Name: A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: Aprenda a realizar ensaio de formação de tubos em Matrigel para avaliar atividade vasculogênica de células tumorais in vitro. Este método permite quantificar a capacidade de formação vascular e inferir comportamento in vivo em modelos de xenotransplante.

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Este trabalho foi financiado pelo NCI R01 CA120659 (RS).

1. A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais <ol><li> Preparação de células tumorais e células endoteliais microvasculares: células de tumor cerebral, como U87, células de melanoma B16F1, câncer de mama MDA-MB-435, e as células do cólon HCT116 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% FBS e penicilina / estreptomicina (todos da Invitrogen ). Células endoteliais microvasculares linhagem humana de células endoteliais (HMVECs) foram cultivados em meio EBM2 (Lonza) suplementado com 1 mg de hidrocortisona / ml e 1 ng / ml fator de crescimento epidérmico, 10% FBS e penicilina / estreptomicina. Células foram lavadas com PBS por três vezes e isolada com 0,05% de tripsina / EDTA (Invitrogen). Após a centrifugação com 2.000 rpm por 5 min, pellets de células foram lavadas novamente com PBS. Então, as células foram contadas peletizadas com um hemocitômetro. </li><li> Preparação Matrigel: Uma alíquota de fator de crescimento reduzida Matrigel (BD Bioscience) foi aquecido em temperatura ambiente. Antes completamente descongelado, foi transferido para gelo e seu líquido foi mantido no gelo por pelo menos 10 min. Em seguida, 50 ul de Matrigel foi banhado com placas de 96 poços em um nível horizontal que permite a Matrigel para distribuir uniformemente, e incubado por 30 min a 37 ° C. </li><li> Formação do tubo: Cells (1-2 x 10 4) foram re-suspensos com soro livre de DMEM para células tumorais ou EBM-2 para as células endoteliais, e colocado no topo da Matrigel. Se este ensaio foi utilizado para medir os efeitos de alguns agentes no desenvolvimento dos túbulos, esses agentes (estimuladores ou inibidores) foram adicionados ao meio isento de soro. Cada grupo continha condicional 4-6 poços. </li><li> Imagem e análise de dados: Após a incubação a 37 ° C durante a noite, cada poço foi analisado diretamente sob um microscópio. Se túbulos eram necessários para a fixação, 100 ul de solução salina 10% baseada em formol foi gentilmente adicionado e dez minutos depois, estava pronto para análise. Sob um microscópio com contraste de fase 10x, túbulos em cada campo foram fotografadas e uma média de túbulos 3-5 campos aleatórios em cada poço foi contado. </li></ol> 2. Resultados representativos: HMVECs foram utilizados como controle positivo, uma vez que estes túbulos foram desenvolvidos a partir clara corpos celulares alongadas que se unem para formar rede de polígono. Células B16F1, U87 e MDA-MB-435 desenvolvido túbulos vascular semelhantes aos formados por HMVECs, mas HCT116 células não (Figura 1). A formação do tubo celular dose-dependente foi testado em células U87. Como demonstrado na Figura 2, 10.000 células formadas túbulos descontinuado. Quando as células foram dobradas, uma sólida rede vascular foi comparável aos observados em HMVECs. Em contraste, as células menos de 5.000 não conseguiram formar um fenótipo vascular. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Formação do tubo induzida por HMVECs, U87, MDA-MB-435, e B16F1 células, mas não HCT116 células. Todas as células (2 x 10 4) foram carregados em Matrigel e incubados durante a noite. Túbulos foram fotografadas usando contraste de fase. HMVECs foram utilizados como controle positivo. Um representante de 3-5 campos foi mostrado. Bar: 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. U87 celular induzida por túbulos em um número de células-dependente maneira. Números diferentes de células U87, conforme indicado nos cantos foram usados ​​para a formação do tubo. HMVECs foram usados ​​para um controle positivo. Bar: 100 mm.

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<li>Folberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+plasticity+in+uveal+melanoma%3A+microenvironment+directed+dampening+of+the+invasive+and+metastatic+genotype+and+phenotype+accompanies+the+generation+of+vasculogenic+mimicry+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns.</a> American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+membrane+antigen+directed+selective+thrombotic+infarction+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors.</a> Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+significance+of+tumor+cell-lined+vasculature+in+ovarian+carcinoma%3A+implications+for+anti-vasculogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy.</a> Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+in+vasculogenic+mimicry+and+angiogenesis+of+inflammatory+breast+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft.</a> Cancer Research. 62, 560-566 (2002).</li>
<li>Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+tissue+factor+pathway+inhibitors+1+and+2+in+melanoma+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry.</a> Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).</li>
<li>Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+laminin+5+gamma2+chain%2C+matrix+metalloproteinase-2%2C+and+membrane+type-1-matrix%2Fmetalloproteinase+are+required+for+mimicry+of+embryonic+vasculogenesis+by+aggressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.</a> Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+and+pseudo-comedo+formation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer.</a> International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para que este ensaio para o sucesso, a qualidade do Matrigel deve ser testada primeiro. Uma pequena amostra pode ser obtido a partir de BD Bioscience de pré-executar o teste usando HMVECs. Produtos de lote diferente pode exibir qualidades diferentes em que alguns lotes não fornecem uma condição ideal para a formação do tubo. Em segundo lugar, as bolhas devem ser evitados quando uma alíquota de Matrigel é carregado em placas de 96 poços, porque as bolhas podem interromper a formação de túbulos. Se pequenas bolhas são enc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Do fator de crescimento reduzida Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 47743-720 </td></tr><tr><td> EBM2 kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> Nikon microscópio TS100 ECLIPSE </td><td> Nikon </td><td></td></tr></tbody></table>

a matrigel-based assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Ao longo dos últimas décadas, um ensaio de formação do tubo utilizando fator de crescimento reduzida Matrigel foi tipicamente utilizados para demonstrar a atividade angiogênica das células endoteliais vasculares in vitro 1-5. No entanto, a evidência crescente recentemente demonstrou que este ensaio não se limita a testar o comportamento vascular para as células endoteliais. Em vez disso, ele também tem sido utilizado para testar a capacidade de um número de células tumorais para desenvolver um fenótipo vascular 6-8. Esta capacidade foi coerente com seu comportamento vasculogênica identificados em animais xenotransplanted, um processo conhecido como mimetismo vasculogênica (VM) 9. Há uma infinidade de provas que demonstrem que VM mediada por células tumorais desempenha um papel vital no desenvolvimento do tumor, independente de angiogênese da célula endotelial 6, 10-13. Por exemplo, as células tumorais foram encontradas para participar na formação do sangue perfundido canal, vascular em amostras de tecido de melanoma e glioblastoma pacientes 8, 10, 11. Aqui, descrevemos neste ensaio rede tubular como uma ferramenta útil na avaliação da atividade vasculogênica de células tumorais. Descobrimos que algumas linhagens de células tumorais, como o melanoma B16F1 células, as células U87 glioblastoma, e câncer de mama MDA-MB-435 células são capazes de formar túbulos vascular, mas algumas não, como câncer de cólon HCT116 células. Além disso, este fenótipo vascular é dependente número de células banhado no Matrigel. Portanto, este ensaio pode servir como poderoso utilitário para a tela o potencial vascular de uma variedade de tipos de células, incluindo células vasculares, as células tumorais, bem como outras células.

A formação do tubo de ensaio é usado para avaliar a atividade vascular das células tumorais.

A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

Nas últimas décadas, um ensaio de formação de tubos utilizando Matrigel com redução de fatores de crescimento tem sido tipicamente empregado para demonstrar a angiogênica...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a formação de tubos por diversos tipos de células tumorais in vitro como forma de avaliar a atividade vascular in vivo. Isso é alcançado adicionando-se células tumorais sobre matrigel para induzir a formação de tubos. Como segundo passo.As células sobre matri gel são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius, o que permite que a formação de tubos ocorra. Em seguida, os tubos produzidos por cada tipo celular são imageados. Para quantificar o número médio de tubos formados por cada tipo celular, são obtidos resultados que mostram a capacidade potencial dessas células de formar vasculatura in vivo com base em modelos de tumor xenotransplantado.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de pesquisa do câncer, como como medir a atividade vascular in vitro. Para preparar as células tumorais, comece cultivando melanoma UAD sete, B16-F1, MDA-MB-435 ou células de cólon HCT 116. Em DMEM suplementado com 10% FPS e penicilina, cultive. Células endoteliais microvasculares humanas ou HECs em meio EBM dois suplementado com um micrograma por mililitro de hidrocortisona, um nanograma por mililitro de fator de crescimento epidérmico, 10% FBS e penicilina.Lave as células com PBS contendo estreptomicina, depois desprenda com tripsina 0,05% EDTA, centrifugue as células a 2000 RRP M durante cinco minutos. Em seguida, lave-as novamente com PBS. Conte as células utilizando um hemocitômetro para preparar o gel de matrigel morno.Uma alíquota de um mililitro de Matrigel com fator de crescimento reduzido foi aquecida à temperatura ambiente. Em seguida, coloque-a imediatamente sobre gelo por 10 minutos. Pipete 50 microlitros para os poços de uma placa de 96 poços.E incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos, ressuspender uma a duas vezes 10 à quinta células tumorais ou endoteliais em DMEM ou eBM2, respectivamente, e carregá-las na parte superior do matrigel. Se estiver estudando os efeitos de reagentes no desenvolvimento de túbulos, adicione o reagente ao meio livre de soro e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Para análise de imagem, adicione 10 microlitros de uma solução a 10% de formal em salina por 10 minutos.Em seguida, realize a imagem com um microscópio de contraste de fase usando uma objetiva de 10 x. Conte o número de túbulos em três a cinco campos aleatórios de cada um. Em seguida, calcule a média aqui.Os HMCs foram utilizados como controle positivo, pois esses túbulos se desenvolveram a partir de corpos celulares alongados e claros que se conectaram para formar uma rede poligonal. As células B16F1, U87 e MDA-MB-435 desenvolveram túbulos vasculares semelhantes aos formados pelos HECs. Já as células HCT116 não os desenvolveram.Testou-se a formação de tubos dependente da dose celular em células U87. Como demonstrado nesta figura, 10.000 células formaram tubos descontínuos quando as células foram duplicadas. Uma rede vascular sólida foi comparável à observada em H ecs.Em contraste, o in&iacute;cio com menos de 5.000 c&eacute;lulas n&atilde;o conseguiu formar um fen&oacute;tipo vascular. Ap&oacute;s assistir a este v&iacute;deo, voc&ecirc; dever&aacute; ter uma boa compreens&atilde;o de como configurar com &ecirc;xito um experimento de ensaio de tubo em Matrigel para medir a forma&ccedil;&atilde;o de tubos por c&eacute;lulas cancer&iacute;genas in vitro.

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Biologia

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Aprenda a realizar ensaio de formação de tubos em Matrigel para avaliar atividade vasculogênica de células tumorais in vitro. Este método permite quantificar a capacidade de formação vascular e inferir comportamento in vivo em modelos de xenotransplante.

A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

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