Name: Windowing Ovos de galinha para Estudos do Desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Aprenda a preparar ovos de galinha para experimentos neurobiológicos usando técnicas de windowing. Este método otimiza a sobrevivência embrionária e facilita mapeamento de destino celular em estudos de desenvolvimento.

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1. Retire os ovos da incubadora <ol><li> Manter a 37 ° C com umidade relativa acima de 60% definido. </li><li> Retire os ovos, vire ovos 90 ° para que a grande base está horizontal. </li></ol> 2. Ovos cotonete para esterilizar <ol><li> Saturar uma pilha de gaze não esterilizada com etanol 70%. </li><li> Use 2-3 peças de algodão até 5 ovos. Descartar quando a gaze está suja. </li></ol> 3. Site remoção preparando albumen <ol><li> Cortar e colocar um 1 &quot;x 1&quot; pedaço de fita plástica 3M acaba de sair da base para proteger a área onde a albumina será retirado. </li></ol> 4. Remoção de albumina <ol><li> Use a ponta de uma tesoura para fazer um pequeno buraco no meio da fita. </li><li> Usando uma seringa de 10 cc com um calibre 18, de 1 polegada agulha, lentamente broca a agulha através do orifício feito pela tesoura. </li><li> Disco a agulha para baixo em um ângulo de 45 ° C para a parte inferior do ovo. </li><li> Inclinação da agulha em direção ao centro e elaborar 3-4 mL de albumina. </li></ol> 5. Windowing <ol><li> Corte um 3 &quot;x 3&quot; pedaço de fita plástica e esticá-la para caber no topo do ovo. Estender os cantos da praça em torno das extremidades arredondadas da superfície horizontal dos ovos, tomando cuidado para não puxar demasiado duro. Puxe a fita para que ele seja apertado contra a superfície dos ovos sem dobras. </li><li> Usando um par de sharp-reta quatro tesouras &quot;dissecação, torcer um buraco no centro inferior da área onde a fita foi colocada. Lentamente orientar a menor lâmina da tesoura no ovo certificando-se de manter as pontas para cima contra o interior do o shell. direto a lâmina para a base e, lentamente, começam a cortar a casca. Prossiga de forma anti-horário, parando pouco antes de chegar ao centro da parte superior. Remover a tesoura e repita indo na direção oposta até que apenas uma pequena porção do ovo permanece ligado. Certifique-se o óvulo é fertilizado. Feche a janela. </li></ol> 6. Encerramento, reabertura e selando o ovo. <ol><li> Cortar cerca de um 2-3 &quot;de comprimento por 1 / 2&quot; fita plástica de largura e fechou a janela para que ele se encaixa de volta para o buraco que foi cortada. Tomar outro 1 x 1 &quot;pedaço de fita e selar o buraco do qual o óvulo foi drenado. Use uma pinça para reabrir o ovo para fazer quaisquer manipulações. Quando você estiver pronto para retornar os ovos para a incubadora, corte um pedaço da fita que é grande o suficiente para selar a janela e cobrir toda a superfície horizontal do ovo. </li></ol>

<ol><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).</li>
<li>Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).</li>
<li>Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).</li>
<li>Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).</li>
</ol>

Este método permite a sobrevivência a longo vezes seguintes manipulações experimentais. Por exemplo, tintura de rotulagem estudos permitiram a sobrevivência de E10 ou mais tarde, em um estudo de mapeamento de destino (1). Além disso, ela tem sido usada para estudos de eletroporação in ovo que fornecem alteração dos níveis de expressão de genes e desenvolvimento necessário para avançar para estágios mais avançados de desenvolvimento (2-6). Esta técnica de janelas pode ser usado em combinação com qualquer procedimento que requer a sobrevivênc...

<table><tbody><tr><td>Incubadora rotativa</td><td> </td><td>Profi</td><td></td><td>Manter a 37&amp;deg; C com umidade relativa acima de 60%</td></tr><tr><td>EtOH 70%</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>gaze</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Fita plástica 3M</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Seringa de 10 cc</td><td> </td><td></td><td></td><td>1/ovo</td></tr><tr><td>Agulhas 18G</td><td> </td><td></td><td></td><td>Agulha de 1&amp;#189; polegada, 1 por seringa</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td> </td><td></td><td></td><td>Lâminas retas afiadas de 4&quot;</td></tr><tr><td>Ovos fertilizados</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

windowing ovos de galinha para estudos do desenvolvimento

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

O estudo do desenvolvimento foi muito facilitada pelo uso do embrião de galinha como modelo experimental. A facilidade de acesso do embrião tem permitido experimentos para mapear destinos célula usando várias abordagens, incluindo pintinho de codorna quimeras e rotulagem corante focal. Além disso, permite a perturbações molecular de vários tipos, incluindo a colocação de proteína revestido contas ea introdução de DNA plasmídeo usando em eletroporação in ovo. Esses experimentos produziram dados importantes sobre o desenvolvimento dos sistemas nervoso central e periférico. Para muitos desses estudos, é necessário para abrir a casca de ovo e religar-lo sem perturbar o crescimento do embrião. O embrião pode ser examinada em sucessivos estágios de desenvolvimento de re-abertura da casca de ovo. Apesar de existirem vários métodos excelentes para a abertura de ovos de galinha, neste artigo vamos demonstrar um método que foi otimizado para o tempo de sobrevivência longa. Neste método, o óvulo fica do seu lado e uma pequena janela é cortado no shell. Após o procedimento experimental, a casca é usada para cobrir o ovo para a duração do seu desenvolvimento. Fita plástica que recobre a casca do ovo protege o embrião e ajuda a manter a hidratação durante o restante do período de incubação. Este método tem sido utilizado início em dois dias de incubação e permitiu a sobrevivência através madura idades embrionárias.

A facilidade de acesso do embrião tem permitido experimentos para mapear destinos célula usando várias abordagens, incluindo pintinho de codorna quimeras e rotulagem corante focal. Neste artigo vamos demonstrar um método de preparação de ovo que foi otimizado para os tempos de sobrevivência a longo.

Windowing Ovos de galinha para Estudos do Desenvolvimento

O estudo do desenvolvimento foi amplamente auxiliado pelo uso do embrião de galinha como modelo experimental. A facilidade de acessibilidade do embrião tem...

Bem-vindo ao Laboratório Kramer. Sou Matt Korn, do departamento de Neurobiologia e Comportamento da Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vou mostrar como preparar ovos de galinha para diversas manipulações, incluindo a colocação de microesferas, a injeção de corantes ou a exploração dentro do ovo.Então, sem mais delongas, vamos começar. Ok, então vamos seguir em frente e limpar o ovo. O motivo é que há muitas coisas que podem ser depositadas nele no incubador.Vamos selar isso com fita. Não queremos que pequenos fragmentos entrem na área onde a janela será aberta para o ovo, aumentando a chance de o embrião morrer até o momento em que desejarmos removê-lo. Então, se você observou no incubador, os ovos estão posicionados com o lado maior voltado para cima.O que vamos fazer é pegar o ovo e girá-lo para o lado. Isso vai ter dois efeitos. Primeiro, nossa janela ficará bem aqui; em segundo lugar, o embrião precisa flutuar para a parte superior para que possamos realizar qualquer tipo de manipulação.Então, vou colocar alguns aqui fora da prateleira que estava na incubadora, colocando-os em um suporte de ovos de papelão. Na verdade, esta é a peça que vem na caixa quando os ovos são entregues. Então, para hoje, vamos usá-la apenas para segurar os ovos.Agora, o arranjo fica a seu critério. Eu gosto de fazê-lo dessa maneira porque posso acessar todos os ovos a qualquer momento e nenhum deles está em contato uns com os outros. Caso eu encontre um ovo solto, com rachadura, e o deixe cair, todos terão um pouco de espaço entre si.Então, vou pegar minha gaze aqui e tirar uma boa pilha assim, dividindo-a ao meio. Vou pegar álcool 70% aqui e apenas preenchê-la até sentir que a parte inferior está ficando úmida. Isso porque vou usar toda a pilha para limpar todos os ovos.Então, vou tirar um pouco da parte superior, adiante e realmente trabalhar apenas o topo, mas efetivamente cobrindo quase toda a volta do ovo aqui. Após isso, o álcool seca rapidamente e então podemos seguir adiante e colocar a fita. A fita adere bem e, quando termino um conjunto, geralmente o primeiro já está seco e podemos prosseguir para a próxima etapa na preparação do ovo.Então novamente, coloque isso de volta no lixo e estamos prontos para passar para a próxima etapa. Ok, agora que todos os nossos ovos foram limpos com álcool, podemos prosseguir e fazer um orifício de drenagem no lado maior do ovo, na base do ovo. Isso nos permitirá entrar e extrair um pouco de albúmen, pois, se não extrairmos o albúmen, o embrião não ficará posicionado corretamente.Não podemos fazer nenhuma manipulação. Então, isso envolve apenas eu pegar uma lâmina e esta fita plástica. É um pouco elástica, o que é ótimo.Não só nos permite expandir sobre um orifício que seja um pouco maior do que gostaríamos, mas quando realmente cobrirmos todo o ovo, precisaremos esticar isso. Assim, a área onde ficará a janela estará completamente coberta. Então, vou simplesmente cortar o pedaço assim e depois fazer uma tira de cerca de um milímetro.E então, a partir disso, posso fazer um pedaço de fita de cerca de um milímetro quadrado. E a seguir, vou colocá-lo logo acima e à esquerda da data. Coloque-o bem ali e você poderá vê-lo.Está aderindo muito bem. Então posso voltar à tira que já preparei, cortar outro pedaço de fita de um milímetro. E novamente, apenas colocá-lo à esquerda do número indicado, que na verdade corresponde ao topo do ovo.Agora que o colocamos de lado, está à direita. E mais um pedaço aqui. Agora não estou usando luvas porque as luvas farão a fita aderir a elas, e eu já lavei as mãos.Não estou realmente preocupado com qualquer outra coisa contaminando o ativo neste momento. Então, vou em frente e pegar um par de tesouras com a ponta afiada. Vou entrar no centro do local onde coloquei a fita e vou apenas girar em um movimento no sentido anti-horário horário até que se rompa um pouco.E você verá que há um pequeno orifício ali. Agora, o orifício não precisa ser muito grande, porque, uma vez que inserimos esta seringa, ela ampliará o orifício o suficiente. Mas isso evita que penetremos diretamente com uma agulha e tentemos quebrar o ovo com ela, já que, muitas vezes, isso fará com que todo o lado do ovo se quebre.Então não podemos mais usar o ovo. Ok, agora vou prosseguir com o esvaziamento do ovo. Temos aquele pequeno orifício na lateral e vou usar esta seringa de 10 mililitros e uma agulha de calibre relativamente grande para extrair a clara.Agora quero cerca de três ou quatro mililitros, definitivamente mais de três, mas não muito mais do que quatro e meio ou cinco. Isso permitirá que nosso embrião, que agora está na parte superior, se afaste um pouco da casca. E então poderemos realizar nossas manipulações.Ao inserir a agulha em um ângulo de 45 graus, fico posicionado abaixo da gema. Em seguida, quero apenas girá-la um pouco para a minha direita, para deslizar por baixo, e é possível sentir a ponta da agulha tocando levemente o fundo do ovo. Vou então prosseguir e extrair cerca de três ou quatro microlitros, e o líquido sai de forma bastante limpa.Vou colocar essa albumina no meu balde de cintura aqui e agora posso continuar com os outros ovos. Ok, então vou seguir em frente. E você notará que o orifício que fiz para o escoamento é um pouco maior do que eu gostaria, mas isso acaba sendo aceitável.O que eu quero ter em mente é que, ao inserir a agulha, não devo trincá-lo mais. Então, vou em frente e fazer isso. Ok, então já consigo ver que o ovo tem uma pequena rachadura.Agora, pequenas rachaduras são aceitáveis, mas você precisa se preocupar quando elas se estendem a outro plano do ovo. E neste caso, isso acontece. Dá para perceber isso a partir do buraco.Estende-se praticamente até o topo. E, de fato, é aqui que ficará nossa janela. Então, infelizmente para este ovo, teremos que descartá-lo.E não há nada de especial em descartá-lo. Você não precisa elaborar um protocolo específico ou qualquer outra coisa. Basta colocá-lo no balde de resíduos.Usamos essas lixeiras pretas para designá-las como resíduos de animais, mas, além disso, já foi tudo devidamente tratado. Podemos passar para o próximo ovo. Ok, agora que drenamos todos os nossos ovos, podemos prosseguir e tampar o orifício de drenagem.Agora, isso é importante porque, se não o fizermos dentro da incubadora, podemos ter uma evaporação considerável do que restar da albumina. E um ovo seco é um ovo morto. Então, vamos em frente e pegar uma fita de tamanho aproximadamente igual, colocando-a sobre o orifício, e não precisaremos nos preocupar em acessar esse orifício novamente.Em alguns casos, se você decidir que gostaria de tentar drenar mais albúmina de um ovo, uma vez aberto, esse orifício atua como uma espécie de área selada na qual você pode inserir uma agulha sem perder muita albúmina. Certo, faz isso? Certo, então agora vamos seguir em frente e cobrir os ovos com um pedaço de fita de bom tamanho.E eu comparo isso a colocar um pedaço de fita adesiva sobre um balão antes de enfiar um pequeno alfinete nele. O interessante é que o balão não estoura, e, neste caso, um pequeno pedaço de fita sobre o ovo. O ovo não racha em vários lugares e, então, a janela pode ser selada. Quando a janela se fecha, como usamos fita, isso cria um bom selamento, e não precisamos nos preocupar com qualquer evaporação.Então, você pode ver o tamanho da fita: é provavelmente a maior que já cortei até agora, mas mesmo assim vou esticá-la um pouco mais, puxando levemente, aplicando apenas uma pequena tensão, e colocando-a sobre o ovo. Vou contornar a parte traseira aqui e esticar a fita com muito cuidado sobre o ovo, de modo que não haja dobras exatamente onde ficará minha janela. E você pode reposicionar um pouco a fita.Não é tão aderente a ponto de você precisar se preocupar. Uma vez fixado, está fixado. E você pode ver que nesta área geral aqui é onde vou prosseguir e cortar a janela.Ok, agora que temos fita em todos os ovos, podemos prosseguir e cortar uma janela na parte superior. Esta pode ser a parte mais difícil e, frequentemente, é aqui que se perde a maioria dos ovos. Então, vou apenas limpar bem a minha tesoura com uma gaze contendo álcool e, em seguida, secá-la.O álcool praticamente evapora por si só, mas você não quer que o álcool entre diretamente no ovo. Então vou apenas inserir no meio do local onde está a fita e, novamente, usar esse movimento no sentido horário e anti-horário até ouvir um pequeno estalo. E então sei que minha lâmina já está dentro.Então, eu meio que quero afastar minhas tesouras para que fiquem quase paralelas à superfície do ovo. Em seguida, faço pequenos cortes até conseguir inserir toda a lâmina da tesoura no interior. Depois de percorrer aproximadamente meio círculo, volto no sentido oposto, sem fechar o círculo completamente, pois quero deixar uma janela aberta, e então posso simplesmente abrir o ovo.E agora parece que estão com a idade que eu esperava, não têm muitos vasos sanguíneos, mas há um pouco de sangue ao redor da região onde o embrião está localizado, principalmente da região do alantoide, de onde o sangue começou a se espalhar e o batimento cardíaco cessou. Então, vou fechar isso, deixar repousar por cima assim e voltar novamente; prosseguirei fechando as janelas. E novamente, apenas alise sobre a superfície e volte na outra direção.E está bem, temos algumas bolhas aqui e acontece que o embrião está deslocado para o lado. Agora temos duas opções neste momento. Se tivermos muitos ovos e não estivermos preocupados em utilizar cada um deles, podemos simplesmente descartar este.Ou o que podemos fazer é fechar a janela e ajustar para que o embrião flutue novamente para o topo, onde desejamos que ele esteja. E, quando chegarmos a ele durante nossas manipulações, talvez já esteja na posição desejada. Caso contrário, podemos descartá-lo naquele momento.Então, o que fiz aqui foi simplesmente colocá-lo em um ângulo. Você terá um pequeno escoamento de albumina, mas isso ajudará o embrião a retornar para onde precisa estar. Ok, agora que temos todas essas janelas, precisamos garantir que estejam fechadas e queremos que permaneçam fechadas antes de realizarmos quaisquer manipulações.Em seguida, podemos prosseguir e selar novamente o ovo. Mas se houver uma abertura, às vezes a gema pode escapar. Se você sabe que o ovo se inclina um pouco ao caminhar de um cômodo para outro, não quer que todo o conteúdo saia.Então, tudo o que estou fazendo é cortar um outro pedaço de fita plástica com cerca de um milímetro de largura, provavelmente dois ou três milímetros de comprimento. Gosto de colocá-lo bem no meio. E se conseguir puxá-lo para a frente do ovo, ele fica bem justo.E você pode ver onde a janela se encaixa, exatamente onde estava a outra fita, onde cortamos a janela, deixando-a bem vedada por enquanto. Quero dizer, nós vamos prosseguir e fazer algumas manipulações em alguns minutos, então não precisa estar completamente hermética. Assim é como você prepara e abre a janela em seus ovos.Boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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