Name: Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a imaginar células T fluorescentes em fatias de linfonodos murinos usando microscopia de campo amplo e confocal. Este método permite analisar em tempo real a migração e o comportamento motil das células T no tecido linfático.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Alain Trautmann que nos encorajou a realizar cortes de linfonodos. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do Nationale Ligue Contre le Cancer, a Fondation pour la Recherche Médicale en France ea Associação pour la recherche sur le Cancer.

1. Preparação de fatias de linfonodos <ol><li> Prepare a 4% de baixo ponto de fusão de solução de agarose para a incorporação. Diluir agarose em PBS e microondas esta solução. Quando a agarose é completamente dissolvido, manter a solução a 37 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Prepare um 6 bem-placa de cultura de tecidos. Adicionar 1,1 ml meio de cultura RPMI completo por poço, e inserir um filtro organotípicas em cada poço. Coloque a placa de seis poços a 4 ° C até que esteja pronto para transferir fatias. </li><li> Coloque arruelas de aço inoxidável, com diâmetros interno de 4 mm, em um prato de plástico cheio de meio RPMI completo. Arruelas serão mais usados ​​para concentrar as células na fatia cortada vibratome. </li><li> Sacrificar o rato, em conformidade com as normas de bem-estar animal local. Remova cuidadosamente os gânglios linfáticos periférico do tecido circundante e coloque-os em um prato de plástico contendo gelada PBS. Cuidados devem ser tomados para não danificar a estrutura dos linfonodos, como estes órgãos são muito macios. </li><li> Despeje a 4%-agarose gel em um prato de plástico de 35 mm e delicadamente os nós de transferência para o gel. Deixe o gel agarose em gelo por 5 min para endurecer. </li><li> Remover o bloco do prato e cortar o agar, a fim de deixar 3-5 mm de gel em torno de cada nó de linfa. </li><li> Anexar os nós embutido no disco exemplar do vibratome com non-toxic cola de tecido. Instalar o disco de amostra na bandeja cheia de gelado PBS. </li><li> Seção agar-embedded tecido em 320 mM espessura com a velocidade vibratome conjunto em uma série lenta (0,3 mm / s) ea freqüência de vibração em um conjunto de gama média (1,5 mm). </li><li> Transferir cuidadosamente fatias linfonodo como eles estão sendo cortados para a cultura insere organotípicas usando uma pinça fina. Coloque 3 fatias em cada inserção. Tenha muito cuidado como fatias pode ser facilmente danificada. Um linfonodo periférico típico renderá 5 seções quando cortado a 320 mM. Descartar as fatias e sobrenome, como eles só contêm tecido superficial. </li><li> Coloque anilhas de aço inox em cada fatia individual. Certifique-se de arruelas são bem posicionado na agarose em torno do tecido. </li><li> Incubar a placa de cultura a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2 umidificado até que esteja pronto para as células T placa. </li></ol> 2. Isolamento de células T dos linfonodos do mouse <ol><li> Isolar as células T de acordo com o artigo JOVE anteriormente publicados 3. </li><li> Utilização de células T imediatamente e prosseguir para a próxima seção. Caso contrário, os linfócitos podem ser cultivadas durante a noite em completa meio RPMI suplementado com 10 ng / ml de IL-7. </li></ol> 3. Rotulagem dos isolaram células T <ol><li> Lavar as células em HBSS. Ressuspender-los no mesmo tampão de 10 x 10 6 por ml. </li><li> Adicionar o mesmo volume de HBSS contendo 1 mM celular Rastreador verde CMFDA dando uma concentração final de 0,5 mM. </li><li> Incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 5 min. Lave as células duas vezes com RPMI médio completo. </li><li> Ressuspender as células em uma concentração final de 10 x 10 6 por ml em meio RPMI completo. Estas células marcadas serão semeados em fatias. </li></ol> Outros corantes fluorescentes que CMFDA pode ser usado também, mas tenha em mente que estas moléculas são potencialmente tóxicos acima de determinadas concentrações. 4. Chapeamento rotulados células T em fatias linfonodo <ol><li> Remova o meio de excesso contido na parte interna da máquina de lavar com uma pipeta. Não permita que o tecido se torne seca; trabalhar rapidamente durante esta etapa. </li><li> Suavemente dispensar 10-20 mL células T rotulados que corresponde a 1-2 x 10 5 células na parte interna da máquina de lavar. É preciso ter cuidado para não tocar o tecido com a ponta da pipeta. Certifique-se que a gota de suspensão de células permanece no local. </li><li> Coloque as fatias com células em estufa a 37 ° C e 5% CO 2 por pelo menos 30 min para permitir que os linfócitos para migrar para o tecido. </li></ol> 5. Células T de imagens dentro de fatias de linfonodo Neste vídeo-artigo, que as células T imagem fluorescentes em fatias de linfonodo com um microscópio de campo amplo invertido e um microscópio confocal vertical. <ol><li> Definir a temperatura a 37 ° C. Nossos microscópios estão equipados com câmaras de temperatura controlada. </li><li> Instalar um sistema de perfusão permitindo a perfusão contínua da fatia de linfonodo com oxigenada (5% CO 2, 95% O 2) fenol meio RPMI red-free. No nosso sistema, media perfundidos entra na câmara de imagem de um lado pela gravidade. O meio é aspirado com uma bomba ligada a um frasco de coleta de resíduos. Definir a taxa de fluxo de mídia para 1 ml / min. </li><li> Com uma pinça fina, delicadamente retire a fatia do prato 6-bem e mergulhe a preparação em meio RPMI oxigenado aquecido por alguns segundos para se livrar de células fluorescentes não infiltradas no tecido. </li></ol> Imaging células T com um microscópio de campo amplo invertida <ol start="4"><li> Coloque a fatia de cabeça para baixo em uma câmara de imagem feito por encomenda, que consiste em fios de nylon colados na parte interna de um prato fundo de vidro. Nesta câmara, os fios de nylon elevar a fatia do vidro e permitem que a solução oxigenada para difundir no tecido. Isto é necessário como T migração celular em linfonodos é fortemente dependente de oxigênio. Segura a fatia acrescentando por cima em uma arruela de aço inoxidável. Nessas condições, a fatia está alguns mícrons acima do fundo do prato, o que facilita a renovação da solução de perfusão. </li><li> Para capturar um grande campo de visão (800 x 800 mM, aproximadamente um terço da superfície do nó fatia), recolher imagens usando uma lente objetiva de 10x e seco. Nós descobrimos que a Nikon 10x S fluor 0,5 NA foi mais adequado para nossas análises. </li></ol> Uma experiência de imagens típicas de lapso de tempo captura 5 aviões óptico abrangendo uma profundidade total de 50 mm na dimensão axial (z). Células T fluorescentes são normalmente fotografada em intervalos que variam 10 a 30 segundos durante 10 a 20 min. Células T de imagem com um microscópio confocal vertical O microscópio confocal utilizado neste protocolo é um SP5 Leica equipada com uma objetiva de imersão de água 20x (Olympus, 20x/0.95 NA). <ol start="6"><li> Segura a fatia para o palco de imagens do microscópio. Nota: Nós geralmente lugar uma máquina de lavar na preparação para imobilizá-lo. </li><li> Definir uma sessão de imagem através da recolha de uma série de imagens ao longo do eixo z. Para as células T de imagem em uma estrutura de tecido intacto, a posição de início é geralmente definida em 5 a 10 mM abaixo da célula T primeiro rotulados. </li></ol> 6. Resultados representativos Seguindo este vídeo protocolo você deve esperar para visualizar um grande número de células T fluorescentes acumuladas na zona T do nó, um fenômeno que normalmente ocorre nesse ambiente específico in vivo (Figura 1). Em particular, as células T devem ser excluídas das zonas de células B, que são geralmente logo abaixo da cápsula. A experiência bem sucedida também irá resultar em células T recrutados para o tecido (Figura 2), exibindo um comportamento altamente móveis (Figura 3) consistentes com os resultados publicados obtidos nos gânglios linfáticos intactos 4. Em média, a velocidade média de células T individuais dentro fatias devem ser cerca de 10 mM / min (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. As células T se acumulam em uma fatia de linfonodos. Células fluorescente marcado T (CMFDA, verde) foram adicionados a um nó de linfa fatia min 30 antes de aquisição de imagem (imagem acima). A imagem é a projeção máxima de 5 imagens que mede 50 mm na direção z. A imagem de campo claro é mostrado na parte inferior. Imagens foram capturadas com um microscópio de campo amplo. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. As células T são recrutados para uma fatia de linfonodos. Células fluorescente marcado T (CMFDA, verde) foram adicionados a um nó de linfa fatia min 30 antes de aquisição de imagem usando um microscópio confocal. Imagens foram capturadas na superfície de corte (figura superior) e 40 mM abaixo (foto inferior). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. As células T são altamente móveis dentro de uma fatia de linfonodos. Fluorescente marcado células T foram fotografadas durante 12 min usando um microscópio de campo amplo. Trajetórias de células T individuais são exibidos como codificados por cores para representar faixas deslocamentos crescentes de azul (baixo células móveis) ao vermelho (alto células móveis). Faixas foram calculados utilizando software Imaris. A linha branca segue a borda do nó, enquanto a elipse tracejada delimita a zona de células B putativa. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Dentro de uma fatia de linfonodos, a velocidade de células T é cerca de 10 mM / min. As velocidades foram calculadas utilizando software Imaris de faixas representadas na Figura 3.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos uma técnica simples rápida e robusta para a geração de fatias de linfonodo, que são usados ​​para investigar o comportamento de células T introduziu. Nos últimos anos, este método tem sido aplicado com sucesso usando timo e linfonodo fatias para identificar os fatores extracelulares controlar o posicionamento de células T e mobilidade 1,5. Também tem sido usado para medir Ca 2 + respostas em timócitos durante a seleção positiva e em células T após o reconhecimento antígeno 2,6. O ensaio fatia overlay apresenta vantagens e limitações que merecem ser discutidas. De notar que este sistema permite o acesso ao tecido, útil se a pessoa precisa para manipular fatias farmacologicamente, a fim de interferir com o controle molecular de migração celular. Subseqüente ao de imagem, as fatias podem ser processados ​​por imuno-histoquímica para coletar informações sobre as estruturas que foram retratadas. Além disso, a observação pode ser feita com um microscópio de fluorescência tradicional campo amplo. Embora a resolução não é tão bom quanto com uma ou um microscópio confocal de dois fótons e que fototoxicidade é, em princípio, mais grave, com um fóton do que com a microscopia de dois fótons, ele tem as vantagens de simplicidade, um menor custo e maior escolha de comprimentos de onda de excitação. A imagem de células T em um linfonodo intactas requer a injeção intravenosa de linfócitos marcados que, posteriormente, o lar de órgãos linfóides. Como já mostrado anteriormente 1, o ensaio fatia é perfeitamente compatível com a experiência de transferência adotiva. No entanto, o período de tempo necessário para as células T a casa em gânglios linfáticos pode complicar o uso de corantes fluorescentes que têm uma tendência a vazar para fora das células ao longo do tempo. Este é o caso do Ca 2 + corante fura-2. Com o recrutamento rápido (&lt;30 min) de células T no tecido, o ensaio fatia fornece uma oportunidade de usar tais corantes. Finalmente, este método tem a grande vantagem de analisar as funções das células T em vários tecidos humanos mantidos vivos. Este sistema experimental apresenta também limitações que precisam ser mantidos em mente. Danos associados com o corte pode afetar o funcionamento das células T, especialmente na região superficial do tecido perto da superfície de corte. A fim de avaliar a morte celular dentro da fatia, temos utilizado a corante fluorescente verde SYTOX que penetra as células com membrana plasmática comprometida. Nossos experimentos revelam que cerca de 20% do total de células nodais, principalmente localizados na região superficial do tecido, foram fluorescente etiquetado com o corante nuclear. Outra preocupação com o potencial do ensaio é a capacidade de reter as fatias importantes fatores solúveis incluindo quimiocinas. Embora, não temos nenhuma indicação de que nossos dados foram afetados por problemas tais como as células T exibir uma boa mobilidade dentro da fatia, gostaríamos de salientar a importância das células T de imagens em regiões saudáveis ​​localizado em várias dezenas de microns da superfície de corte. Considerando que, isso poderia ser feito com microscópios tradicionais (campo amplo ou confocal), como neste protocolo, é provável que a linfa preparação fatia nó combinado com dois fótons de imagem vai aumentar a resolução espacial de profundidade e reduzir a fototoxicidade.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Pinça fina </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 milímetros insere Cultura </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> RPMI completo e médio é feita pela adição de 10% inativado pelo calor de soro fetal bovino e penicilina / estreptomicina </td></tr><tr><td> Solução de Hanks salina balanceada (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Baixa temperatura de gelificação Agarose, tipo VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butil cola de cianoacrilato, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Arruelas de aço inoxidável, 4 mm de diâmetro interno </td><td> DIY loja </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rastreador de celular verde CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo de imagens de células t em fatias node murino linfáticos com widefield e microscópios confocal

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ingênua células T tráfego continuamente para órgãos linfóides secundários, incluindo linfonodos periféricos, para detectar antígenos expressos rara. A migração de células T em linfonodos é um processo complexo que envolve fatores tanto celulares e químicas, incluindo quimiocinas. Recentemente, o uso de dois fótons de microscopia permitiu rastrear as células T nos linfonodos intactos e para obter alguma informação quantitativa sobre o seu comportamento e suas interações com outras células. Embora existam vantagens óbvias para uma no sistema vivo, esta abordagem requer uma instrumentação complexa e cara e oferece acesso limitado ao tecido. Para analisar o comportamento de células T dentro dos gânglios linfáticos murino, desenvolvemos um ensaio 1 fatia, originalmente criado pelos neurobiólogos e transposta recentemente para timo murino 2. Nesta técnica, fluorescente etiquetado células T são banhados em cima de uma fatia aguda preparado linfonodo. Neste vídeo-artigo, a localização e migração de células T no tecido são analisados ​​em tempo real com um campo amplo e um microscópio confocal. A técnica que complementa in vivo de dois fótons de microscopia oferece uma abordagem eficaz para células T imagem em seu ambiente natural e para elucidar os mecanismos subjacentes T migração celular.

Este protocolo descreve um método para células T imagem fluorescentes introduzido em fatias de linfonodos. A técnica permite análises em tempo real de migração de células T com o tradicional campo amplo de fluorescência ou microscópios confocal.

Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal

As células T naíve migram continuamente para órgãos linfoides secundários, incluindo linfonodos periféricos, para detectar antígenos expressos raros. A migração...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de linfócitos T fluorescentes em cortes de linfonodo por microscopia de campo amplo e microscopia confocal. Isso é realizado primeiramente removendo um linfonodo de camundongo e incorporando-o em agarose de baixo ponto de fusão. O linfonodo é então cortado em seções com espessura de 320 mícrons utilizando um vibrátomo.Em seguida, linfócitos T marcados com corante fluorescente são semeados sobre uma fatia de linfonodo. Por fim, os linfócitos T que infiltraram a fatia são visualizados por microscopia de campo amplo e microscopia confocal. Em última instância, podem ser obtidas imagens fixas e videográficas que mostram como os linfócitos T são recrutados para o linfonodo e que tipo de comportamento móvel eles exibem dentro do tecido linfático. Ok.A principal vantagem dessas técnicas de um metal existente, como a fotomicroscopia e órgãos intactos, é que aqui as células T podem ser visualizadas em um sistema tridimensional com um microscópio convencional de campo claro. Além disso, os preparos leves permitem o acesso ao tecido. Comece preparando uma solução a 4% de ponto de fusão baixo. Prepare uma solução diluindo o agarose em PBS e aquecendo a mistura resultante em forno de micro-ondas até que o agarose tenha se dissolvido completamente.Mantenha a solução a 37 graus Celsius até o uso. Em seguida, encha um recipiente plástico com RPMI. Complete os meios de cultura e coloque arruelas de aço inoxidável com diâmetros internos de quatro milímetros no recipiente.Encha outro recipiente com PBS gelado e adicione aproximadamente 1,1 mililitro de RPMI. Complete o meio de cultura por poço em uma placa de cultura de tecidos de seis poços. Insira um filtro organotípico em cada poço da placa de seis poços e coloque a placa a quatro graus Celsius.Remova cuidadosamente os linfonodos periféricos dos tecidos ao seu redor em um camundongo eutanasiado. Disseque os linfonodos com cuidado, pois são muito moles. É muito importante remover toda a gordura do tecido, porque é altamente tóxica para as células.Coloque os linfonodos no recipiente plástico contendo PBS com gelo. Agora, despeje o gel de aro 4% em um recipiente plástico de 35 milímetros e transfira delicadamente os linfonodos para o gel. Em seguida, coloque o aro sobre gelo por cinco minutos para endurecer; após o endurecimento do aro, retire o bloco do recipiente e corte o ágar, deixando aproximadamente três a cinco milímetros de gel ao redor de cada linfonodo.Em seguida, utilize cola não tóxica para fixar os nós embutidos no disco de espécime de um viome. Instale o disco de espécime na bandeja removível do viome e preencha a bandeja com PBS gelado. Ajuste a velocidade do viome em uma faixa lenta e a frequência de vibração em uma faixa média, e seccione o tecido embutido em agar com espessura de 320 mícrons.Descarte a primeira fatia, pois contém apenas tecido superficial, e então use pin&ccedil;as finas para transferir cuidadosamente as fatias do n&oacute;dulo linf&aacute;tico conforme s&atilde;o cortadas para os insertos de cultura organot&iacute;pica. Coloque arruelas de a&ccedil;o inoxid&aacute;vel sobre cada fatia individual, certificando-se de que as arruelas estejam na &aacute;rea perif&eacute;rica, ao redor e n&atilde;o cobrindo o tecido do n&oacute;dulo linf&aacute;tico. Em seguida, incube a placa de cultura com as fatias de n&oacute;dulo linf&aacute;tico a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com 5% de di&oacute;xido de carbono.Enquanto prepara os linfócitos T para esta etapa, utilize culturas de linfócitos T suplementadas com IL-7 por período noturno que foram isoladas por seleção com microesferas positivas para CD4 utilizando purificação MIL-10 Max, conforme demonstrado no artigo previamente publicado no JoVE por Matthew e Callaghan. Lave os linfócitos T em HBSS por cinco minutos a 300 × g a 20 °C. Re-suspenda-os em HBSS fresco a 10 × 10⁶ células por mililitro.Em seguida, adicione um micromolar de rastreador celular verde C-M-F-D-A a um tubo de HBSS e combine esta solução com a solução celular para uma concentração final do corante de 0,5 micromolar. Incube a suspensão celular por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após lavar as células duas vezes com meio RPMI completo por cinco minutos a 300 vezes G e 20 graus Celsius, ressuspenda os linfócitos T marcados numa concentração final de 10 vezes 10 à sexta células por mililitro.Em meio de cultura completo RPMI fresco, retire as fatias de linfonodo do incubador. Remova o excesso de meio contido no centro do recipiente com uma pipeta, sem tocar o tecido. Com a ponta da pipeta, adicione suavemente de 10 a 20 microlitros de linfócitos T marcados no centro do recipiente.Certifique-se de que a gota de suspensão celular permaneça no lugar. Incube as fatias e os linfócitos T por pelo menos 30 minutos para permitir que os linfócitos migrem para o tecido. Para iniciar a aquisição de imagens, ajuste a câmara de controle de temperatura do microscópio a 37 graus Celsius.Encha um sistema de fusão para permitir a perfusão contínua da fatia de linfonodo com meio RPMI livre de vermelho de fenol oxigenado; encha e aqueça também um pequeno recipiente plástico com RPMI oxigenado neste momento. No sistema mostrado aqui, o meio perfundido entra na câmara de imagem por um dos lados, por gravidade. O meio é aspirado por uma bomba conectada a um coletor de resíduos.Com pin&ccedil;as finas, retire do incubador as fatias de n&oacute;dulo linf&aacute;tico infiltradas por linf&oacute;citos T. Remova delicadamente uma fatia de n&oacute;dulo linf&aacute;tico da placa de seis po&ccedil;os. Mergulhe a fatia no meio RPMI aquecido e oxigenado por alguns segundos para lavar as c&eacute;lulas fluorescentes que n&atilde;o infiltraram o tecido.Em seguida, coloque a fatia recém-lavada de cabeça para baixo na câmara de imagem. Os fios de náilon elevam a fatia acima do vidro e permitem que a solução oxigenada difunda-se no tecido. Isso é necessário porque a migração de linfócitos T em linfonodos depende fortemente do oxigênio.Em seguida, fixe o corte colocando uma arruela de aço inoxidável sobre ele para capturar um amplo campo de visão. Colete imagens utilizando uma objetiva seca de 10 vezes. Transfira o corte de linfonodo recém-lavado, com a face voltada para cima, para um recipiente plástico.Coloque uma arruela sobre o preparo para imobilizá-lo. As fatias estão agora prontas para serem imageadas. Instale o preparo na platina do microscópio confocal ereto e foque com a objetiva de 20 vezes.Em seguida, inicie uma sessão de imagem e comece a aquisição. C-M-F-D-A. Células T marcadas em verde foram adicionadas a uma fatia de linfonodo 30 minutos antes da aquisição da imagem, conforme mostrado aqui. A imagem é a projeção máxima de cinco imagens abrangendo 50 micrômetros na direção Z, capturadas com um microscópio de campo claro aqui.A mesma figura pode ser vista como uma imagem de campo claro neste vídeo. Linfócitos T fluorescentes verdes que infiltraram uma fatia de linfonodo são imagens obtidas com um microscópio de campo claro durante nove minutos. A animação representa uma projeção Z de 50 mícrons.Observe a migração ativa de linfócitos T dentro da fatia. As trajetórias de linfócitos T individuais do mesmo campo microscópico são exibidas aqui como trilhas codificadas por cores, representando seu deslocamento crescente, desde células pouco móveis em azul até células altamente móveis em vermelho. As trilhas foram calculadas utilizando um Mars.A linha branca indica a borda do n&oacute;dulo, enquanto as elipses tracejadas delimitam as zonas putativas de c&eacute;lulas B. Aqui, c&eacute;lulas T adicionadas a uma fatia de n&oacute;dulo linf&aacute;tico foram imagiadas por 10 minutos com um microsc&oacute;pio confocal. A anima&ccedil;&atilde;o representa uma proje&ccedil;&atilde;o Z de 50 m&iacute;con.Sim, essa técnica pode ser adaptada a outros tipos de tecido. E o que é interessante é que o corte em fatias é a única maneira de explorar os mecanismos subjacentes à migração e localização de linfócitos T em tumores humanos. Por exemplo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Dois fótons de imagem revelou motilidade linfócitos e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e durante uma resposta imune 1. Aqui, demonstramos transferência adotiva de células T, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado.

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo...

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Este vídeo descreve a imagem de células T CD8 infiltrantes de tumor residentes marcadas com anticorpos acoplados fluorescentemente em fatias de tumor de pulmão humano. Essa técnica permite análises em tempo real da migração de células T CD8 por meio de microscopia confocal.

Análise em tempo real da migração de células T residentes em diferentes regiões tumorais usando microscopia confocal

De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Aprenda a imaginar células T fluorescentes em fatias de linfonodos murinos usando microscopia de campo amplo e confocal. Este método permite analisar em tempo real a migração e o comportamento motil das células T no tecido linfático.

Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal

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