citometria de fluxo (1-3% de soro em PBS), para evitar qualquerexossomos soro contaminar a análise. Nota; ao realizar caracterização exossomo usando anticorpos contas junto é importante reconhecer que é apenas uma subpopulação específica, específica para o anticorpo utilizado, que é isolada e caracterizada. 4. Exossomo detecção por Western blot Western blot é um método bem estabelecido e não vamos entrar em detalhes sobre o método em si, mas o foco sobre a importância de um isolamento de proteínas adequada antes do Western blot e os diferentes anticorpos utilizados. <ol><li> Dissolver o sedimento exossomo no tampão de lise de proteínas de escolha e de pipetagem completamente, seguido de vortex-mistura. Para mais lisar as exossomos, sonicate a amostra em banho-maria 3 x 5 minutos com vortex de mistura entre eles. Finalmente centrifugar a amostra, 13 000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente, e transferir o sobrenadante para um tubo eppendorf novo. </li><li> Measure a proteína total por um método de escolha e de carga 20-50 mg de proteína por poço. </li><li> Separar e transferir as proteínas por eletroforese em gel e eletroforese. </li><li> Bloco e lave a membrana antes de realizar imunocoloração contra proteínas enriquecido em exossomos. </li><li> Detectar a proteína específica por quimioluminescência sistema de imagem, digital e software de análise. </li></ol> Como não há marcadores específicos exossomo, proteínas que são enriquecidos em exossomos, de todas as origens diferentes celulares, são comumente usados ​​para a detecção exossomo. Estes são proteínas, como tetraspanins (por exemplo, CD9, CD63 e CD81), proteína do citoesqueleto associados (por exemplo Ezrin) e proteínas envolvidas na biogênese multivesiculares (por exemplo, Tsg101 e alix). Outras proteínas que também são comumente detectados em exossomos são Flotillin, Hsc70 e proteínas rab diferentes etc, no entanto, também existem células proteínas específicas encontradas em exossomos como A33 (células do epitélio intestinal), CD3(Células T) e MHC classe II (células apresentadoras de antígenos). Assim, dependendo do que tipo de célula do exossomos são liberados a partir dos marcadores para a detecção pode variar. Como outros compartimentos da célula também pode produzir vesículas, é mais recomendada para determinar a presença de proteínas a partir desses compartimentos, como o retículo endoplasmático (por exemplo, calnexin e Grp78) eo aparelho de Golgi (por exemplo, GM130). Assim, a falta dessas proteínas indica pouca ou nenhuma contaminação de outros compartimentos de vesículas na amostra estudada. 5. Isolamento do RNA e análise exosomal RNA <ol><li> Dissolver o sedimento exossomo no tampão de lise RNA de escolha e executar extração de RNA. Kits de isolamento diferentes RNA pode ser usado de acordo com experimentos a jusante, mas os métodos de coluna com base fornece amostras com um espectro mais amplo de RNA. Atualmente estamos usando miRCURY Kit Isolamento RNA por Exiqon, mas outros kits pode ser adequado, dependendo do scquestão ientific na mão. </li><li> Ao realizar o isolamento do RNA é importante trabalhar em um ambiente livre de RNase. Portanto, use de ácido nucléico e dicas nuclease livre pipeta e limpe juízes e equipamentos livres de contaminantes e RNases. </li><li> Para o isolamento do RNA, usando miRCURY Kit Isolamento RNA, dissolver o sedimento exossomo em 350 ml de solução de lise e executar vórtice de mistura por 15 segundos. </li><li> Adicionar 200 mL de etanol a 95% e vortex de mistura por 10 segundos. </li><li> Coloque uma coluna em um tubo de coleta e transferir os exossomos lisadas para a coluna e centrifugar 1 minuto a 14 000 x g. </li><li> Lavar três vezes adicionando 400 mL de solução de lavagem para a coluna que contém o RNA exosomal e centrifugar por 1 minuto a 14 000 x g. </li><li> Centrifugar por 2 minutos a 14 000 xg para se certificar de que a coluna é seco e colocar a coluna seca em um tubo eppendorf RNase-free. </li><li> Adicionar 50 mL tampão de eluição para a coluna e centrifugar por 2 minutos a 200 xg, seguido de 1 minuto a 14 000 x g. </li><li> Continue com o RNA isolado ou armazená-lo em -80 ° C. </li></ol> Para detecção e análise do RNA total extraído exosomal, use um Agilent 2100 Bioanalyzer com o RNA 6000 Nano ou Kit Pico RNA 6000. A análise mostra o rendimento RNA exosomal e distribuição de tamanho. 6. Resultados representante Exossomos são pequenos demais para ser detectado pelos métodos de citometria de fluxo disponíveis, e são, portanto, ligado ao anticorpo revestido contas antes de serem analisados ​​(Figura 1). Como exossomo-bead complexos pode agregar o fluxo gráfico de dispersão citometria pode conter diferentes populações de solteiro, duplo e triplo grânulos (Figura 2A). A seta indica as contas individuais que são analisados. A CD63 positivo população de esferas-exossomo único em relação ao seu controle isotipo é mostrado na Figura 2B. e_content "&gt; Devido ao tamanho pequeno de exossomos, eles só podem ser visualizados diretamente com microscopia eletrônica, e não por microscopia de luz. típicas características morfológicas de exossomos são arredondados e 3-10 nm vesículas da membrana de tamanho. Na Figura 3, microscopia eletrônica fotografias mostram exossomos imunocoradas (A) com o ouro marcado com anticorpos para CD63 (indicado pela seta) e não-histoquímica exossomos (B). Para determinar que o vesículas isoladas são, na verdade exossomos e de melhor caracterizar as proteínas exosomal, Western Blot é comumente usado. Figura 4 mostra a ausência de calnexin, um marcador de retículo endoplasmático. Isto indica a contaminação pouco de vesículas do retículo endoplasmático. Além disso, a Figura 4 mostra as presenças de CD81 em exossomos, que é um tetraspanin comumente enriquecido em exossomos. RNA celular contêm principalmentes RNA ribossomal (rRNA), vistos como os dois picos proeminentes para o 18S rRNA 28S e subunidades em uma análise Bioanalyzer (Figura 5A). No entanto, RNA exosomal diferem em seu perfil como exossomos falta os dois picos rRNA (18S e 28S) e são ricos em RNA curto, como mRNA e miRNA (Figura 5B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Devido ao tamanho pequeno de exossomos (3-10 nm), eles não podem ser distinguir do ruído de fundo e, quando analisados ​​por citometria de fluxo. Portanto, é necessário anexá-los a contas revestidas de anticorpo antes da exossomos são analisados, que depois podem ser visualizadas pelo laser. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. As contas exossomo complexo pode agregar entre si e formam grânulos duplos e triplos (A). A seta está demonstrando o único grânulo-exo alguns população, que é fechado e usado para análise posterior. Essa população será diretamente comparado com um controle isotipo (cheio de cinza de pico) para determinar a presença de moléculas de membrana da exossomos. CD63 exossomos positiva (pico preto aberto) são mostrados na figura B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microscopia eletrônica de exossomos com a morfologia típica e tamanho (40-80 nm) (A e B). A seta na figura A indica a partícula de ouro do anticorpo secundário, verificando-se que este exossomo têm CD63 em sua superfície da membrana. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Resultados Western Blot mostrando a ausência do calnexin retículo endoplasmático proteína, mas a presença da proteína comumente enriquecido em exossomos, tetraspanin CD81. ve_content "&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Resultados Bioanalyzer mostrando presença de RNA em células (A) e exossomos (B). Setas indica a 18S e subunidades 28S rRNA presente em células. Como exosomal RNA viril contêm RNA pequenos rRNA pouco ou nenhum é identificado em exossomos.

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JL é um co-proprietário de uma patente relacionada com a utilização de exossomos como vetores para a transferência de RNA para as células.

Ao estudar o conteúdo molecular e / ou função de exossomos, é fundamental usar um método de isolamento de alta qualidade que proporciona um rendimento adequado e do grau mais baixo possível de contaminação. A metodologia descrita neste artigo é uma abordagem bem estabelecida para isolar exossomos e estudar seu conteúdo RNA e função biológica. Além disso, a importância da caracterização do exossomos isolada, por uma combinação de diferentes métodos, incluindo microscopia eletrônica, citometria de fluxo e Western blot, é realçado. Ao isolar exossomos, a primeira etapa de centrifugação (300 xg) é usado para células pellet que podem estar presentes na suspensão celular ou o fluido biológico estudado. A segunda centrifugação a 16 500 xg precisa ser suficientemente forte para células pellet mortos, maiores detritos, corpos apoptóticos e outras organelas. Após esta centrifugação, alguns protocolos incluem um passo nano-filtração, mas alguns investigators ter excluído essa etapa. No entanto, ressaltamos a importância de fragmentos de erradicação e vesículas maiores que 200 nm e, portanto, recomendamos incluindo uma etapa de filtração. Se um isolamento mais rigoroso é necessário, a 100 nm filtros podem ser utilizados, mas note que se fluidos viscosos são usados, estes filtros podem facilmente tornar-se bloqueado e material exosomal está perdido. Além disso, uma filtração nm 100 pode afetar a morfologia do exossomos e, além disso, se exossomos estão na escala maior eles podem ser perdidos. Assim, os 200 nm filtros parecem adequadas para o isolamento exossomo. Após a filtração, a ultracentrifugação obrigatória a 120.000 xg é usada para sedimentar as exossomos. Os exossomos podem ser novamente lavado com PBS, obrigado a contas revestidas de anticorpo e lavado, ou colocado em um gradiente de sacarose para remover proteínas contaminação. No entanto, este pode ser um processo muito demorado de recursos que argumentam não ser necessário, especialmente se o volume inicial da amostra é pequena e / ou o conteúdo de RNA of o exossomos é baixa, como medidas adicionais diminuirá substancialmente o material adicional. No entanto, mais uma vez, a natureza das vesículas isoladas deve ser comprovada pela presença e ausência de certas proteínas. Até o momento, nenhum marcador de proteína absolutamente única para exossomos foi identificado para verificar se a amostra contém exossomos e nada mais. Como resultado, uma combinação de métodos são necessários para caracterizar a exossomos, incluindo a determinação do tamanho e da morfologia do exossomos por microscopia eletrônica. Além disso, a pureza da amostra pode ser determinada por microscopia eletrônica, como este método pode fornecer uma visão geral do nível de contaminação da amostra, por exemplo, com vesículas maiores, como micropartículas, corpos apoptóticos ou restos celulares. Além disso, o teor de proteína do exossomos pode ser determinada por citometria de fluxo e Western blot, ea combinação destes dois métodos resulta em uma análise de ambas as membranas o limite (por exemplo, CD63 eCD81) e internalizado proteínas (por exemplo, Tsg101 e alix) do exossomos. Detecção de proteínas enriquecido em exossomos, como CD63, e Tsg101 alix, ea ausência de proteínas, como o retículo endoplasmático proteína calnexin, é uma indicação de que o exossomo enriquecido pellet é realmente exossomos e não vesículas contaminação de outros compartimentos da célula. O perfil do RNA que é detectado em exossomos é fundamentalmente diferente à do RNA encontrado em células intactas. Assim, RNA exosomal analisados ​​por Bioanalyzer ou em gel abordagens baseadas em análise de RNA falta os dois picos para o 18S e subunidades 28S rRNA, que são proeminentes na análise de RNA celular. Por isso, argumentam que a detecção de quantidades significantes de rRNA em uma amostra indica que o RNA total extraído não é de origem exosomal sozinho, e, portanto, que o método de isolamento precisa ser melhorado e qualidade assegurada.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Isolamento exossomo </td></tr><tr><td> Optima ultracentrífuga L-90K </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Quick-selar tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Dependendo do rotor utilizado diferentes tubos são necessários. Ti70 (342.414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Seal Tubo Cordless kit Topper </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Seringa Filter, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Para fluidos viscosos e / ou grandes volumes, um sistema de filtração a vácuo, 0,2 m, com a VWR International pode ser usado em vez (514-0600). </td></tr><tr><td> Microscopia eletrônica </td></tr><tr><td> Formvar / carbono revestido grades de níquel </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse-anti-CD63 humano </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Conc final: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Isotipo controle; IgG1K (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Conc final: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Anti-IgG de rato conjugado ouro, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Conc Final: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega microscópio eletrônico </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Ou equipamento equivalente. </td></tr><tr><td> Citometria de fluxo </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / sulfato de esferas de látex </td><td> Dynamics interfacial </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpos para o revestimento das esferas de látex </td><td></td><td></td><td> Por exemplo anti-CD63 da BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> Ou equipamento equivalente. </td></tr><tr><td> IgG de soro humano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpos para a detecção </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Por exemplo: anti-CD63 PE (556.020) PE anti-CD9 (555.372) para controlo do isotipo PE anti-CD81 (555.676) (555.749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transônicas T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Ou equipamento equivalente. </td></tr><tr><td> Isolamento do RNA e análise exosomal RNA </td></tr><tr><td> miRCURY RNA Isolation Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de rna-contendo exossomos

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

O campo de pesquisa exossomo está se expandindo rapidamente, com um aumento dramático em publicações nos últimos anos. Essas pequenas vesículas (3-10 nm) de origem endocítica foram propostos para funcionar como uma forma de reticulócitos para erradicar o receptor de transferrina, enquanto amadurecimento em eritrócitos 1, e foram mais tarde chamado exossomos. Exossomos são formadas por brotamento dentro de tarde endossomos, produzindo corpos multivesiculares (MVBs), e são liberados no meio ambiente por meio da fusão da MVBs com a membrana plasmática 2. Desde a primeira descoberta de exossomos, uma ampla gama de células têm sido mostrados para liberar essas vesículas. Exossomos também foram detectadas em vários fluidos biológicos, incluindo plasma, fluido de lavado nasal, saliva e leite materno 3-6. Além disso, foi demonstrado que o conteúdo ea função de exossomos depende da célula de origem e as condições em que são produzidos. Uma variedade de funções foram os demôniosconcentrado para exossomos, como a indução de tolerância contra o alérgeno 7,8, a erradicação de tumores estabelecida em um camundongo 9, inibição e ativação de células natural killer 10-12, promoção de diferenciação em células T reguladoras 13, a estimulação da proliferação de células T 14 e indução de apoptose de células T 15. Ano de 2007 foi demonstrado que exossomos liberados dos mastócitos contêm RNA mensageiro (mRNA) e microRNA (miRNA), e que o RNA pode ser transportados a partir de uma célula para outra através de exossomos. Nas células do destinatário, o mRNA empurrados por exossomos mostrou-se traduzido em proteína, sugerindo uma função reguladora do RNA transferido 16. Além disso, temos também mostraram que exossomos derivadas de células cultivadas sob estresse oxidativo pode induzir tolerância contra o estresse ainda mais em células do receptor e, portanto, sugerem uma função biológica do ônibus exosomal RNA 17. Meios de cultura de células e fluidos biológicos contain uma mistura de vesículas e derramou fragmentos. Um método de isolamento de alta qualidade para exossomos, seguido pela caracterização e identificação do exossomos e seu conteúdo, é, portanto, crucial para distinguir exossomos de outras vesículas e partículas. Aqui, apresentamos um método para o isolamento de exossomos de ambos os meio de cultura de células e fluidos corporais. Este método de isolamento é baseado em centrifugação repetido e etapas de filtração, seguido por uma etapa de ultracentrifugação final em que o exossomos são peletizadas. Métodos importantes para identificar os exossomos e caracterizar a morfologia exosomal e teor de proteína são destacadas, incluindo microscopia eletrônica, citometria de fluxo e Western blot. A purificação do RNA total exosomal é baseado em cromatografia de coluna de rotação eo rendimento RNA exosomal e distribuição de tamanho é analisado usando um Bioanalyzer.

Este artigo demonstra métodos para o isolamento, purificação e detecção de exossomos, bem como técnicas para análise de seu conteúdo molecular. Estes métodos são adaptáveis ​​para o isolamento exossomo de ambos os meios de cultura celular e fluidos biológicos, e podem além da análise de conteúdo molecular também ser útil em estudos funcionais.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

O campo da pesquisa de exossomos está em rápida expansão, com um aumento dramático nas publicações nos últimos anos. Essas pequenas vesículas (30-100 nm) de ...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar se as células e o fluido biológico de interesse liberam ou contêm RNA em exossomos. O primeiro passo para o isolamento de exossomos é remover as células e os detritos celulares. Em seguida, o sobrenadante é filtrado para remover partículas maiores.Os exossomos são então peletizados por ultracentrifugação como segundo passo. Os exossomos são caracterizados por microscopia eletrônica, citometria de fluxo e análise de western blot para demonstrar que as vesículas isoladas possuem a morfologia, o tamanho e a composição proteica típicos de exossomos. Em seguida, o RNA é isolado dos exossomos purificados.Para determinar qual RNA os exossomos contêm, os resultados obtidos por esses métodos bem estabelecidos de purificação, detecção e caracterização de exossomos podem facilitar estudos posteriores sobre os exossomos, como suas funções biológicas. Assim, esta apresentação mostrará como os exossomos podem ser isolados por diferentes métodos, e as duas pessoas que apresentarão isso são minhas duas alunas de doutorado, Maria, El e Cecelia. Er. Boa sorte.A linhagem celular humana de mastócitos, HC um, é utilizada nesta demonstração de isolamento de exossomos para iniciar o procedimento de isolamento. Primeiro, cultive as células em meio com soro livre de exossomos. Em seguida, transfira a suspensão celular para tubos cônicos e centrifugue a 300 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Para pelotizar as células, transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga e centrifugue a amostra a 16.500 ×g durante 20 minutos a quatro graus Celsius para remover mais células e debris celulares. Em seguida, filtre o SANE através de um filtro de 0,2 mícron para remover partículas maiores que 200 nanômetros. Por fim, os tubos de ultracentrífuga contendo o SANE filtrado são selados e submetidos à ultracentrifugação a 120.000 ×g durante 70 minutos a quatro graus Celsius para pelotizar os exossomos.Os exossomos são recuperados abrindo-se o tubo de ultracentrifugação, descartando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet enriquecido em exossomos. Para recuperação máxima de exossomos, ressuspenda repetidamente o pellet enriquecido em exossomos em um pequeno volume de um tampão apropriado em um tubo eppendorf.Lave duas vezes com tampão adicional do mesmo volume que o anterior. O tampão depende do tipo de experimento posterior ao isolamento de exossomos. Para microscopia eletrônica, utilize aproximadamente 10 microgramas de proteína exossomal proveniente dos exossomos intactos.Re-suspendido em PBS. Nossa microscopia eletrônica com grade de níquel revestida de carbono pode ser realizada sem imunomarcação, já que os exossomos podem ser identificados exclusivamente com base no tamanho e morfologia. No entanto, recomenda-se o uso de um anticorpo primário, como anti-CD63 ou anti-MHC classe II, seguido por anticorpos secundários marcados com ouro de 10 nanômetros.Como os exossomos são pequenos demais para serem detectados pelos equipamentos atuais de citometria de fluxo, é necessário primeiro ligar os exossomos a microesferas revestidas com anticorpos. Dependendo da origem celular dos exossomos, diferentes anticorpos são conjugados a microesferas magnéticas ou de látex. Nesta demonstração, serão utilizadas microesferas de látex revestidas com anticorpo anti-CD63 para cada amostra.Utilize um volume equivalente a 30 a 40 microgramas de proteína exossomal de exossomos intactos. Suspenda em PBS e incube os exossomos em microesferas durante a noite a quatro graus Celsius sob agitação suave. No dia seguinte, bloqueie pela adição de 300 microlitros de glicina 200 milimolar e incube por 30 minutos.Lave o complexo de microesferas de exossomos duas vezes e incube os complexos de microesferas de exossomos com 50 microlitros de anticorpo IgG a quatro graus Celsius. Lave os complexos de microesferas de exossomos duas vezes, adicione 90 microlitros de tampão de lavagem e 10 microlitros do anticorpo de escolha aos complexos de microesferas de exossomos e incube por 40 minutos no escuro. Sob agitação suave, lave os complexos de microesferas de exossomos duas vezes, adicione 300 microlitros de tampão de lavagem e transfira as amostras para tubos de citometria de fluxo e adquira os dados utilizando citometria de fluxo.Esta demonstração de Western blot terá como foco a importância de um isolamento proteico adequado antes do Western blot e dos diferentes anticorpos utilizados. Dissolva o pellet de exossomos no tampão de lise proteica de escolha e pipete bem, seguido de mistura em vórtex para lisar ainda mais os exossomos, sonique a amostra em banho de água, centrifugue a amostra a 13.000 ×g durante cinco minutos e transfira o SANE para um novo tubo einor. Meça a proteína total por um método de escolha e carregue a proteína no gel.Em seguida, separe e transfira as proteínas por eletroforese em gel e transferência eletroforética, bloqueie e lave a membrana antes de realizar a imunodetecção contra proteínas enriquecidas em exossomos, já que não existem marcadores específicos para exossomos. Proteínas enriquecidas em exossomos de diversas origens celulares são comumente utilizadas para a detecção de exossomos. Essas proteínas incluem, por exemplo, as tetraspaninas CD9, CD63 e CD81.Proteínas associadas ao citoesqueleto, como a ezrina, e proteínas envolvidas na biogênese de multivesículas, como a TSG 1 0 1 e a LY, como controle negativo para verificar a presença de proteínas contaminantes comumente encontradas em vesículas de outros compartimentos, como a quexina e a GRP 78 do retículo endoplasmático. Diferentes kits de isolamento de RNA podem ser utilizados dependendo dos experimentos planejados. Nesta demonstração, será utilizado um método baseado em coluna durante a realização do isolamento de RNA.É importante usar ponteiras de pipeta livres de ácidos nucleicos e nucleases e limpar a bancada e os equipamentos para remover contaminantes e RNAs. Dissolva o pellet de exossomos em 350 microlitros de solução de lise e vortexe a amostra. Adicione 200 microlitros de etanol a 95% e misture utilizando um vortex.Coloque uma coluna em um tubo de coleta e transfira os exossomos lisados para a coluna e centrifugue. Lave três vezes com 400 microlitros de solução de lavagem para garantir que a coluna esteja seca. Centrifugue por dois minutos a 14.000 vezes G após a última lavagem e coloque a coluna seca em um tubo eppendorf livre de RNAses. Elua o RNA em 50 microlitros de tampão eluente para detecção e análise do RNA total extraído dos exossomos.Um bioanalisador Agilent 2100 pode ser usado com o kit RNA 6,000 nano ou RNA 6,000 pico, pois os exossomos são pequenos demais para serem detectados pelos métodos disponíveis de citometria de fluxo. Eles são ligados a microesferas revestidas com anticorpos antes da análise. Como esses complexos de exossomos e microesferas podem se agregar, um citograma de dispersão pode conter diferentes populações de complexos individuais, duplos e triplos de exossomos e microesferas.Como mostrado aqui, a seta indica a população de complexos de bolas de exossomos simples, que é a população que é posteriormente analisada. Um histograma de citometria de fluxo mostra uma população de bolas de exossomos simples positiva para a proteína CD63. Quanto mais à direita estiver a curva aberta, mais positiva será a amostra para CD63.Devido ao pequeno tamanho dos exossomos, eles só podem ser visualizados por microscopia eletrônica. As características morfológicas típicas dos exossomos incluem vesículas esféricas com tamanho entre 30 e 100 nanômetros. É mostrada uma imunomarcação de exossomos com anticorpo marcado a ouro para CD63, indicada pela seta no Western blot.Os resultados mostram a ausência da proteína da retículo endoplasmático chamada calnexina na amostra exossomal, mas revelam a presença da tetraspanina CD81, uma proteína comumente enriquecida em exossomos. O RNA celular contém principalmente RNA ribossômico, observado como dois picos: o subunidade 18S de RNA ribossômico à esquerda e o subunidade 28S à direita nesta análise no bioanalisador. No entanto, os RNAs exossomais diferem em seus perfis, pois contêm pouco ou nenhum RNA ribossômico e são enriquecidos em RNAs curtos, como RNA mensageiro e microRNA, uma vez dominados.O isolamento pode ser realizado em aproximadamente três horas, se feito corretamente. Ao utilizar este método, é importante executar todas as etapas, incluindo as não preenchidas, para evitar a contaminação de ics maiores. Após o desenvolvimento desta técnica, tornou-se muito mais fácil caracterizar exossomos, tanto bioquimicamente quanto biologicamente.Além disso, aprendemos muito mais sobre a comunicação mediada por exossomos entre células em diferentes sistemas. Também, a técnica tornou possível o desenvolvimento de exossomos como biomarcadores para diversas doenças. Muito obrigado pela sua atenção.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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