Rat Assay Angiogenesis Mesentery

Bem-vindo ao Departamento de Patologia do Hospital Universitário GaN, em Guttenburg, Suécia. Sou o Dr. Klaus Norby, e o método que você está prestes a ver foi desenvolvido no meu laboratório. A angiogênese clinicamente relevante, que ocorre em conexão com hipóxia, tumores sólidos ou qualquer outra doença angiogênica, acontece quase exclusivamente em tecidos nativamente vascularizados. Em pequenos roedores adultos, o mesentério, que conecta o intestino delgado à parede posterior do corpo, contém diversas partes finas e membranosas. Em ratos, existem cerca de 40 a 50 dessas janelas mesentéricas. Elas são virtualmente transparentes e, portanto, semelhantes a janelas à vista desarmada, sendo cada janela cercada por tecido adiposo em ratos machos adultos.

As janelas mesentéricas são naturalmente vascularizadas e não apresentam angiogênese fisiológica mensurável. Elas, portanto, oferecem uma oportunidade para estudar a angiogênese de novo em tecido mamífero adulto naturalmente vascularizado. Isto é, a iniciação de uma resposta angiogênica completa do zero, superando os inibidores de angiogênese que atuam endogenamente no tecido testado, como em todos os tecidos normais em camundongos, os microvasos nativos que podem atuar como microvasos parentais estão ausentes em muitas janelas, o que infelizmente torna o ensaio imprevisível em camundongos na forma nativa.

As janelas mesentéricas em ratos normalmente contêm um número relativamente pequeno de pequenos vasos sanguíneos localizados na periferia em ratos adultos. Essas janelas mesentéricas têm naturalmente entre cinco e dez micrômetros de espessura. Isso permite que o tecido intacto seja espalhado sobre lâminas e observado microscopicamente, possibilitando assim a visualização de todos os vasos em cada janela e conferindo aos vasos uma extensão essencialmente bidimensional.

O método oferece uma oportunidade sem igual para realizar medições quantitativas da extensão espacial, densidade, formação de padrões e tamanho dos microvasos sanguíneos. O sítio subcutâneo é popular para estudos de angiogênese; no entanto, devido à heterogeneidade das células endoteliais e às propriedades específicas dos tecidos, o controle da angiogênese em tecidos subcutâneos e tumores em crescimento subcutâneo pode não prever o controle da angiogênese em órgãos viscerais metastáticos, como pulmão, fígado, osso e cérebro. Isso é notável, pois as metástases viscerais geralmente são as responsáveis, em última instância, pela letalidade do câncer.

O fato de a janela mesentérica ser visceral deve ser vantajoso neste aspecto. O objetivo do nosso projeto é estudar quantitativamente aspectos da angiogênese de novo. Portanto, injetamos um fator pró-angiogênico estabelecido ou uma substância em teste por via intraperitoneal.

Nós normalmente injetamos cinco mililitros de cada vez em ratos adultos não anestesiados. Um volume desse tipo expõe rapidamente todo o mesentério ao líquido injetado. Qualquer solução injetada por via intraperitoneal, desde que seu volume não seja diminuto, deve afetar todas as células no tecido analisado, especialmente porque a camada mesotelial de células que reveste a janela mesentérica extremamente fina é altamente permeável a solutos; como nenhum procedimento cirúrgico é necessário, a angiogênese a ser estudada na janela mesentérica não é afetada pela angiogênese induzida pela cicatrização de feridas, portanto, o tratamento angiogênico é administrado na forma de injeções intraperitoneais.

Por razões práticas, utilizamos um protocolo de tratamento composto por duas injeções diárias durante um período de cinco dias, da manhã de segunda-feira à manhã de sexta-feira, como padrão ao estudar os efeitos angiogênicos de proteínas definidas, tais como VEGF 1 65, 1 64 e FGF básico, por exemplo. Normalmente, utiliza-se a solução de infusão Pharmacia como veículo. O número de tratamentos pode parecer elevado, mas demonstrou-se que nem sempre é possível induzir angiogênese estatisticamente significativa, mesmo ao usar fatores pró-angiogênicos tão potentes quanto VEGF e FGF básico quando administrados em níveis aproximadamente fisiológicos em uma única dose ou em poucas doses espaçadas; deve-se lembrar que potentes inibidores endógenos de angiogênese atuam no tecido.

A administração de modalidades terapêuticas moduladoras da angiogênese imita uma situação terapêutica clínica. Um ou mais fatores moduladores da angiogênese podem ser administrados por via sistêmica, subcutânea, intravenosa ou oral. Por exemplo.

Isso simula uma situação de tratamento clínico, pois permite estudar o efeito não apenas da molécula original, mas também de seus metabólitos. O sistema permite certo grau de controle sobre os efeitos tóxicos de agentes moduladores da angiogênese administrados sistemicamente. Como ratos adultos crescem fisiologicamente e podem aumentar seu peso em cerca de 40% durante um experimento com duração de duas ou três semanas, é possível, mediante pesagem dos animais, avaliar o grau em que o tratamento retardou o aumento do peso corporal, o que pode ser considerado uma expressão dos efeitos tóxicos.

Isso permite evitar doses tóxicas de substâncias testadas que modulam a angiogênese. Um benefício importante, pois pode ser impossível interpretar os resultados em termos de efeitos antiangiogênicos específicos. Se um efeito tóxico estiver envolvido, como as ratas adultas crescem consideravelmente mais rápido que os camundongos adultos, o efeito de agentes tóxicos sobre o ganho de peso corporal deve ser um indicador mais sensível de efeitos tóxicos gerais em ratas do que em camundongos.

Agora gostaríamos de mostrar como são confeccionados os espécimes de janela mesentérica. Esses animais foram mortos utilizando CO2. As janelas mesentéricas são espalhadas sobre lâminas comuns de 3 por 1 polegada, iniciando distalmente no mesentério.

A angiogênese não pode ser observada a olho nu na janela mesentérica, começando pela válvula íleo-cecal e movendo-se em direção retrógrada. As quatro janelas coletadas da parte mais distal do mesentério são utilizadas. O espécime sobre a lâmina é seco à temperatura ambiente por 20 minutos.

O coto intestinal é removido. Os espécimes são então mantidos em um congelador a menos 20 graus centígrados. Dessa forma, os espécimes podem ser conservados por vários meses, talvez até anos, sem deterioração acentuada na qualidade.

A coloração é realizada utilizando um anticorpo monoclonal contra o endotélio de rato; deixe o espécime secar ao ar, não monte com lamínula. A quantificação dos incidentes de vasos sanguíneos em janelas mesentéricas individuais é feita por meio de microscopia morfométrica auxiliada por computador, utilizando um microscópio de desenho com aumento óptico total entre 14 e 34. Toda a janela mesentérica é visualizada.

O aumento é escolhido em passos fixos para que a maior parte possível do campo de visão seja coberta pelo espécime. Toda a área da janela é facilmente delimitada, pois a borda entre a janela e o tecido adiposo circundante é nítida. Todas as partes vascularizadas são então desenhadas de acordo com critérios cuidadosamente definidos.

Até os menores vasos sanguíneos recém-formados, cujo diâmetro em aumentos maiores foi encontrado em torno de 2,5 a 3,0 micrômetros, podem ser claramente discernidos. O fato de que o diâmetro médio do eritrócito de rato é igual ou maior que 6,3 micrômetros demonstra o quão pequenos são esses vasos. A área de todas as partes vascularizadas em uma janela, expressa como porcentagem da área total da janela, é conhecida como área vascularizada relativa va.

É, para todos os efeitos, uma medida da extensão espacial dos vasos, já que esses possuem essencialmente uma extensão bidimensional, podendo a AV ser facilmente medida por meio de telemetria assistida por computador, por exemplo. O próximo passo envolve o registro da densidade dos microvasos e da formação de padrões em três partes centrais das áreas vascularizadas de cada janela. Essas partes são escolhidas aleatoriamente de forma sistemática com um aumento óptico de 80.

Cada vaso é visualizado como uma única linha utilizando um microscópio de desenho. A imagem de cada campo de visão é transferida para uma imagem digitalizada e para um analisador de imagens, e cada vaso na imagem digitalizada é então reduzido a uma espessura de um único pixel. O equipamento então mede o número de pixels, que representa os vasos e é expresso como uma fração de todos os pixels no campo de visão.

Este valor percentual, o comprimento microvascular ou MVL, representa o comprimento dos microvasos em cada unidade da área vascularizada e é uma medida composta da densidade dos microvasos. Multiplicando-se a média de VA de quatro janelas por animal pela média de MVL do grupo de tratamento correspondente, calcula-se o comprimento total dos microvasos por animal, o TMVL. Desenvolvemos ainda técnicas para análise quantitativa detalhada da densidade e composição dos microvasos por meio de análise de imagem.

Esses incluem a medição da distância real entre dois microvasos sucessivos, pontos de ramificação, IE, o comprimento de microvasos individuais, segmentos LEMS, o número de microvasos, segmentos por unidade de volume tecidual, NOMS, e o número de pontos de ramificação de microvasos por unidade de volume tecidual. NOBP. O grau de tortuosidade nos microvasos MVT é dado pela diferença entre a distância mais curta e a distância real entre dois pontos de ramificação sucessivos, pela ocorrência de cruzamento de microvasos sobre o índice de interseção INIS e pela formação de alças interconectadas. O índice de formação de alças INLF também pode ser medido com precisão usando técnicas semelhantes na periferia da rede de microvasos.

Também é possível quantificar variáveis correspondentes para brotos, incluindo o comprimento dos brotos, LESP, e o número de brotos por unidade de volume tecidual, NOSP, planejando experimentos, pois podem existir diferenças significativas entre animais no mesmo grupo de tratamento e até entre janelas mesentéricas de um mesmo animal. Verificamos que o seguinte delineamento pode ser prático: o número de animais por grupo de tratamento durante o período de observação, de oito a 12; o número de janelas por animal que são analisadas em termos de VA; o número de campos de visão para cada janela que são analisados em termos de comprimento microvascular, MVL; comprimento dos microvasos, segmentos, LEMS; número de segmentos microvasculares, NOMS; número de pontos de bifurcação dos microvasos, NOBP; tortuosidade do microvaso, MVT; índice de interseção, I; índice de formação de alças, INF. Três animais tratados com veículo são utilizados como controles. O ensaio de angiogênese em janela mesentérica é particularmente adequado para estudos de efeito dose-resposta e para análises cinéticas da angiogênese.

Isso pode ser feito tratando grupos de animais com diferentes doses de fator pró-angiogênico e sacrificando esses animais em diferentes momentos durante a resposta angiogênica. A fase expansiva, o pico e a subsequente fase angiorregressiva podem assim ser discernidas em termos quantitativos. Estudos desse tipo revelaram que a resposta angiogênica de novo a qualquer citocina fator de crescimento testada é especificamente dependente da dose em termos de velocidade, potência e duração.

Além disso, o padrão dos novos vasos em termos de extensão espacial e alterações nos microvasos, densidade, é frequentemente nitidamente dependente da dose e do tempo, em comparação com a angiogênese mediada por VEGF ou FGF básico em doses aproximadamente fisiológicas. A angiogênese mediada por mastócitos, MCMA induzida por ativação seletiva de mastócitos in situ, apresenta potência consideravelmente maior e duração notavelmente mais longa. Na verdade, a angiogênese mediada por mastócitos foi descrita pela primeira vez utilizando este ensaio, devido à capacidade de quantificar variáveis objetivas de angiogênese, ao alto grau de relevância biológica do sistema e à possibilidade de verificar efeitos tóxicos do tratamento.

A metodologia é especialmente adequada para análises de estrutura-atividade e resposta à dose. O MWAA em ratos apresenta um modelo para o estudo da angiogênese em um tecido visceral vascularizado nativamente em animais adultos, que não apresenta angiogênese fisiológica e não é afetado por cirurgia, excluindo assim qualquer influência da angiogênese induzida por cicatrização de feridas. O ensaio é verdadeiramente quantitativo e avalia com precisão diversas variáveis objetivas biologicamente relevantes que descrevem a extensão espacial, densidade e formação de padrões dos microvasos.

O ensaio é muito adequado para estudar os efeitos sistêmicos da angiogênese, fatores moduladores e para estudos de estrutura-atividade e resposta à dose. A metodologia descrita aqui foi desenvolvida no laboratório do Dr. Kloss Carl Norby, no Departamento de Patologia, Hospital Universitário Reka, Universidade Jute Borg Gotemburgo, na Suécia. Todos os estudos deste projeto foram apoiados pelo Conselho Sueco de Pesquisa Médica, número do projeto 5 9 4 2.

Agradecemos o habilidoso auxílio técnico da Sra. Gun Effer, envolvida desde o início do projeto, da Sra. Monica Anderson, ausente, e da Sra. Ann Nemar Lindgren.

Espero que esta breve apresentação tenha lhe dado uma ideia do potencial do ensaio. Se você utilizar este ensaio em seu laboratório, ficarei feliz em ajudá-lo caso encontre algum problema técnico. Além disso, agradeceria muito qualquer sugestão que você possa ter.

Obrigado.