Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes
July 11th, 2011
Aqui, descrevemos uma metodologia para entregar cabo de sangue humano derivado do endotélio formadoras de colônias de células (ECFCs) e derivadas da medula óssea de células-tronco mesenquimais (CTMs), incorporado em um gel de colágeno / fibronectina, por via subcutânea em ratos imunodeficientes. Esta combinação de células / gel gera uma rede vascular humano que se conecta com a vasculatura mouse.
O objetivo geral deste procedimento é gerar uma rede vascular humana in vivo. Isso é feito primeiro cultivando células formadoras de colônias endoteliais derivadas do sangue humano e células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana. Ambos os tipos de células são então misturados em um gel à base de colágeno, que é injetado por via subcutânea em um camundongo imunodeficiente.
Sete dias depois, o implante é colhido e avaliado quanto à formação de uma rede vascular humana. Em última análise, a presença de microvasos humanos específicos dentro dos implantes pode ser verificada por meio de sua histologia e imuno-histoquímica. A principal vantagem dessa tecnologia sobre um método ácido como o implante cirúrgico de construção é o LED, é simples e fácil de executar e não requer cirurgia.
Comece descongelando um frasco de E CFCs e dilua imediatamente as células em uma cônica de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DMEM. Gire para baixo a suspensão celular a 1200 RPM por cinco minutos e Resus suspenda o pellet celular em 10 mililitros de EGM quente dois meios. Em seguida, transfira as células para uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros revestida com gelatina a 1% e incube as células durante a noite em uma incubadora umidificada.
Na manhã seguinte, aspire suavemente o meio e quaisquer células não ligadas. Em seguida, alimente as células ligadas com 10 mililitros de E GM fresco dois meios. Continue esse processo nos próximos dias até que uma monocamada confluente se forme.
Em seguida, lave as células com 10 mililitros de PBS. Substitua o PBS por dois mililitros de tripsem EDTA e retorne a placa à incubadora por cinco minutos. Após cinco minutos sob um microscópio, bata suavemente na placa e verifique se as células se soltaram.
Caso contrário, repita as breves incubações com um balanço suave. Uma vez que as células tenham se destacado completamente, adicione oito mililitros de EGM dois meios às células e transfira as células para um cônico de 15 mililitros. Conte as células e gire-as a 1200 RPM por cinco minutos.
Agora coloque as células em placas de cultura de tecidos revestidas com gelatina a 1% a uma densidade de assento de 5.000 células por centímetro quadrado. No meio EGM dois, incubar as células e alimentá-las a cada dois ou três dias com o meio EGM dois. Repita este procedimento para passagens subsequentes entre as passagens quatro e oito.
Os E CFCs estarão prontos para uso. Este protocolo também pode ser usado para desenvolver MSCs. Basta substituir E GM dois médios por M-S-C-G-M médio.
Use uma placa de cultura não revestida. Comece a subcultura a 80% de confluência e a subcultura a uma densidade de semeadura de 10.000 células por centímetro quadrado. Este experimento requer 800.000 E CFCs e 1.200.000 MSCs por implante.
Geralmente, cinco implantes são preparados simultaneamente. Para começar, aspire um meio celular das placas de cultura e lave cada placa de células com 10 mililitros de PBS. Substitua o PBS por dois mililitros de tripsina EDTA e incube as placas com um balanço suave.
Verifique as células ao microscópio a cada dois a cinco minutos até que todas as células se desprendam. Em seguida, adicione oito mililitros de DMEM e colete a solução celular. Em uma cônica de 15 mililitros, conte as células e transfira células suficientes para cinco implantes em uma única cônica de 15 mililitros.
Em seguida, gire as células a 1200 RPM por cinco minutos e remova o snat. Prepare cuidadosamente uma mistura de fibrinogênio e fibronectina de colágeno no gelo. Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet celular na mistura gelada.
Evitando a formação de bolhas de ar, carregue a suspensão celular em uma seringa de um mililitro e coloque uma agulha de calibre 26 com tampa. Mantenha a seringa carregada no gelo até que a mistura celular seja injetada. Anestesiados quatro camundongos imunodeficientes nus atímicos de seis semanas usando uma câmara de flúor ISO.
Uma vez que os camundongos estejam anestesiados e não respondam ao beliscão do dedo do pé, prossiga com as injeções para cada camundongo. Use uma agulha de calibre 30 para injetar 50 microlitros de soluções de trombina por via subcutânea na região dorsal superior. No mesmo local, injete 200 microlitros da mistura de células.
Usando uma agulha de calibre 26, as macromoléculas injetadas irão gelificar e formar uma protuberância pequena, mas apreciável, sob a pele. Após a injeção, coloque os ratos em uma camada de gaze para maior conforto e calor. Observe-os até que se tornem ambulatórios.
Nos próximos três dias, faça uma observação diária da saúde geral do animal. Uma semana após as injeções, eutanasiar os camundongos com dióxido de carbono e remover cirurgicamente o tampão de gel. Uma vez recuperados, fotografe os plugues de gel ao lado de uma régua, coloque cada plugue de gel em um histológico e submerja-os em forma tamponada a 10% neutra durante a noite à temperatura ambiente.
No dia seguinte, lave a forma tamponada a 10% neutra com água destilada. Armazene os em PBS a quatro graus Celsius até que sejam avaliados para avaliação histológica. Faça seções de sete mícrons do implante embebidas em parafina.
Em seguida, quantifique a densidade dos microvasos na parte média dos implantes. Com o auxílio de uma coloração H e e, pontue o número de vasos por milímetro quadrado para demonstrar a natureza humana dos vasos microvasculares. Manchar as secções com um anticorpo anti-CD 31 humano disponível no mercado numa diluição de um para 100.
Esta imagem de contraste de fase mostra a morfologia característica de paralelepípedos das células endoteliais em uma monocamada confluente típica de sangue do cordão umbilical derivado de e CFCs. Esta imagem mostra a morfologia típica da forma do fuso das MSCs derivadas da medula óssea humana. Após uma semana de incubação no hospedeiro do camundongo, o implante marcado por uma linha tracejada amarela parecia muito diferente dos tecidos do hospedeiro em maior ampliação.
Múltiplos microvasos foram revelados, suas estruturas luminais contendo glóbulos vermelhos e são destacados pelas pontas de setas amarelas. Quando os plugues foram examinados imuno-histoquímicos, o lúmen dos microvasos foi reativo a um anticorpo monoclonal para DC 31 humano. Os núcleos celulares foram contra-corados com hematina.
Uma vez dominada, essa tecnologia pode ser feita em uma onça se for executada corretamente.
Visão Geral
Este artigo descreve uma metodologia para a entrega de células formadoras de colônias endotélicas derivadas de sangue de cordão humano (ECFCs) e células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSCs) incorporadas em um gel de colágeno/fibronectina em camundongos imunodeficientes. A abordagem visa gerar uma rede vascular humana que se integre à vasculatura dos camundongos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Medicina regenerativa
- Biologia vascular
Fundamentos
- Células formadoras de colônias endotélicas (ECFCs) são cruciais para a regeneração vascular.
- Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm potencial na engenharia de tecidos.
- Combinar esses tipos de células em uma matriz de gel pode melhorar a formação da rede vascular.
- Camundongos imunodeficientes servem como um modelo para estudar a integração de células humanas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método não cirúrgico para criar uma rede vascular humana in vivo.
- Avaliar a eficiência de ECFCs e MSCs na formação de microvasos.
- Avaliar a integração de células humanas com a vasculatura dos camundongos.
Métodos Utilizados
- Cultura e preparação de ECFCs e MSCs em meios específicos.
- Incorporação de células em um gel de colágeno/fibronectina para injeção.
- Injeção subcutânea em camundongos imunodeficientes anestesiados.
- Análise histológica para avaliar a formação de microvasos após implantação.
Principais Resultados
- Formação bem-sucedida de microvasos específicos de humanos nos implantes.
- O exame histológico confirmou a presença de células endoteliais humanas.
- O método provou ser simples e eficaz em comparação com a implantação cirúrgica.
- A densidade de microvasos foi quantificada, demonstrando a eficácia da abordagem.
Conclusões
- A metodologia descrita é uma alternativa viável para a engenharia de tecidos vasculares.
- Permite o estudo do comportamento de células humanas em um organismo vivo.
- Esta técnica pode avançar aplicações em medicina regenerativa.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Establishing functional human vascular networks in vivo remains a critical challenge for tissue engineering and regenerative medicine, particularly for preclinical validation of vascularized constructs. This model enables direct assessment of human endothelial behavior and network integration within a living system, supporting mechanistic de-risking of vascular therapies. By demonstrating anastomosis with host circulation, it provides predictive confidence for translational advancement of cell-based vascularization strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of human endothelial colony-forming cell functionality in vascular network formation.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo assay to validate pro-angiogenic targets using human-derived cells.
- Scientific Value: Supports de-risking of vascular targets by confirming lumen formation and host vessel anastomosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable microvessel density readouts for compound or condition screening.
- Operational Value: Standardizes vascular network formation via defined cell ratios and gel matrix for assay consistency.
- Scientific Value: Enables evaluation of human-specific vascular integration independent of species mismatch.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human vascular engraftment and stability for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of network maturation and perfusion in vivo.
- Scientific Value: Informs risk-adjusted decisions on vascularized tissue constructs prior to IND-enabling studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling early validation of vascular competence before lead optimization and preclinical safety studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on human angiogenic pathways and perivascular cell crosstalk.
- Screening: Delivers standardized, quantitative vascular network formation as a phenotypic readout.
- Analytics: Provides histological and immunohistochemical outputs to quantify human microvessel density and perfusion.
- Translational Research: Bridges in vitro angiogenesis assays to in vivo functional validation using human cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for evaluating multiple cell types, scaffolds, or therapeutics in a common vascularization assay.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vascular target validation through functional human network formation.
- Operational Value: Offers a simple, surgery-free implantation method enhancing reproducibility across sites.
- Strategic Value: Reduces late-stage vascular failure risk by confirming host integration early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions on vascularized regenerative candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell culture and sterile surgical techniques.
- Depends on access to immunodeficient mouse models and histological imaging infrastructure.
- Necessitates standardized cell preparation and gel mixing to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves optimization of cell ratios and matrix composition for different vascularization goals.
- Limited by the 7-day window for network assessment, requiring timely endpoint analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Culture of Human Cord Blood-derived Endothelial Colony-forming Cells (ECFCs) and Bone-marrow Derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)
2:51
Resuspension of Cells in Collagen/Fibronectin/Fibrinogen Solution (Day 0)
4:05
Injection into Immunodeficient Nude Mouse (Day 0)
4:51
Harvesting the Implants (Day 7) and Evaluation
5:50
Cell Morphology
6:38
Conclusion
