Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

Bem-vindo ao Raburn Lab. Eu sou Matt Korn, departamento de Neurobiologia e Comportamento da Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vamos pegar um ovo, abri-lo e colocar uma conta que foi embebida em fator de crescimento.

A maravilhosa preparação de um óvulo nos permitirá colocar um fator de crescimento para mudar o destino de vários tipos diferentes de tecidos neste estágio inicial do desenvolvimento embrionário. Dia dois e meio, ou estágio 17. Ok, então estamos aqui, no escopo aqui.

Eu tenho meus ovos e todas as minhas ferramentas. Então vá, vá em frente e puxe um ovo aqui e você pode ver onde está nossa fita. Vedação de janela.

Eu tenho esse lindo donut. É feito apenas de argila artística que você pode conseguir em uma loja de arte. E eu vou pegar um par muito ruim de cinco fórceps.

Eles existem há muito tempo. As pontas das pontas são bem maçantes, mas funcionam muito bem para levantar a fita apenas o suficiente para que a janela apareça. Eu posso colocá-los para baixo.

Vou dobrar isso e dobrar o ovo, essa janela atrás assim. Então agora eu posso colocá-lo sob o escopo, fazer qualquer tipo de manipulação. Nesse caso, vamos fazer as contas, e eu vou pegar minha tinta nanquim agora sem a tinta nanquim.

Você pode ver que há um pouco de disco embrionário aqui, e ele está um pouco para o lado. Então, se eu apenas virar o ovo, posso ver onde parte do sangue está formando um círculo aqui. E eu posso ir em frente e pegar minha agulha com a tinta nanquim.

E eu vou sair para o lado aqui, e vou passar por baixo do disco e há um embrião. Não quero colocar muito o suficiente para ver o contraste do embrião com o preto. E então eu vou girar isso para que a parte da lista do embrião fique voltada para a frente.

E o que você pode ver aqui é a região do cefalo. O tubo neural volta aqui e temos alguns somitos que nos permitem envelhecê-lo. E se eu for em frente e aumentar o zoom, podemos ver que o coração tem um batimento muito lento, mas consistente, o que é ótimo.

O coração estava lá, mas não batendo. Teríamos que estar um pouco preocupados se esta era ou não uma amostra vital. Então, como não há uma membrana realmente espessa sobre ela, posso simplesmente ir para minha sonda de tungstênio aqui.

Eu, e há uma membrana fina, e vou me afastar aqui para poder acessar o embrião. Colocamos contas, no prosencéfalo e no cérebro posterior. E este, eu vou para o prosencéfalo.

Agora, para chegar a ele, tenho que cortar uma membrana. Agora, quando eles são mais jovens, posso simplesmente usar uma sonda de tungstênio e entrar pelo tubo neural e terei acesso à região onde quero colocar o cordão. E agora vou prosseguir para minha sonda de tungstênio.

E estou usando as duas mãos apenas para firmar minha mão. Vou manobrar o embrião. Então, uma vez que eu coloco a conta aqui, posso colocá-la diretamente no tubo neural e até o prosencéfalo.

Ok, agora que tenho o embrião aberto, posso ir em frente e prepará-lo e colocar a conta. Então, o que vou fazer é enfiar minha sonda um pouco mais fundo e abrir o tubo neural, o que você pode ver que eu fiz lá. Vou dar um zoom um pouco mais perto.

Eu apenas mudo meu foco um pouco aqui. E você pode ver que há uma pequena abertura lá, mas eu realmente não coloquei um buraco acima de onde está o céfalo caudal, e isso é porque onde a conta vai está lá. Portanto, não quero um buraco onde a conta possa flutuar.

Eu quero um pouco de volta, para que eu possa colocar a conta e empurrá-la para frente. Então agora eu vou pegar uma conta. Você pode ver que há muitos tamanhos diferentes.

Estes são acrílicos de heparina, eles estão em PBS. Vou pegar um par de 55 pinças. Você pode ver que eu vou entrar no PBS e vou encontrar um que eu goste.

E uma vez que está fora do PBS, geralmente gruda na pinça lá, pode vê-la lá. Vá em frente e cubra as contas. Traga meu ovo de volta.

Vou colocar o ovo em foco. Então, vou trazer uma conta no fórceps 55. É um pouco mais alto no fórceps que eu gosto, mas aí está.

E eu vou meio que guiá-lo até onde fiz aquele buraco no tubo neural. Uma vez que eu o coloco no tubo neural, torna-se fácil manipulá-lo para a frente do cérebro em desenvolvimento. Então, vou pegar minha sonda de tungstênio, basta empurrá-la.

Ao colocar a conta no céfalo, é preciso ter cuidado porque o que vai acontecer é que, à medida que o embrião envelhece, ele começa a se curvar para frente e depois para o lado. E muitas vezes o que acontece é que quando você está colocando uma conta no prosencéfalo dizendo ao Cephalon, ela cairá em direção ao bico porque o bico se forma na porção ventral do embrião, onde o cérebro está na região dorsal. Mas isso parece muito bom.

Estou bastante satisfeito com isso. Vou seguir em frente, pegar uma pipeta com 10 microlitros de PBS estéril e vou colocar algumas gotas aqui. Ok, então agora podemos ir em frente e fechar o ovo.

E o que vou fazer é trazer a janela para cá, para cima e para cima, e o ovo ainda não está selado. Então, o que eu quero fazer, para que não seque, é pegar um pouco dessa fita plástica que estamos usando e cortar um pedaço. É mais ou menos do tamanho, apenas um pouco maior que a janela.

E eu vou esticá-lo um pouco, e vou colocá-lo bem sobre a janela aqui e ter certeza de que está bonito e confortável. Portanto, qualquer um dos furos que fizemos, seja ao drenar a albumina ou cortar a janela, eles são selados. Então agora o ovo está selado, não pode perder nada do umin, não vai secar.

Deve ser capaz de envelhecer normalmente. Então é isso para a colocação de contas. Boa sorte com seus experimentos com pintinhos e espero que você tenha recebido os resultados que deseja.