Name: Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a colocar beads revestidos com fator de crescimento em embriões de galinha no estágio E2.5 usando preparação in ovo. Este método permite investigar como fatores de crescimento influenciam o destino celular durante o desenvolvimento embrionário.

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1. Retire os ovos da incubadora Na E2-2.5 (~ 17 St. HH), retire os ovos e prepará-los adequadamente. Eles podem ser trabalhadas imediatamente ou voltou para a incubadora por algumas horas. Os ovos podem ser colocados em temperatura ambiente com segurança por mais de uma hora. Os ovos podem ficar de fora para a duração das manipulações. Às vezes, estes podem levar uma hora ou mais. Nota: Quanto mais tempo eles ficam em temperatura ambiente, menos provável é que eles são para sobreviver. 2. Preparação de nanquim <ol><li> Prepare uma nova solução de 4% de tinta Índia em PBS estéril. </li><li> Encher uma seringa de 3 mL com a solução. </li><li> Coloque uma agulha calibre 27 ½ polegada, na seringa. </li><li> Usando um par de hemostats, dobre a agulha a um ângulo de 90 °. </li></ol> 3. Abrindo os ovos e injeção de nanquim <ol><li> Usando um par de fórceps, descascar a fita e abrir a janela, prendendo-o usando o verso da fita na parte de trás do ovo. </li><li> Guia na agulha em ângulo até que se encontra logo abaixo do embrião. Colocar a agulha sob a disco flutuante assegura que a tinta, que é tóxico para o embrião, não entram em contacto directo. </li><li> Você precisa apenas injetar tinta suficiente para criar um contraste confortável. Este é normalmente inferior a ¼ mL. </li></ol> 4. Abertura do tubo neural <ol><li> Pegue uma tesoura de dissecção fina e cortar a fina membrana que fica na parte superior, ou às vezes por aí, o embrião. </li><li> Pegue um par de 55 fórceps ou uma sonda de tungstênio e abrir o tubo neural de posterior para anterior. Certifique-se que a abertura é grande o suficiente para colocar um cordão para ele. </li></ol> Nota: Dependendo da idade, uma sonda de tungstênio fino pode ser usado para fazer a mesma coisa. 5. Recuperando um revestimento de heparina em acrílico talão <ol><li> Usando um par de fórceps 55, encontrar uma pérola intacta na solução. Deixe o talão juntar-se para a ponta, lentamente fechar a fórceps. </li><li> Remover o talão da solução e trazê-lo mais em cima do ovo. </li><li> Uma vez que o cordão está fora de sua solução, ela provavelmente não vai sair até que tenha sido colocado no albumina. </li></ol> 6. Colocar o talão <ol><li> Uma vez que o talão tenha sido colocada em cima da área-alvo, use uma sonda de tungstênio para guiá-la para o cérebro anterior ou corrigi-lo no rombencéfalo. </li><li> Adicione algumas gotas de PBS com uma pipeta de 10 mL. </li></ol> 7. Fechando o ovo <ol><li> Feche o ovo usando o pedaço fino de fita para fechar a janela. </li><li> Selo do ovo de acordo com o protocolo preparando, disponível em <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Dependendo da proteína que você deseja utilizar, existem diferentes protocolos sobre como preparar as contas. Nesses experimentos, usamos heparina em acrílico contas, mas Affi-gel contas também pode ser usado. Descobrimos que as contas heparina em acrílico são mais fáceis de manipular no ambiente aquoso do ovo albumina. Grânulos são embebidos em 5 l de proteína durante a noite a 4 ° C. Esferas de controlo são colocados em PBS estéril até o momento da colocação. A vantagem de usar um ovo na preparação é que o embrião ainda está vivo e livre ...

<table><tbody><tr><td>Ovos</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Fertilizados, E2-2,5 (~ Est. 17 HH)</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinta da Índia</td><td>Ferramenta</td><td>Higgins</td><td></td><td>Preparar uma solução a 4% em PBS estéril.</td></tr><tr><td>PBS estéril</td><td></td><td></td><td></td><td>Alternativamente, pode-se usar um coquetel de anticorpos</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas 27G 1/2</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>Inclinadas a 90 graus</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>tamanho 55</td></tr><tr><td>Hemostatos</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8,5 cm</td></tr><tr><td>Fita de Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td>para selar ovos</td></tr><tr><td>Probeta de tungstênio</td><td>Ferramenta</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Ferramenta #24. Cabo opcional.</td></tr></tbody></table>

fator de crescimento colocando-revestido beads em embriões de galinha early stage

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

O tubo neural expressa em muitas proteínas específicas padrões espaço-temporais durante o desenvolvimento. Essas proteínas foram mostrados para ser crítico para a determinação de célula destino, migração celular e formação de circuitos neurais. Indução neuronal e padronização envolvem proteína morfogenética óssea (BMP), sonic hedgehog (SHH), fator de crescimento fibroblástico (FGF), entre outros. Em particular, o padrão de expressão de Fgf8 está em estreita proximidade com regiões expressar BMP4 e SHH. Este padrão de expressão é consistente com interações de desenvolvimento que facilitam a padronização no telencéfalo. Aqui nós fornecemos uma demonstração visual de um método em que um ovo em preparação pode ser usado para testar os efeitos de fgfs na formação do cérebro anterior. Grânulos são revestidos com proteína e colocado no tubo neural em desenvolvimento para oferecer a exposição sustentado. Porque o procedimento utiliza pequenas, miçangas cuidadosamente colocados, é minimamente invasivo e permite várias contas para ser colocado dentro de um único tubo neural. Além disso, o método permite o desenvolvimento contínuo de modo que os embriões podem ser analisados ​​em um estágio mais maduro para detectar alterações na anatomia e na padronização neural. Este protocolo simples, mas útil permite a visualização em tempo real. Ele fornece um meio de fazer mudanças espacialmente e temporalmente limitado a níveis de proteína endógena.

Uma variedade de fatores de crescimento e proteínas interagem para induzir as células a assumir os destinos diferentes de células durante o desenvolvimento. Aqui mostramos o uso de um ovo na preparação para enfrentar as possíveis interações entre diferentes proteínas no desenvolvimento, colocando contas em e2.5 embriões de galinha.

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

O tubo neural expressa diversas proteínas em padrões espaciotemporais específicos durante o desenvolvimento. Demonstrou-se que essas proteínas são críticas para a célula...

Bem-vindo ao Laboratório Raburn. Sou Matt Korn, do departamento de Neurobiologia e Comportamento da Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vamos pegar um ovo, abri-lo e colocar uma esfera que foi imersa em fator de crescimento.O maravilhoso preparo de um ovo permitirá que coloquemos um fator de crescimento para alterar o destino de diversos tipos de tecidos nesta fase inicial do desenvolvimento embrionário. Dia dois e meio, ou estágio 17. Ok, então estamos aqui, no microscópio.Eu tenho meus ovos e todas as minhas ferramentas. Então, vá em frente e pegue um ovo aqui; você pode ver onde está a nossa fita. Vedação de janela.Tenho este simpático donut pequeno. Ele é feito apenas de argila artística que você pode encontrar em uma loja de artes. E vou pegar um par realmente ruim de pinças de cinco forças.Esses existem há muito tempo. As pontas são bastante rombas, mas funcionam muito bem para levantar a fita o suficiente para que a janela apareça. Posso colocá-los ali.Vou apenas dobrar isso e acomodar o ovo, esta janela por trás, assim. Agora posso colocá-lo sob o microscópio e fazer qualquer tipo de manipulação. Neste caso, vamos usar as esferas, e vou adiante e pegar minha tinta da Índia agora, sem a tinta da Índia.Dá para ver que há um pequeno disco embrionário bem aqui, um pouco deslocado para o lado. Então, se eu virar o ovo, consigo observar onde parte do sangue está formando um círculo aqui. E posso seguir em frente e pegar minha agulha com a tinta nanquim.E eu vou apenas sair um pouco para o lado aqui, e vou passar por baixo do disco, onde há um embrião. Não quero colocar luz em excesso, apenas o suficiente para ver o contraste do embrião contra o fundo preto. Em seguida, vou simplesmente girar isso para que a parte dorsal do embrião fique voltada para a frente.E o que você pode ver aqui é a região cefálica. O tubo neural retorna para cá e temos alguns somitos que nos permitem determinar sua idade. E se eu avançar e aumentar o zoom, podemos observar que o coração apresenta uma pulsação muito lenta, mas constante, o que é excelente.O coração estava ali, mas não batendo. Teríamos que ficar um pouco preocupados com a questão de saber se esta era ou não uma amostra viável. Então, como não há uma membrana espessa real sobre ele, posso prosseguir diretamente com minha sonda de tungstênio aqui.Eu, e há uma membrana fina, e vou apenas afastar isso aqui para poder acessar o embrião. Colocamos esferas na região do prosencéfalo, bem como na região do rombencéfalo. E nesta, vou direcionar-me para o prosencéfalo.Agora, para alcançá-lo, preciso cortar uma membrana. Quando os espécimes são mais jovens, posso usar simplesmente uma sonda de tungstênio e penetrar pelo tubo neural, obtendo acesso à região onde desejo colocar a esfera. Agora vou prosseguir com minha sonda de tungstênio.E estou usando as duas mãos apenas para firmar a minha mão. Vou prosseguir e manipular o embrião. Assim que colocar a esfera aqui, posso posicioná-la diretamente no tubo neural e até o prosencéfalo.Ok, agora que abri o embrião, posso prosseguir com o preparo e posicionar a esfera. O que farei é inserir minha sonda um pouco mais profundamente e abrir o tubo neural, como é possível ver aqui. Vou aumentar um pouco mais o zoom.Eu apenas mudei um pouco o foco aqui. E você pode ver que há uma pequena abertura bem definida, mas eu ainda não fiz um orifício acima da região onde está o cefalotórax da cauda, e isso porque é exatamente aí que a conta será colocada. Por isso, não quero um orifício onde a conta possa sair flutuando.Quero que fique um pouco para trás, para que eu possa colocar a conta e empurrá-la para a frente. Agora vou pegar uma conta. Você pode ver que há vários tamanhos diferentes.Esses são de acrílico com heparina, estão em PBS. Vou pegar um par de pinças de 55. Vocês podem ver que vou inserir no PBS e apenas escolher um que eu goste.E uma vez fora do PBS, geralmente adere à pinça ali, dá para vê-lo aí. Prossiga e cubra as esferas. Traga meu ovo de volta.Vou colocar o ovo em foco. Então, vou adiante e trazer a conta com a pinça de 55. Está um pouco mais alta na pinça do que eu gostaria, mas é isso aí.E eu vou apenas guiá-lo até o local onde fiz esse orifício no tubo neural. Uma vez que o introduzo no tubo neural, torna-se fácil manipulá-lo em direção à parte anterior do cérebro em desenvolvimento. Então, vou pegar meu bastão de tungstênio e simplesmente empurrá-lo.Ao posicionar o grânulo no cefalão, é preciso ter cuidado, pois à medida que o embrião envelhece, ele começa a dobrar para frente e depois para o lado. Muitas vezes, ao colocar um grânulo no cérebro anterior, indicando o cefalão, ele acaba caindo em direção ao bico, porque o bico se forma na porção ventral do embrião, enquanto o cérebro está na região dorsal. Mas isso parece estar bastante bom.Estou bastante satisfeito com isso. Vou em frente, pegar uma pipeta com 10 microlitros de PBS estéril e vou colocar algumas gotas aqui. Ok, agora podemos prosseguir e fechar o ovo.E o que vou fazer é apenas levantar a janela aqui para cima, para cima e para fora, e o ovo ainda não está selado. Então, o que quero fazer, para que não resseque, é pegar um pouco dessa fita plástica que temos usado e cortar um pedaço. É do tamanho, apenas um pouco maior que a janela.E vou esticá-lo um pouco, e vou colocá-lo bem sobre a janela aqui e garantir que fique bem firme. Assim, todos os orifícios que fizemos, seja ao drenar a albumina ou ao cortar a janela, ficam selados. Agora o ovo está selado, não pode perder nenhum dos líquidos, e não irá secar.Deve ser capaz de envelhecer normalmente. Assim, é isso quanto ao posicionamento das esferas. Boa sorte com seus experimentos com pintinhos, e espero que você obtenha os resultados desejados.

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra dois métodos para a preparação e colocação de contas, que foram revestidas com fator de crescimento, em explantes do córtex cerebral em desenvolvimento. Essas esferas podem ser usados ​​para induzir a expressão do gene espacialmente restrita no desenvolvimento do tecido neural, tais como explantes prosencéfalo. Métodos são dadas para a utilização de ambos os Affi-Gel miçangas e contas de heparina acryllic.

Fator-Revestido crescimento Placement Bead em explantes Encéfalo anterior Dorsal

Este vídeo demonstra nova cultura, um método pelo qual embriões de galinha são cultivadas fora do ovo por até 24 horas. Este método permite o estudo do desenvolvimento inicial (linha primitiva para 14 som.), Um período correspondente ao E7-9 no mouse. Aplicações desta técnica incluem eletroporação, hibridização in situ e imunohistoquímica.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

Este artigo descreve a rotulagem de superfície...

Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

Uma abordagem para análise da migração e destino final dos aviários células da crista neural em codornas de-bico embriões quiméricos é descrito. Este método é uma técnica simples e direta para rastrear células da crista neural durante a migração e diferenciação que são de outra maneira difícil distinguir dentro de um embrião de galinha não-manipulado.

Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

Visualizar e acessar o embrião de galinha durante o desenvolvimento pode ser um desafio. Desenvolvemos um método ex ovo que é simples, econômico e pode ser facilmente usado em sala de aula ou ambiente de pesquisa. Este método fornece acesso ao embrião em estágios finais do desenvolvimento embrionário (HH 40).

Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Aqui relatamos rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos usando enxerto de intraespécie do tubo neuralGFP combinado com injeção intra-vascular diI. Esta técnica experimental nos permite visualizar e estudar simultaneamente o desenvolvimento do sistema nervoso derivado do NCC (entérico) e do sistema vascular, durante a organogênese.

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

Ao enxertar grânulos embebidos em fatores de crescimento ou inibidores específicos de vias de sinalização em embriões em desenvolvimento, é possível testar diretamente seus efeitos in vivo. Neste protocolo, grânulos são enxertados no broto do membro para determinar os efeitos dessas moléculas na expressão gênica e na transdução de sinal.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Protocolos que usam barreiras impermeáveis para bloquear eventos de indução entre os tecidos do eixo e flanco do corpo principal no embrião de galinha necessários para a formação do membro são descritos. Grânulos embebidos em sinais indutivos candidatos são usados para superar o efeito da colocação da barreira e a análise da expressão gênica confirma isso.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Aqui, apresentamos uma nova técnica para cultivar embriões de galinha ex ovo para imagens de lapso de tempo usando luz transmitida e microscopia de fluorescência. O sanduíche de papel de filtro submerso é uma variante da técnica de suporte de papel de filtrobem estabelecida 1 que permite a cultura de embriões de pintinhos totalmente submersos em um meio de cultura líquido.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo Ex Ovo Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Neste método, tecidos embrionários cardíacos são cirurgicamente microdissected, dissociado, fluorescente etiquetado e implantou em tecidos embrionários de anfitrião. Isto fornece uma plataforma para estudar a organização do desenvolvimento nível individual ou tecido sob condições hemodinâmicas gravidez ectópica, e/ou alterados parácrina/justácrina ambientes.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

O ensaio de contas encharcada envolve a entrega direcionada de reagente de teste em qualquer ponto de desenvolvimento para estudar a regulação da diferenciação celular e morfogênese. Um protocolo detalhado, aplicável a qualquer modelo animal experimental, para preparar três tipos diferentes de contas encharcadas e implantá-las no interdigit de um embrião de frango é apresentado.

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

Aprenda a colocar beads revestidos com fator de crescimento em embriões de galinha no estágio E2.5 usando preparação in ovo. Este método permite investigar como fatores de crescimento influenciam o destino celular durante o desenvolvimento embrionário.

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

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