Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

[Locutor] Este protocolo incorpora técnica asséptica em métodos de plaqueamento utilizados para isolar, propagar ou enumerar microrganismos como bactérias e fagos. Os procedimentos incluem plaqueamento por esgotamento de culturas bacterianas para isolar colônias isoladas, plaqueamento por espalhamento para determinar a concentração de bactérias e plaqueamento por espalhamento superficial para enumerar colônias bacterianas viáveis. Camadas de ágar mole são usadas para isolar fagos e enumerar placas, enquanto o plaqueamento por replica permite transferir células de uma placa para outra em um padrão espacial idêntico. Em última análise, as aplicações práticas dessas técnicas para o cultivo de microrganismos variam desde a identificação de bactérias em ambientes até avanços tecnológicos em genética molecular e bioensaios de alto rendimento.

– Geralmente, indivíduos novos nesses métodos de plaqueamento podem ter dificuldades, pois as manipulações exigem movimentos cuidadosos e coordenados, evitando o contato com superfícies não estéreis. Aprender esses procedimentos rotineiros exige treinamento e prática. O responsável por demonstrar os procedimentos será o coordenador do meu laboratório, Dr. Kris Reddi.

- [Locutor] Inicie o trabalho com microrganismos conhecendo as regras do laboratório e as precauções de segurança, incluindo classificação de risco biológico, descontaminação de resíduos e descarte. Confirme que todos os instrumentos, soluções e meios para procedimentos de plaqueamento são estéreis. Estabeleça também uma área de trabalho limpa. Limpe-a com desinfetante. Monte um bico de Bunsen com um tubo conectado à linha de gás e organize os materiais necessários, com todos os itens devidamente rotulados. Prossiga lavando as mãos cuidadosamente com sabão antisséptico e água morna. Primeiro, umedecer as mãos com água corrente morna, aplicar o sabão e espalhá-lo completamente. Esfregar vigorosamente as mãos, gerando fricção em todas as superfícies, incluindo polegares, costas dos dedos, costas das mãos e sob as unhas. Em seguida, enxaguar completamente para remover o sabão residual e secar com toalhas de papel retiradas de um dispensador. Por fim, com uma toalha de papel nova, fechar a torneira. O Método de Plaqueamento em Estria é projetado para isolar culturas puras de bactérias, ou colônias, de populações mistas por separação mecânica simples. Retire uma placa de ágar de uma caixa fria a quatro graus Celsius e pré-aqueça à temperatura ambiente. Selecione uma ferramenta entre os instrumentos disponíveis para estriar a placa. Certifique-se de que a placa esteja seca, sem condensação na tampa. Rotule a base da placa de ágar ao redor da borda. Quando proficientes, use uma única placa para múltiplas amostras. Em seguida, acenda um bico de Bunsen para flamejar o loop metálico. Comece a três ou quatro polegadas do loop metálico, com o fio na ponta do cone azul, a parte mais quente da chama do bico de Bunsen. Quando o metal ficar incandescente, mova o fio para que a chama alcance o loop. Para resfriar o loop, toque a borda do meio de ágar, produzindo um som de chiado. Continue coletando o inóculo no loop. Levante a metade inferior da placa. Mova o loop de trás para frente, da borda ao centro, no primeiro quadrante da placa. Coloque a placa invertida de volta sobre a tampa. Reflame o loop metálico. Gire a placa de Petri em 90 graus. Toque o loop próximo ao final da última estria, usando o padrão de vaivém, cruze a metade final das estrias no primeiro quadrante e depois avance para o segundo quadrante vazio. Após preencher o segundo quadrante, coloque a placa de lado. Repita o procedimento de estriamento para o terceiro e quarto quadrantes, evitando o contato com o primeiro quadrante. Para estriar com um palito de dente estéril e plano, segure a extremidade estreita suavemente entre o polegar e o dedo anelar, em um ângulo de 10 a 20 graus em relação ao meio, e use a extremidade larga para estriar os quadrantes. Inverta a placa sobre a tampa entre os quadrantes e descarte o palito adequadamente. Prossiga incubando as placas estriadas com a tampa para baixo. O Método de Plaqueamento por Espalhamento permite enumerar o número total de unidades formadoras de colônias na superfície e dentro do ágar de uma única placa. Ajuste um cronômetro para 10 minutos, transfira 18 mililitros de meio de ágar fundido de um banho-maria a 55 graus Celsius para um bloco térmico a 48 graus Celsius e equilibre por 10 minutos. Rotule a base de uma placa de Petri estéril. Se aplicável, inclua o fator de diluição. Agora, dispense um mililitro de amostra no centro da placa de Petri. Feche a tampa. Remova a tampa do tubo de ágar fundido e passe a borda do tubo aberto pela chama. Despeje cuidadosamente o ágar na placa de Petri. Feche a tampa e, em seguida, misture a amostra com o ágar girando suavemente a placa. Aguarde 30 minutos para que o ágar solidifique. Após a solidificação do ágar, inverta e coloque a placa em um local aquecido. O plaqueamento por espalhamento visa separar microrganismos contidos em um pequeno volume de amostra, distribuindo as colônias resultantes uniformemente sobre a superfície do ágar. Equilibre uma placa à temperatura ambiente e rotule-a adequadamente. Posicione a placa na plataforma giratória. Pipete 0,1 mililitro de amostra no centro do ágar e feche a tampa. Ejecte a ponteira em um recipiente de resíduos. Mergulhe a haste metálica em um béquer com etanol a 70%, cobrindo toda a parte inferior do espalhador e a primeira polegada da haste, e depois escorra. Queime o etanol em excesso passando pela chama do bico de Bunsen. Em seguida, abra a tampa da placa de ágar e resfrie o espalhador tocando-o no ágar ao longo da borda, próximo à extremidade. Gire lentamente a plataforma giratória. Segurando o espalhador suavemente sobre a superfície do ágar, distribua gradualmente a amostra uniformemente por toda a placa com movimentos de vaivém enquanto a plataforma gira. Feche a tampa e deixe a amostra absorver completamente por pelo menos cinco minutos. Em seguida, incube a placa invertida. Primeiro, rotule adequadamente a placa de ágar. Abra a tampa da placa de ágar. Em seguida, abra o recipiente de esferas de vidro pré-esterilizadas e flameje a borda. Dispense cuidadosamente 10 a 12 esferas de vidro estéreis sobre uma placa de ágar. Feche a tampa da placa e flameje a borda do recipiente de esferas de vidro antes de recolocar a tampa. Agora, pipete a amostra no centro do ágar. Com movimento horizontal, agite suavemente as esferas sobre a superfície do ágar sete vezes. Se realizado corretamente, o procedimento produz um som semelhante ao de chocalhos. Gire a placa em 60 graus e agite horizontalmente novamente sete vezes. Mais uma vez, gire a placa em 60 graus e repita a agitação. Verifique se a amostra foi absorvida. Em seguida, despeje as esferas contaminadas em um béquer de coleta marcado contendo água sanitária a 10%. Incube a placa invertida. O ensaio de placa é comumente usado para detectar e quantificar fagos bacterianos. Cultive a bactéria indicadora até a fase exponencial e mantenha-a em gelo. Em seguida, rotule dois tubos microcêntrifugos estéreis como fago e controle e adicione 50 microlitros de amostra de fago ou tampão, respectivamente, a cada um. Em seguida, agite suavemente a cultura bacteriana no frasco, transfira uma alíquota de bactérias para um tubo estéril, vortexe suavemente a bactéria indicadora e adicione 500 microlitros de bactérias a cada tubo de absorção. Misture suavemente agitando os tubos com os dedos. Nunca vortexe ou pipete vigorosamente amostras de fago. Incube a mistura de fago e bactérias à temperatura apropriada para a cepa indicadora por 20 minutos. Enquanto isso, transfira dois tubos de ágar mole de um banho-maria a 55 graus Celsius para um bloco de aquecimento a 48 graus Celsius. Equilibre por 10 minutos. Rotule duas placas de ágar duro nutricional, livres de condensação e previamente equilibradas à temperatura ambiente. Remova um tubo de ágar mole do bloco de aquecimento e verifique se o conteúdo não está muito quente ao toque. Em seguida, transfira assépticamente a mistura do tubo de absorção de fago para o tubo de ágar mole. Em seguida, gire rapidamente entre as palmas das mãos para misturar o conteúdo. Com o tubo em uma mão, abra a tampa da placa de ágar duro com a outra mão. Imediatamente, despeje todo o conteúdo do tubo sobre a superfície da placa de ágar duro. Balance a placa rapidamente e suavemente. Feche a tampa e coloque a placa em uma superfície nivelada por 30 minutos até que o ágar mole solidifique. Em seguida, repita o procedimento para o tubo de absorção controle, transferindo a mistura controle para um tubo de ágar mole, misturando, despejando o conteúdo sobre uma placa de ágar duro, balanceando e permitindo que o ágar mole solidifique por 30 minutos. Inspecione as placas quanto à formação de placas. Para isolar uma placa de uma mistura heterogênea, perfure cuidadosamente o centro com um palito de dente estéril e transfira o inóculo para um tubo microcêntrifugo estéril contendo 100 microlitros de tampão de fago. Continue purificando este lisado repetindo o ensaio de placa de três a seis vezes, com diluições seriadas conforme necessário. O plaqueamento por réplica explora um fenótipo selecionável, permitindo a comparação do crescimento celular em uma placa primária com placas secundárias. Marque uma grade na base da placa, rotule a placa primária e numere os quadrados resultantes. Agora, use técnica asséptica para retirar um palito de dente pré-esterilizado do béquer, toque o centro de cada quadrado com uma amostra de células e descarte o palito em um recipiente de resíduos apropriado. Incube a placa primária. Empilhe a placa primária e todas as placas secundárias. Faça uma marca de orientação no lado da metade inferior das placas. Em seguida, remova um pano de veludo estéril da embalagem e coloque-o sobre o bloco cilíndrico. Coloque o suporte, alinhando as marcas do suporte com as do bloco. Observe a marca de orientação no bloco e no suporte. Em seguida, remova a tampa da placa primária. Alinhe as marcas de orientação da placa e do bloco. Abaixe a placa para que a superfície do ágar entre em contato com o pano de veludo. Usando as pontas dos dedos, pressione suavemente e uniformemente a parte traseira da placa primária e, em seguida, levante-a cuidadosamente do bloco. Confirme que a impressão das células é visível no veludo. Recoloque a tampa na placa. Agora, repita sequencialmente o protocolo no pano de veludo com cada uma das placas secundárias. Use a impressão de células da placa primária para inocular até oito placas secundárias, ordenadas da menos à mais favorável em termos de substrato. Finalmente, como controle positivo, para a última placa da série, use um meio de ágar no qual todas as cepas testadas devem crescer. Fixe as placas invertidas juntas com fita adesiva e incube-as. Inspecione as placas secundárias quanto ao crescimento. Desligue o bico de Bunsen e guarde todos os materiais. Coloque roupas de laboratório contaminadas, vidraria e resíduos perigosos nos recipientes apropriados de descarte. Limpe a área de trabalho com desinfetante. Finalmente, lave as mãos cuidadosamente com sabão antisséptico e água morna. Serratia marcescens é uma proteobactéria gram-negativa, em forma de bastonete, que produz um pigmento avermelhado chamado prodigiosina. É comumente encontrada crescendo em banheiros e cortinas de chuveiro. Neste exemplo, a técnica de plaqueamento em estria gera colônias isoladas no quarto quadrante. Esta análise de bactérias presentes em uma amostra de água coletada de uma fonte pública de água potável utiliza a técnica de Plaqueamento por Espalhamento. Observe a diferença na aparência das colônias. As colônias superficiais são grandes e de formato circular, enquanto algumas colônias superficiais são muito pequenas e de formato irregular. A técnica de Plaqueamento por Espalhamento é um componente importante em experimentos de enriquecimento, seleção e triagem. Por exemplo, o método copacabana é uma ferramenta diferencial na clássica triagem azul-branca em tecnologia de DNA recombinante. O fago T4 é um fago de DNA de dupla fita virulento que infecta seu hospedeiro Escherichia coli, lisando-o e liberando fagos descendentes. Este ensaio de placa em ágar EHA mostra fagos em zonas de clareamento de aproximadamente um milímetro de diâmetro. Na ausência de partículas de fago infectantes, o crescimento bacteriano resulta em uma suspensão turva de células no ágar mole, na qual colônias discretas não são visíveis. Na técnica de sobreposição com ágar mole, as morfologias das placas variam. Por exemplo, aqui a mesma cepa hospedeira de micobactéria produz morfologias de placas distintas na presença de fagos destruidores de micobactérias versus fagos de micobactérias MSSS. O poder do plaqueamento por réplica está na triagem simultânea de um grande número de microrganismos. Neste caso, quatro cepas de Pseudomonas foram testadas em duplicata quanto ao crescimento em três diferentes fontes de carbono: acetamida, lactose e glicina. Aqui, a placa primária é um meio completo YTA inoculado com as quatro cepas, conforme indicado. As cepas mostram padrões variáveis de crescimento em placas réplica de meio mínimo MSA suplementado com uma única fonte de carbono: acetamida, lactose ou glicina. Todas as cepas crescem na última placa de controle positivo, confirmando que as células foram transferidas para todas as placas secundárias nesta série. A tabulação desses resultados de plaqueamento por réplica detalha a triagem simultânea de diferentes cepas selvagens quanto aos requisitos característicos de crescimento.

— Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar procedimentos de plaqueamento sem contaminar os meios ou culturas, bem como de como usar o método de plaqueamento apropriado para qualquer tarefa experimental específica no laboratório. Tornar-se proficiente nessas técnicas exige prática. No entanto, com treinamento adequado, os procedimentos de plaqueamento descritos neste vídeo se tornarão naturais ao trabalhar na bancada do laboratório.