Name: Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprenda a bioengenharia de redes microvasculares humanas em camundongos imunodeficientes usando células ECFC e MSC em gel de colágeno/fibronectina. Este método simples avança a engenharia de tecidos vasculares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo NIH conceder K99EB009096-01A1 para JM-M.

1. Preparação <ol><li> Faça EGM-2 médias (500 mL) <ul><li> Adicionar 100 mL de soro fetal bovino (FBS) a 395 mL de meio basal endotelial (EBM-2). </li><li> Adicionar 5 mL de solução-Glutamina penicilina-estreptomicina 100x (GPS). </li><li> Adicione todos os suplementos EGM-2 SingleQuots exceto hidrocortisona (isto é, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, heparina, ácido ascórbico, e GA-1000). </li><li> Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. </li></ul></li><li> Faça MSCGM médio (500 mL) <ul><li> Adicionar 5 mL de GPS 100x a 440 mL de meio basal mesenquimais Stem Cell (MSCBM). </li><li> Adicionar todo o conteúdo do kit SingleQuots MSCGM. </li><li> Adicionar hFGF-B alíquota de suplementos EGM-2 SingleQuots. </li><li> Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. </li></ul></li><li> Faça DMEM (500 mL) <ul><li> Adicionar 50 mL de soro fetal bovino (FBS) a 440 mL de glicose alta 1x Dulbecco Modificado Águia Medium (DMEM). </li><li> Adicionar 5 mL de GPS 100x. </li><li> Adicionar 5 mL de solução de aminoácido não essencial. </li><li> Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. </li></ul></li><li> Faça colágeno / fibronectina solução (3,6 mL; feitas no mesmo dia da injecção) <ul><li> Adicionar 0,4 mL de DMEM 10x a 150 mL de água destilada H 2 O. </li><li> Adicionar 100 mL de HEPES 1M (25 mM final). </li><li> Cuidadosamente, adicione 2,4 mL de colágeno bovino (5 ações mg / mL; 3 mg / mL final) e misture delicadamente no gelo. </li><li> Ajustar o pH a neutralidade por adição de solução de NaOH 1N (aproximadamente 30 mL). </li><li> Use indicador vermelho de fenol para avaliar pH neutro; alternativa, use papel de teste para monitorar pH pH. </li><li> Adicionar 120 mL de fibronectina humana (1 estoque mg / mL, 30 mcg / mL final) </li><li> Adicionar 0,4 mL de FBS (10% final) </li><li> manter solução em gelo até o uso. </li></ul></li><li> Fazer a solução de fibrinogênio (1 mL; feitas no mesmo dia da injecção) <ul><li> Adicionar 30 mg de fibrinogênio em pó para 1 mL de NaCl 0.9N (pH 7,4) solução (30 mg / mL final). </li><li> Antes do uso, incubar a solução de fibrinogênio, a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> Misture delicadamente, sem vortex, antes de sua adição ao gel de colágeno / fibronectina. </li></ul></li><li> Faça trombina solução (200 mL) <ul><li> Adicionar um KU de trombina em pó para 200 mL de solução salina NaCl 0,9% normal (50 U / mL). </li><li> Filtro esterilizados com um filtro de seringa de 0,2 mícrons tamanho dos poros e armazenar a -20 ° C até o uso. </li><li> Antes do uso, diluir com 0,9% NaCl normal para uma concentração final de 10 U / mL. </li></ul></li><li> Fazer 1% de solução de gelatina (500 ml) <ul><li> Adicionar 5 g de gelatina em pó para 500 mL de fosfato de solução salina tamponada Dulbecco (PBS). </li><li> Autoclavado a 121 ° C por 30 min. </li><li> Filtro esterilizados com um filtro de vácuo 0,2 mícrons tamanho dos poros. </li></ul></li><li> Casaco de 100 milímetros de tecido placas de cultura com solução de revestimento de 1% de gelatina <ul><li> Adicionar 10 mL de solução de gelatina 1% a cada placa de cultura de 100 mm de tecido. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C por 60 min. </li><li> Antes do uso, remover a solução de gelatina e lavar os pratos uma vez com PBS. </li></ul></li></ol> 2. Cultura de Cabo Humanos derivados do sangue endotelial Colony-Forming Cells (ECFCs) Este protocolo assume frascos congelados de ECFC estão disponíveis no laboratório antes desta experiência. ECFC pode ser isolado a partir da fração de células mononucleares de qualquer sangue do cordão umbilical ou sangue periférico de adultos, como descrito anteriormente 7. <ol><li> Frasco de descongelar um dos ECFCs (tipicamente 0.5-1x10 6 células em 1 mL de meios de congelamento) retirado do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e imediatamente diluir seu conteúdo em um tubo de 15 mL cônico contendo 10 mL de meio DMEM. Giram a 1200 rpm por 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de EGM-2 quente. </li><li> Adicionar a 10 mL de suspensão ECFC em um 1% de gelatina revestidos de 100 mm placa de cultura de tecidos. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% CO 2. No dia seguinte, aspirar cuidadosamente as células não ligado e médias empresas, e alimentam as células preso com 10 mL de meio de EGM-2 fresca. </li><li> Alimentar a placa a cada 2-3 dias, com EGM-2 médio. Permitem que as células se expandir de tal forma que a placa é coberta por uma monocamada confluente celular. Na confluência, as células subcultura da seguinte forma: </li><li> Aspirar o meio de cultura e lavar as células com 10 mL de PBS. </li><li> Remover PBS e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA solução para cada placa de 100 mm. Agite levemente o prato para distribuir uniformemente a solução de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 3-5 minutos. Bata suavemente na placa para ver as células destacadas em suspensão sob um microscópio invertido. </li><li> Quando as células completamente destacar, adicionar 8 ml de EGM-2 médio e recolher o solu celularção em um tubo de 15 mL cônico. Exame de 10 mL para contar as células em um hemocitómetro e trabalhar o número total de células colhidas. </li><li> Placa as células em 1% de gelatina revestido placas de cultura de tecidos com uma densidade de semeadura de 5.000 células / cm 2, utilizando-2 EGM médio. Coloque as placas na incubadora e alimentá-los a cada 2-3 dias, com EGM-2 médio. </li></ol> Repita este procedimento para passagens subseqüentes. Manter o controle do número de passagem como a população de células é expandido. ECFCs será usado entre as passagens 4-8. 3. Cultura de medula óssea humana Derivados Células-Tronco Mesenquimais (MSCs) Este protocolo assume frascos congelados da MSC humano estão disponíveis no laboratório antes desta experiência. MSC pode ser isolada de aspirados de medula óssea, como descrito anteriormente 11. <ol><li> Frasco de descongelar um dos MSCs (tipicamente 0,50 1x10 6 células em 1 mL de mídia congelação) retirado do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e imediatamente diluir seu conteúdo em um tubo de 15 mL cônico contendo 10 mL de meio DMEM. Giram a 1200 rpm por 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio MSCGM quente. </li><li> Adicionar a 10 mL de suspensão MSC em uma placa de cultura não revestido de 100 mm de tecido. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% CO 2. No dia seguinte, aspirar cuidadosamente as células não ligado e médias empresas, e alimentam as células preso com 10 mL de meio de MSCGM fresco. </li><li> Alimentar a placa a cada 2-3 dias, com média MSCGM. Permitem que as células se expandir de tal forma que a placa chega a 80% da monocamada celular confluente. Na confluência de 80%, subcultura as células da seguinte forma: </li><li> Aspirar o meio de cultura e lavar as células com 10 mL de PBS. </li><li> Remover PBS e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA solução para cada placa de 100 mm. Agite levemente o prato para distribuir uniformemente a solução de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C e 5% CO2 por 3-5 minutos. Bata suavemente na placa para ver as células destacadas em suspensão sob um microscópio invertido. </li><li> Quando as células completamente destacar, adicionar 8 ml de meio de MSCGM e recolher a solução de células em um tubo de 15 mL cônico. Exame de 10 mL para contar as células em um hemocitómetro e trabalhar o número total de células colhidas. </li><li> Placa de células em placas de cultura de tecidos revestidos com uma densidade de semeadura de 10.000 células / cm 2, utilizando meio MSCGM. Coloque as placas na incubadora e alimentá-los a cada 2-3 dias, com média MSCGM. </li></ol> Repita este procedimento para passagens subseqüentes. Manter o controle do número de passagem como a população de células é expandido. MSCs será usado entre as passagens 4-8. 4. Ressuspensão de células em Colágeno fibronectina / / Fibrinogênio Solution (Dia 0) Antes do experimento, verifique se não ECFCs suficiente e MSCs em cultura; 0.8x10 6 ECFCs e 1.2x10 6 MSCs serão necessários para cada implante e mouse. <ol><li> Aspirar o meio de cada placa de cultura e lavar as células com 10 mL de PBS. Remover PBS e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA solução para cada placa de 100 mm. Agite levemente o prato para distribuir uniformemente a solução de tripsina-EDTA. Incubar por 3-5 minutos. Bata suavemente na placa para ver as células destacadas em suspensão sob um microscópio invertido. </li><li> Quando as células completamente destacar, adicionar 8 ml de meio DMEM e recolher a solução de células em um tubo de 15 mL cônico. Exame de 10 mL para contar as células em um hemocitómetro e elaborar o número total de ECFCs e colhida MSCs. </li><li> Transferência de 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 células) e 6x10 6 PPM (5x 1.2x10 6 células) juntos em um tubo de 50 mL única cônica. Esta é a quantidade total de células necessárias para cinco implantes individuais e camundongos. Centrifugar a 1200 rpm e remover o sobrenadante. </li><li> Delicadamente, adicionar 100 uL de solução de fibrinogênio a 0,9 mL de colágeno / fibronectina solução (3 mg / mL concentração de fibrinogênio final); manter a mistura sobre o gelo. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 1 mL de solução de colágeno gelo fibronectina / / fibrinogênio frio, misture as células muito cuidado para evitar bolhas. Carga a mistura em uma seringa de 1 mL estéril, e colocar uma agulha de calibre 26 com a tampa na ponta da seringa. Manter a seringa carregada em gelo até injeção. </li></ol> 5. Injecção rato Nude imunodeficientes (Dia 0) Todos os experimentos com animais será realizada com seis semanas de idade atímicos nude (nu / nu) camundongos. <ol><li> Antes da injeção, anestesiar os ratos imunodeficientes, colocando-os em uma câmara de gás isoflurano entrega. Permitir que os ratos para inalar o isoflurano por aproximadamente 2 minutos até que eles são anestesiados e sem resposta para beliscar toe (monitor bate o seu coração por inspeção). </li><li> Para cada rato, injetar 50 mL de solução de trombina (10 U / mL) por via subcutânea na região dorsal superior usando uma agulha de 26 gauge. </li><li no mesmo local onde foi injetada trombina injetar ml da mistura de c usando uma agulha gauge. col vai gel a e fibrinog ir formar fibrina na presen trombina. como resultado o implante deve pequena mas significativa bump sob pele.><li> Após a injeção, coloque o mouse sobre uma camada de gaze para o conforto e calor e observá-los até que se tornem ambulatorial. Então, depois, observe os ratos diariamente durante os primeiros três dias. </li></ol> 6. Colheita (dia 7) <ol><li> Uma semana após as injeções, eutanásia os ratos, colocando-os em uma câmara de gás comprimido CO 2 fornecendo gás. </li><li> Uma vez sacrificados, cortado a pele perto da área da injeção e remover cirurgicamente a ficha de gel. Fotografias digitais dos plugues gel obtido com uma escala são aconselhados. </li><li> Coloque as velas de gel colhidas em cassete histológicos e profunda-los em 10% formalina tamponada neutra durante a noite a temperatura ambiente. </li><li> Após a fixação, lave a 10% neutro tamponado acabar com H 2 O destilada e coloque a cassetes histológicos a 4 ° C em PBS avaliação até histológica. </li></ol> 7. Avaliação: Histologia (H &amp; E) e imunohistoquímica (hCD31) <ol><li> Para avaliação histológica, os implantes são embebidos em parafina e seccionados (7 m de espessura seções), utilizando procedimentos padrão histológico. </li><li> Quantificar a densidade microvascular pela avaliação dos cortes (H &amp; E) Hematoxilina e eosina foram retiradas da parte média dos implantes. Protocolos padrão para coloração H &amp; E podem ser encontrados em outros lugares. Microvasos pode ser identificado como estruturas lumenal contendo células vermelhas do sangue. Relatório densidade de microvasos como o número médio de glóbulos vermelhos cheios de microvasos dos campos analisados ​​e expressos como vasos / mm 2. </li><li> Para demonstrar a natureza humana dos vasos microvascular, as seções do implante deve ser recuperada imunohistoquímica marcadas com um CD31 humano específico (hCD31) anticorpos, por meio de protocolos de coloração padrão. Recomendamos o uso do anticorpo monoclonal de rato anti-CD31 humano de anticorpos DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) em uma diluição de 1:100. A especificidade deste anticorpo humano foi confirmado pela reação negativa obtida com uma diversidade de seções do mouse tecido que foram coradas em 7,11 paralelo. De nota, os vasos sanguíneos do mouse são muitas vezes vistos no interior do implante (especialmente em torno da fronteira), mas os navios do mouse não mancha positiva com este anticorpo. Além disso, a presença de MSC humana pode ser detectado por coloração imuno-histoquímica com anticorpos específicos humana contra CD90 ou α-actina de músculo liso (α-SMA). MSC humanos são encontrados tanto na região perivascular dos vasos recém-formados no sangue e intersticialmente localizados em todo o implante 11. </li></ol> 8. Resultados representante <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aparência típica de ECFC e culturas MSC. Micrografias de contraste de fase exibindo a aparência típica de ECFCs e MSCs em cultura. (A) monocamada confluente de sangue do cordão umbilical derivados ECFCs mostrando a morfologia calçada característica das células endoteliais. (B) de medula óssea humana derivada MSCs exibindo uma morfologia forma fuso. Bares Scaler, 200 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Aparecimento de plugues explantado no dia 7. Derivados do sangue do cordão umbilical e ECFCs derivadas da medula óssea MSCs foram incluídos em colágeno / fibronectina / fibrina gel e implantado por via subcutânea em camundongos nus, como descrito no texto. (A) Após 7 dias, uma vez que o mouse tem sido sacrificada, cortado a pele perto da área da injeção e expor o plugue de celular / gel lançando a pele. (B) Aspecto da ficha cirurgicamente removido do mouse e antes da fixação de formol. A cor vermelha do implante é uma indicação de vascularização. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Identificação histológica da rede vascular em plugs explantado. Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) cortes corados retirado da parte central da plugs explantado. (A) A baixa ampliação micrografia (10x) mostrando o implante (marcado por uma linha amarela tracejada) no contexto dos tecidos do hospedeiro circundante (ie, tecido adiposo e músculo esquelético). (B) grande aumento (40x) micrografia mostrando microvasos múltiplos (amarelo seta apontando para alguns deles) dentro do plug; microvasos pode ser identificado como estruturas lumenal contendo células vermelhas do sangue. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Identificação imuno-histoquímica dos direitos humanoslumens. imunohistoquímica cortes corados retirado da parte central da plugs explantado. Coloração foi realizada utilizando um anticorpo monoclonal anti-CD31 humano de anticorpos (hCD31) de DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) em uma diluição de 1:100; núcleos celulares foram contra com hematoxilina. (A) A baixa ampliação micrografia (10x) mostrando o implante (delimitada por uma linha tracejada preta) no contexto da envolvente tecidos do hospedeiro. Humano específico, CD31 positivo microvasos estão manchados de marrom (coloração com peroxidase). (B) de alta ampliação micrografia (40x) exibindo múltiplas humana microvasos (preto seta apontando para alguns lumens hCD31-positivo) dentro do plug.

<ol><li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+creation+of+long-lasting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li>
<li>N&ouml, r, E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este é um modelo experimental de bioengenharia humana redes vascular. As principais características deste modelo são: 1) microvasos são formadas a partir de células humanas isoladas de tecidos pós-natais (ou seja, de sangue e medula óssea), 2) microvasos são formados em um animal adulto, e 3) microvasos não surgem de pré -existentes (host) Os navios, mas ao invés disso eles são formados, de novo, a partir de células individuais suspensas em um gel adequado. Angiogênese desempenha um papel importante neste ensaio, pois as ligações para a vasculatura murino são necessárias para atingir células vermelhas do sangue cheio navios, um dos funcionais de leitura neste ensaio. Além disso, células mielóides de acolhimento são recrutados para o implante no transplante primeiros dias após, e elas são necessárias para a formação do novo leito vascular 12. Este modelo experimental oferece uma versátil, sistema modelo quantificáveis, e relativamente simples para o estudo pós-natal formação de redes humanas vascular in vivo. Além disso, este ensaio é simples de executar e não requer uma incisão ou procedimento cirúrgico. O modelo poderia ser usado para estudar o potencial vasculogênica de diferentes fontes de células endoteliais humanas e perivascular. O modelo poderia ser utilizado para triagem de anti-e / ou pró-vasculogênica compostos. Finalmente, o modelo pode ser usado para estudar o papel (s) de genes específicos na formação e função de uma rede vascular composta por endotélio humano.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Médio Basal endoteliais, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 suplementos SingleQuot </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina-penicilina-estreptomicina solução, 100x GPS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 30-009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Mesenquimais Stem Cell BulletKit Meio de Crescimento, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado em alta de glicose Dulbecco Eagle Medium, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM não-solução de aminoácidos essenciais, 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado em alta de glicose Dulbecco Eagle, em pó DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> Solução tampão HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex colágeno bovino solução que eu </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Humanos fibronectina </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinogênio de bovinos plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescador </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato salina tamponada Dulbecco, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano, líquido para inalação </td><td> Buxter Healthcare Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Trombina bovina a partir de plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Solução de formalina, Neutral Buffered </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoclonal de rato anti-humano de anticorpos CD31 </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Clone JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengenharia humanos networks microvascular em camundongos imunodeficientes

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

O futuro da engenharia de tecidos e terapias baseadas em células para a regeneração dos tecidos, provavelmente, dependem de nossa capacidade de gerar redes funcional vascular in vivo. Neste sentido, a busca de modelos experimentais para construir redes de vasos sanguíneos in vivo é de extrema importância 1. A viabilidade das redes de bioengenharia microvascular in vivo foi exibido pela primeira vez usando tecidos derivados de células endoteliais humanas maduras (ECs) 2-4, no entanto, tais autólogo de células endoteliais apresentam problemas para uso clínico amplo, porque eles são difíceis de obter em quantidades suficientes e requerem colheita da vasculatura existente. Essas limitações têm instigado a busca por outras fontes de ECs. A identificação dos endoteliais formadoras de colônias de células (ECFCs) no sangue foi uma oportunidade para não-invasiva obter ECs 07/05. Nós e outros autores têm mostrado que ECFCs adultos e do cordão umbilical derivados têm a capacidade de forma funcional redes vascular in vivo 7-11. Importante, esses estudos também têm demonstrado que a obtenção estável e durável redes vascular, ECFCs requerem co-implantação com células perivascular. O ensaio aqui descrito ilustra esse conceito: vamos mostrar como sangue do cordão umbilical humano derivado ECFCs pode ser combinado com derivadas da medula óssea células-tronco mesenquimais (MSCs) como uma suspensão única célula em um gel de colágeno fibronectina / / fibrinogênio para formar um ser humano funcional rede vascular no prazo de 7 dias após a implantação em um mouse imunodeficientes. A presença de humanos ECFC alinhadas lumens contendo eritrócitos host pode ser visto em toda a implantes indicando não apenas a formação (de novo) de uma rede vascular, mas também o desenvolvimento de anastomoses funcional com o sistema circulatório host. Este modelo murino de rede humana de bioengenharia vascular é ideal para estudos sobre os mecanismos celulares e moleculares de formação de rede humana vascular e para o desenvolvimento de estratégias para irrigar tecidos artificiais.

Aqui, descrevemos uma metodologia para entregar cabo de sangue humano derivado do endotélio formadoras de colônias de células (ECFCs) e derivadas da medula óssea de células-tronco mesenquimais (CTMs), incorporado em um gel de colágeno / fibronectina, por via subcutânea em ratos imunodeficientes. Esta combinação de células / gel gera uma rede vascular humano que se conecta com a vasculatura mouse.

Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes

O futuro da engenharia de tecidos e das terapias baseadas em células para a regeneração tecidual provavelmente dependerá da nossa capacidade de gerar redes vasculares funcionais ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma rede vascular humana in vivo. Isso é realizado primeiramente cultivando células formadoras de colônias endoteliais derivadas de sangue humano e células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana. Ambos os tipos celulares são então misturados a um gel à base de colágeno, que é injetado por via subcutânea em um camundongo imunodeficiente.Sete dias depois, o implante é coletado e avaliado quanto à formação de uma rede vascular humana. Em última análise, a presença de microvasos específicos humanos dentro dos implantes pode ser verificada por meio de histologia e imunohistoquímica. A principal vantagem desta tecnologia em comparação com um método ácido como a implantação cirúrgica de um constructo é a LED, que é simples e fácil de realizar, e não requer cirurgia.Inicie descongelando um frasco de E CFCs e, imediatamente, dilua as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DMEM. Centrifugue a suspensão celular a 1200 RPM durante cinco minutos e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio EGM dois quente. Em seguida, transfira as células para uma placa de cultura tecidual de 100 milímetros revestida com gelatina a 1% e incube as células durante a noite em uma incubadora umidificada.Na manhã seguinte, aspire cuidadosamente o meio e todas as células não ligadas. Em seguida, alimente as células ligadas com 10 mililitros de meio E GM dois fresco. Continue este processo durante os próximos dias até que uma monocamada confluente tenha se formado.Em seguida, lave as células com 10 mililitros de PBS. Substitua o PBS por dois mililitros de tripsina-EDTA e retorne a placa ao incubador por cinco minutos. Após cinco minutos, examine sob microscópio, toque suavemente na placa e verifique se as células se destacaram.Se não, repita as incubações breves com agitação suave. Assim que as células se destacarem completamente, adicione oito mililitros do meio EGM dois às células e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Conte as células e centrifugue-as a 1200 RPM durante cinco minutos.Agora, plaque as células em placas de cultura de tecidos revestidas com gelatina a 1%, com uma densidade de semeadura de 5.000 células por centímetro quadrado. Incube as células em meio EGM dois e alimente-as a cada dois ou três dias com meio EGM dois. Repita este procedimento para as passagens subsequentes entre a quarta e a oitava passagem.As CFCs-E estarão prontas para uso. Este protocolo também pode ser utilizado para cultivar MSCs. Basta substituir o meio E GM dois pelo meio M-S-C-G-M.Utilize uma placa de cultura não revestida. Inicie a subcultura em 80% de confluência e subcultive com uma densidade de semeadura de 10.000 células por centímetro quadrado. Este experimento requer 800.000 CFCs-E e 1.200.000 CSMs por implante.Normalmente, cinco implantes são preparados simultaneamente. Para iniciar, aspire o meio celular das placas de cultura e lave cada placa de células com 10 mililitros de PBS. Substitua o PBS por dois mililitros de tripsina EDTA e incube as placas com agitação suave.Verifique as células sob um microscópio a cada dois a cinco minutos até que todas as células tenham se destacado. Em seguida, adicione oito mililitros de DMEM e colete a solução celular. Em um tubo cônico de 15 mililitros, conte as células e transfira o número suficiente de células para cinco implantes para um único tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, centrifugue as células a 1200 RPM durante cinco minutos e remova o sobrenadante. Prepare cuidadosamente uma mistura de fibrinogênio e fibronectina de colágeno em gelo. Então, ressuspenda suavemente o pellet celular na mistura gelada.Evitando a formação de bolhas de ar, carregue a suspensão celular em uma seringa de um mililitro e acople uma agulha de 26 gauge com tampa. Mantenha a seringa carregada em gelo até a injeção da mistura celular. Anestesie quatro camundongos nuos atímicos imunodeficientes com seis semanas de idade utilizando uma câmara com isoflurano.Uma vez que os camundongos estejam anestesiados e sem resposta ao aperto dos dedos dos pés, prossiga com as injeções para cada camundongo. Use uma agulha de 30 graus para injetar 50 microlitros de solução de trombina por via subcutânea na região dorsal superior. No mesmo local, injete 200 microlitros da mistura celular.Usando uma agulha de 26 furos, as macromoléculas injetadas irão gelificar e formar um pequeno inchaço visível sob a pele. Após a injeção, coloque os camundongos sobre uma camada de gaze para conforto e aquecimento. Observe-os até que recuperem a capacidade de se locomover.Nos próximos três dias, realize uma observação diária da saúde geral do animal. Uma semana após as injeções, eutanazie os camundongos com dióxido de carbono e remova cirurgicamente o tampão de gel. Após a recuperação, fotografe os tampões de gel ao lado de uma régua, coloque cada tampão de gel em um cassete histológico e os submerja em formalina tamponada a 10% durante a noite, à temperatura ambiente.No dia seguinte, lave a solução de formalina tamponada neutra a 10% com água destilada. Armazene as cápsulas em PBS a quatro graus Celsius até que sejam avaliadas para análise histológica. Faça cortes de sete mícrons do implante embutido em parafina.Em seguida, quantifique a densidade de microvasos na parte mediana dos implantes. Com aux&iacute;lio da colora&ccedil;&atilde;o com hematoxilina e eosina, pontue o n&uacute;mero de vasos por mil&iacute;metro quadrado para demonstrar a natureza humana dos vasos microvasculares. Revele as sec&ccedil;&otilde;es com um anticorpo anti-CD31 humano comercialmente dispon&iacute;vel em dilui&ccedil;&atilde;o de um para 100.Esta imagem de contraste de fase mostra a morfologia característica em forma de calçada de células endoteliais em uma monocamada típica e confluente de CFCs derivadas de sangue de cordão. Esta imagem mostra a morfologia típica em forma de fuso de MSCs derivadas de medula óssea humana. Após uma semana de incubação no hospedeiro camundongo, o implante marcado por uma linha tracejada amarela apresentava-se muito diferente dos tecidos do hospedeiro em maior aumento.Vários microvasos revelaram suas estruturas luminais contendo hemácias e são destacados pelas setas amarelas. Quando os coágulos foram examinados por imunohistoquímica, o lúmen dos microvasos reagiu a um anticorpo monoclonal contra CD31 humano. Os núcleos celulares foram contra-coloridos com hematina.Uma vez dominada, essa tecnologia pode ser realizada dentro de uma onça se for executada corretamente.

bioengineering-human-microvascular-networks-in-immunodeficient-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra um método para enxertar pele humana em um camundongo imunodeficiente com uma resposta de neutrófilos suprimida. O método envolve a aplicação de pele humana de espessura dividida no leito do enxerto do camundongo, selando-o e cobrindo-o para recuperação. Eventualmente, a pele humana adere à pele do camundongo, estabelecendo vascularização e circulação, resultando em um xenoenxerto cutâneo bem-sucedido.

Uma técnica para enxerto de pele humana em um modelo de camundongo

Descrevemos os protocolos para nossos arteriosclerois enxerto do mouse (GA) modelos que envolvem a interposição de um segmento de vaso do mouse em um receptor da mesma linhagem consanguínea. Por recruzá alterações genéticas adicionais no recipiente dador, o modelo pode determinar o efeito de genes específicos em GA.

Os modelos de mouse para Arteriosclerose Graft

Neisseria meningitidis é um patógeno específico humano que infecta os vasos sanguíneos. Neste protocolo microvasos humanos são introduzidos em um rato por enxertia de pele humana em ratos imunocomprometidos. As bactérias aderem extensivamente para os vasos humanos, levando a danos vasculares e desenvolvimento da erupção purpúrica normalmente observada em casos em humanos.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis ​​são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.

Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

As injeções intrafemorais permitem o enxerto de um pequeno número de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), colocando as células diretamente na cavidade da medula óssea. Aqui descrevemos um protocolo experimental de injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes.

Injeção intrafemoral de células-tronco hematopoiéticas humanas e progenitoras em camundongos imunocomprometidos 

Apresentamos um modelo reprodutível de camundongo de alotransplante composto vascularizado de membros posteriores para pescoço, heterotópico. Esse protocolo supermicrocirúrgico, envolvendo anastomoses de vasos de 0,3 a 0,5 mm, integra guiagem com filamento de náilon e algemamento venoso. Ela oferece uma plataforma confiável para estudos translacionais sobre tolerância, lesões por isquemia-reperfusão e mecanismos imunológicos em alotransplante composto vascularizado.

Transplante Heterotópico de Membro Posterior para Pescoço no Camundongo: Um Modelo Supermicrocirúrgico de Alotransplante Composto Vascularizado

Aprenda a bioengenharia de redes microvasculares humanas em camundongos imunodeficientes usando células ECFC e MSC em gel de colágeno/fibronectina. Este método simples avança a engenharia de tecidos vasculares.

Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes

Explorar mais vídeos