Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma rede vascular humana in vivo. Isso é realizado primeiramente cultivando células formadoras de colônias endoteliais derivadas de sangue humano e células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana. Ambos os tipos celulares são então misturados a um gel à base de colágeno, que é injetado subcutaneamente em um camundongo imunodeficiente.

Sete dias depois, o implante é coletado e avaliado quanto à formação de uma rede vascular humana. Em última análise, a presença de microvasos específicos humanos dentro dos implantes pode ser verificada por meio de histologia e imunohistoquímica. A principal vantagem desta tecnologia em comparação com um método ácido, como a implantação cirúrgica de um constructo, é o LED, que é simples e fácil de realizar, e não requer cirurgia.

Inicie o descongelamento de um frasco de E CFCs e dilua imediatamente as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DMEM. Centrifugue a suspensão celular a 1200 RPM durante cinco minutos e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio EGM dois morno. Em seguida, transfira as células para uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros revestida com gelatina a 1% e incube as células durante a noite em um incubador umidificado.

Na manhã seguinte, aspire cuidadosamente o meio e todas as células não ligadas. Em seguida, forneça às células aderidas 10 mililitros de meio E GM dois fresco. Continue este processo durante os próximos dias até que uma monocamada confluente se tenha formado.

Em seguida, lave as células com 10 mililitros de PBS. Substitua o PBS por dois mililitros de tripsina-EDTA e retorne a placa ao incubador por cinco minutos. Após cinco minutos, examine sob microscópio, bata suavemente na placa e verifique se as células se desprendeu.

Se não, repita as incubações breves com agitação suave. Assim que as células se destacarem completamente, adicione oito mililitros do meio EGM dois às células e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Conte as células e centrifugue-as a 1200 RPM durante cinco minutos.

Agora plaque as células em placas de cultura de tecidos revestidas com gelatina a 1%, com uma densidade de semeadura de 5.000 células por centímetro quadrado. Incube as células em meio EGM dois e alimente-as a cada dois ou três dias com meio EGM dois. Repita este procedimento para passagens subsequentes entre a quarta e a oitava passagem.

As CFCs-E estarão prontas para uso. Este protocolo também pode ser utilizado para cultivar MSCs. Basta substituir o meio E GM dois pelo meio M-S-C-G-M.

Utilize uma placa de cultura não revestida. Inicie a subcultura com 80% de confluência e subcultive com uma densidade de semeadura de 10.000 células por centímetro quadrado. Este experimento requer 800.000 CFCs-E e 1.200.000 CSMs por implante.

Normalmente, cinco implantes são preparados simultaneamente. Para começar, aspire o meio celular das placas de cultura e lave cada placa de células com 10 mililitros de PBS. Substitua o PBS por dois mililitros de tripsina EDTA e incube as placas com agitação suave.

Verifique as células sob um microscópio a cada dois a cinco minutos até que todas as células tenham se destacado. Em seguida, adicione oito mililitros de DMEM e colete a solução celular. Em um tubo cônico de 15 mililitros, conte as células e transfira o número suficiente de células para cinco implantes para um único tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, centrifugue as células a 1200 RPM durante cinco minutos e remova o sobrenadante. Prepare cuidadosamente uma mistura de fibrinogênio e fibronectina colágena em gelo. Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet celular na mistura gelada.

Evitando a formação de bolhas de ar, carregue a suspensão celular em uma seringa de um mililitro e acople uma agulha de calibre 26 com tampa. Mantenha a seringa carregada em gelo até a injeção da mistura celular. Anestesie quatro camundongos nuas atímicos imunodeficientes com seis semanas de idade utilizando uma câmara de fluoreto de ISO.

Uma vez que os camundongos estejam anestesiados e sem resposta ao aperto dos dedos dos pés, prossiga com as injeções para cada camundongo. Use uma agulha de 30 graus para injetar 50 microlitros de solução de trombina por via subcutânea na região dorsal superior. No mesmo local, injete 200 microlitros da mistura celular.

Usando uma agulha de 26 gauge, as macromoléculas injetadas irão gelificar e formar uma pequena protuberância visível sob a pele. Após a injeção, coloque os camundongos sobre uma camada de gaze para conforto e aquecimento. Observe-os até que voltem a ficar ambulatórios.

Nos próximos três dias, realize uma observação diária da saúde geral do animal. Uma semana após as injeções, eutanazie os camundongos com dióxido de carbono e remova cirurgicamente o tampão de gel. Após a recuperação, fotografe os tampões de gel ao lado de uma régua, coloque cada tampão de gel em um cassete histológico e os submerja em formalina tamponada a 10% durante a noite, à temperatura ambiente.

No dia seguinte, lave a formalina tamponada neutra a 10% com água destilada. Armazene as cápsulas em PBS a quatro graus Celsius até que sejam avaliadas para avaliação histológica. Faça cortes de sete mícrons do implante embutido em parafina.

Em seguida, quantifique a densidade de microvasos na parte central dos implantes. Com auxílio da coloração com hematoxilina e eosina, pontue o número de vasos por milímetro quadrado para demonstrar a natureza humana dos vasos microvasculares. Incube as seções com um anticorpo anti-CD31 humano comercialmente disponível em uma diluição de um para 100.

Esta imagem de contraste de fase mostra a morfologia característica em forma de calçada de células endoteliais em uma monocamada típica e confluente de CFCs derivadas de sangue de cordão. Esta imagem mostra a morfologia típica em forma de fuso de MSCs derivadas da medula óssea humana. Após uma semana de incubação no hospedeiro camundongo, o implante marcado por uma linha tracejada amarela apresentava-se muito diferente dos tecidos do hospedeiro em maior aumento.

Vários microvasos revelaram suas estruturas luminadas contendo hemácias e são destacados pelas setas amarelas. Quando os coágulos foram examinados por imuno-histoquímica, o lúmen dos microvasos reagiu com um anticorpo monoclonal contra CD31 humano. Os núcleos celulares foram contra-estainados com hematina.

Uma vez dominada, essa tecnologia pode ser realizada dentro de uma onça se for executada corretamente.