Name: Rat Assay Angiogenesis Mesentery (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Aprenda a estudar angiogênese de novo em tecido vascularizado nativo usando janelas mesentéricas de ratos. Este método permite análise quantitativa da extensão espacial e densidade de microvasos sanguíneos.

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Apoio financeiro para a maioria dos estudos foi fornecido pelo sueco Medical Research Council (concessão 5942).

1. Animais <ol><li> Pequenos roedores, como ratos, ratos e cobaias, foram utilizados como modelos animais. Infelizmente, os ratos adultos (muitas linhagens de camundongos foram avaliados) tendem a falta ou ter apenas um número muito baixo de potencial de pais microvasos (a partir do qual a angiogênese pode originar) dentro de suas janelas mesentérica, que faz estudos com ratos não-confiáveis. Portanto, o ensaio foi desenvolvido principalmente para ratos. </li><li> Os ratos, que são aclimatadas a um ambiente padrão para pelo menos 7 dias após a entrega do criador, são geralmente alojados em pares em uma gaiola com um padrão de 12 horas de ciclo claro / escuro, com livre acesso à água e pelotas. Cada animal é marcado. Usamos principalmente ratos adultos jovens (normalmente 7-10 semanas de idade de várias cepas, mas geralmente do sexo masculino Sprague-Dawley; em ratos com idade inferior a 5-6 semanas de idade o número de microvasos nativos tendem a ser baixas) obtido a partir de criadores diversos. No período anterior ao experimento e durante todo o experimento, os animais são pesados ​​a cada segundo dia, e sempre no dia do sacrifício. Quando os animais são tratados concomitantemente ip (para indução de angiogênese, veja abaixo) e sc ou iv ou po, eles são pesados ​​a cada dia. Isto permite a criação de grupos experimentais e controle do peso corporal igual no início do experimento, e permite o monitoramento da influência do tratamento sobre o corpo-ganho de peso durante o curso do experimento. Desde ratos machos adultos crescer robustamente fisiologicamente (ganhando cerca de 40-60 g por semana, dependendo do tipo de tensão), ganho de peso retardo é um marcador substituto sensíveis de toxicidade sistêmica, bem-estar, anorexia, e falha prosperar. </li></ol> Nós trabalhamos em uma instituição de cuidados de alto padrão animal e esforços consideráveis ​​são feitos para minimizar os níveis de estresse vivida pelos animais. As diretrizes atuais éticos são aqueles estabelecidos pela Workman P. et al. (Diretrizes para o bem-estar e uso de animais na pesquisa do câncer. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). O Animal Comitê de Ética da Universidade de Gotemburgo aprovou esses estudos. 2. Pró-angiogênicos tratamento intraperitoneal <ol><li> O candidato fator pró-angiogênico a ser testada é dissolvido e diluído no endotoxina livre de soro fisiológico utilizado para infusão de pacientes (mesmo em níveis extremamente baixos, endotoxina é pró-angiogênicos). Todas as soluções são compostas recentemente no dia da injeção, estéril, filtrada (Millipore 0,22 mM-filtração), marcada para pH neutro (7,1-7,3), e usado em temperatura ambiente. O agente de teste é injetado em concentrações baixas ou muito baixas. Por exemplo, rato rVEGF 164 (564-RV/CF; R &amp; D Systems Europe, Ltd., Oxon, Reino Unido), que é o VEGF-A isoforma predominante em ratos, é diluído a 96 pmole / ml em solução salina livre de endotoxina, congelados e descongelado e um volume de 5 ml é injetada ip em ratos. Usamos uma seringa de 5 ml com 0,8 mm-agulha (agulha verde, 21G) para a injeção ip. Este tratamento, administrado duas vezes por dia durante 4,5 dias, ie., De segunda-feira de manhã (Dia 0) a sexta-feira pela manhã (dia 4), ​​induz uma resposta robusta sprouting angiogênese no tecido de teste mesentérica, com pico em torno de dia 21. Administrando o ip solução garante que todo o volume é entregue para a cavidade peritoneal (e não para o intestino, bexiga ou qualquer outro órgão). A injeção rápida de 5 ml permite a confirmação tátil pelo operador que o jato de fluido passou através da parede abdominal para a cavidade abdominal. Seguinte, antes ou concomitantemente com o tratamento pró-angiogênico ip, qualquer agente de teste de escolha podem ser administrados por via sistémica. </li></ol> 3. Administrando sistêmico da angiogênese modulador agentes <ol><li> Qualquer outra via que o ip route pode ser usado, pois o tratamento ip pode afetar a reação em curso angiogênica através da indução da inflamação ou, possivelmente, pela ativação de mastócitos no tecido de teste, que pode levar a uma resposta pró-angiogênico forte. Além de administração oral ou injeção única sc ou iv, muitas vezes usamos sc administração usando minipumps osmótica (um ou mais, com vários volumes e bombeamento vezes) para entregar a solução a uma taxa constante por até duas ou várias semanas. </li><li> Perfusão subcutânea contínua de agentes de teste Enchimento e implantação de minipumps osmótica Normalmente no dia 5, ou seja, um dia após o término do tratamento VEGF ip, minipumps osmótico (por exemplo, Modelo 2ML2, com taxa de bombeamento constante de 5,0 mL / h para 14-15 dias; Alzet Bombas osmótica, Mountain View, CA , EUA) são preenchidos em condições estéreis com o agente de teste ou o veículo apropriado. Após armazenamento em estéril 0,9% (w / v) NaCl durante a noite a 37 ° C, a bomba (s) são implantados cirurgicamente sc nas costas (no lado da colu espinhalmn na região da escápula) de ratos que foram anestesiados com gás isoflurano (Isoba vet; Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EUA), inicialmente em uma câmara a vácuo transparente e posteriormente, através de uma máscara (para minimizar o stress causado ao animal seguinte, a câmara é lavada com ar antes de ser reutilizado). A incisão na pele feita para implantação da bomba é suturado imediatamente pós-implantação usando fio de seda. Uma vez que os animais ganho de peso fisiologicamente durante o período experimental e os agentes de teste são administrados em uma taxa constante, a dose real selecionado para um teste de drogas por kg de peso corporal é maior do que a dose média no início do período de infusão e é menor do que a dose média ao final do período de infusão. Infusão contínua, como descrito aqui, pode ser visto como uma forma estendida de tratamento metronomic. </li></ol> 4. Acabar com o Experimento <ol><li> Um animal de cada vez é colocado em uma câmara hermética transparente, que é lavada com gás CO 2, que rapidamente se mata o animal. A câmara é lavada com ar antes de ser usado novamente. </li></ol> 5. Amostras de tecido colheita <ol><li> Como mostrado no DVD, a parede abdominal é aberto, eo mesentério do intestino pequeno é identificado, incluindo a parte mais distal, que atinge a válvula íleo-cecal (a junção do intestino delgado e do intestino grosso). Quatro (ou mais) dos mais distais &quot;janelas&quot; são numeradas e espalhado objetivo padrão Superfrost não tratada Plus-slides (DAKO Dinamarca A / S, Glostrup, Dinamarca). É importante evitar, se possível, contaminando as amostras com conteúdo de sangue, tripas ou outros fluidos corporais, como esses materiais podem ser manchadas não especificamente, embora isso não invalida a visualização posterior imuno-histoquímica de microvasos. </li><li> Cada amostra janela mesentérica com o segmento do intestino pequeno é anexado espalhou em um slide e secas à temperatura ambiente por 20 minutos. Então, o coto intestinal é cortado, enquanto os espécimes intactos mesentério membranosa são armazenadas a -20 ° C por períodos prolongados. Isso é mostrado no DVD. </li></ol> Deve-se mencionar que a vasculatura de tecido e de patentes podem ser visualizadas antes da colheita com microscopia de luz transmitida intravital. 6. Protocolo para a coloração imuno-histoquímica de microvasos <ol><li> Dia 0 Os espécimes são permitidos para descongelar de -20 ° C à temperatura ambiente, secas em um armário a 60 ° C por 1 hr, e mantido à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> 1 dia Colocar as lâminas na coloração titulares slide (em cada faixa segundo) em uma tina de coloração e lavar duas vezes com TBS (pH 7,8) por 10 minutos em temperatura ambiente. A solução é descartada e substituída pela próxima solução, e assim por diante para todas as etapas a seguir. </li><li> Tratamento com tripsina Encha a tina de coloração que vai abrigar o suporte de slides coloração com solução de tripsina (25 ° C por 20 minutos). Descartar a solução e incubar duas vezes com solução de sacarose 2,5% (temperatura ambiente por 10 minutos cada tempo). Descartar a solução e lavar um par de vezes em água destilada (temperatura ambiente por alguns minutos cada). </li><li> Bloqueio Encha a tina de coloração que vai abrigar o suporte de slides coloração com 0,5% H 2 O 2 em metanol (temperatura ambiente por 30 minutos). Descartar a solução e enxágüe com água destilada (temperatura ambiente por alguns minutos). Descartar a solução e lavar duas vezes com TBS (pH 7,4) (temperatura ambiente durante 8 minutos de cada vez). </li><li> Incubação Todas as incubações estão em câmara úmida à temperatura ambiente. Aproximadamente 150 mL de cada uma das soluções listadas abaixo são usados ​​por slide. Os slides são colocados em uma câmara úmida e as soluções são pipetadas para os espécimes (as partes não-membranosa não precisa ser coberto pelas soluções). Para cada um dos seguintes passos, cuidadosamente sacudir toda a solução antes que a solução subseqüente é adicionado. <ol><li> Incubação com Normal (bloqueio) de soro (cavalo) (ABC kit) 3 gotas de solução amarela / 10 ml de tampão de diluição por 20 minutos. </li><li> Incubação com anticorpo primário ARU0181, que rotula de ratos células endoteliais vasculares. O anticorpo é diluída 1:600 ​​com tampão de diluição (Biosource) (100 l diluído 40 vezes [frozen] mais 900 mL de tampão de diluição) e incubação ocorre durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> Dia 2 Os slides são removidos da câmara úmida, o anticorpo primário é descartado, e os slides são colocados em um compartimento de slides, coloração, que está submersa na tina de coloração e lavadas duas vezes com TBS(PH 7,8) por 8 minutos. <ol><li> Incubação com anticorpo biotinilado (ABC kit) Os slides são colocados horizontalmente em câmara úmida e incubadas com 1 gota de solução de azul / 10 ml de tampão de diluição por 30 minutos. Descartar a solução e colocar as lâminas em porta-lâminas coloração submerso na tina de coloração e enxaguar duas vezes com TBS (pH 7,4) por 8 minutos. </li><li> Incubação com o reagente ABC As lâminas são novamente colocados horizontalmente em câmara úmida e as soluções a seguir são pipetados sobre as partes membranosa das amostras: 2 gotas de solução de laranja mais 2 gotas de solução marrom / 10 ml TBS (pH 7,4) por 30 minutos. Misture com cuidado 30 minutos antes de usar! Descartar a solução e coloque os slides no suporte de slides na tina de coloração e enxaguar duas vezes com TBS (pH 7,4) por 8 minutos. </li></ol></li><li> Coloração com DAB (0,05%) Esta etapa deve ser realizada em uma capela química ventilados! Coloque os slides e adicione o 3,3-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich) solução usando uma pipeta: solução DAB 0,1% em TBS (pH 7,4) [frozen] é diluído 1:1 com uma mistura de 10 ml H 2 O 2 e 7,5 ml TBS (pH 7,4). Esta solução é estéril filtrada imediatamente antes da utilização (para eliminar quaisquer partículas que podem obscurecer a imagem microscópica). Mancha as amostras por 8 minutos. Descartar a solução e coloque os slides no suporte de slides coloração submerso na tina de coloração. Enxágüe em água corrente e depois em água destilada por alguns minutos. </li><li> Desidratação Os slides são mantidos no compartimento de slides coloração. Enxágüe por devoluções e recarga do jar coloração contendo água destilada / etanol: água destilada, álcool 70%, álcool 95%, álcool absoluto, com dois minutos em cada solução. </li></ol> 7. Imagem e Avaliação da Rede Microvascular em cada amostra Janela mesentérica após coloração imuno-histoquímica de células endoteliais vasculares Como mostrado no filme, microvasos são microscopicamente visualizadas in situ no tecido intacto. <ol><li> Primeiro, usamos um microscópio desenho com faixa de ampliação de 14-34 (Leica M Selvagem 3Z) para lápis em papel branco a área de janela inteira, bem como a área vascularizada inteiro (VA) por janela mesentérica. VA, como uma porcentagem de toda a área, é facilmente medida por planimetria computadorizada ou não informatizado (ou simplesmente cortando e ponderação a imagem de toda a janela, e as imagens de todas as suas partes vascularizado). </li><li> Usando outro microscópio desenho, perfis microvascular individuais, que são facilmente identificados, são desenhadas em tinta preta sobre papel branco em 80 de ampliação dentro de campos escolhidos aleatoriamente. Este é o ponto de partida para a avaliação computadorizada subseqüente morfométricas de comprimento microvascular (MVL), que é basicamente uma medida de densidade microvascular. </li><li> Opcionalmente, variáveis ​​relacionadas à formação de padrões microvascular, bem como aqueles para a avaliação do número de brotos microvascular e comprimento de brotos individuais microvascular (No. SP e Le. SP, respectivamente) pode ser determinada. -O contraste entre o ideal representado estruturas vaso preto e fundo branco facilita a análise detalhada das imagens, na maioria dos comerciais morfométricas programas computadorizados. </li><li> Na maioria dos casos, as principais variáveis ​​são VA e MVL, que quando multiplicados juntos geram o comprimento microvascular total (TMVL). </li></ol> 8. Análise estatística Normalmente, usamos o padrão não-paramétrico Mann-Whitney U-teste para analisar unpaired (bicaudal) observações. Uma média de quatro janelas mesentérica por animal é usado como o ponto de dados independentes para cada variável da janela mesentérica. O critério de significância estatística é P ≤ 0,05.

<ol><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li>
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<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li>
<li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp, T. uneberg, S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF%28165%29-mediated+angiogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li>
<li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dalteparin%2C+a+low-molecular-weight+heparin%2C+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res.%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio foi introduzida em 1986 3 e tem sido sucessivamente desenvolvidos e aperfeiçoados em nosso laboratório 7,10-12. Como discutido em artigos de revisão (convidado) 1, 2, o ensaio compara bem com outros mamíferos ensaio in vivo de angiogênese em consideração, nomeadamente, características importantes, como o tecido teste adultos é nativamente vascularizado e carece de angiogênese fisiológica; trauma mínimo, se houver, é infligida ao tecido; variáveis ​​quantitativas realmente são medidos, o que permite análise estatística de som em relação dose-resposta e atividade molecular estudos; angiogênese surgimento ocorre, que é predominante em tecidos normais e tumores, e dados de toxicidade são facilmente acumulada em ratos que crescer robustamente fisiologicamente na idade adulta. Características desfavoráveis ​​podem incluir o fato de que o ensaio é relativamente demorado, especialmente quando se avalia o número ea duração de segmentos individuais microvascular microvascular e brotos, que não permite observações real-time/serial, e que dificilmente é adequado para ratos uma vez que muitas janelas mesentérica em ratos falta microvasos pai potencial a partir do qual pode originar novos capilares. Observações em tempo real, no entanto, habilitado por microscopia intravital onde as janelas exteriorizado, mas ainda intacta mesentérica estão espalhados ao longo de um estágio do microscópio enquanto o animal é anestesiado, como discutido na 1. Avanços significativos na pesquisa da angiogênese foram alcançados nas últimas décadas com modelos como o micropocket da córnea, membrana pinto corioalantóicas e ensaios plug-sc Matrigel, que são ferramentas úteis, mas, em última análise limitada. Futuras aplicações clínicas de terapias anti-angiogênicos e pró-angiogênico exigir o estabelecimento e validação de mais sensível e biologicamente relevantes, verdadeiramente quantitativa modelos pré-clínicos, como o descrito no relatório atual.

Tampões e reagentes 0,5 M solução estoque Tris-HCl (pH 7,8) Tris (hidroximetil) aminomethan (60,57 g) é dissolvido em ~ 900 ml água destilada e ~ 45 ml de HCl 25% (concentrado) é adicionado para atingir pH 7,8, seguido de diluição para 1 litro com água destilada. Tris-buffer salina (TBS, pH 7.8) A 200 ml da solução-mãe é adicionado 18 g NaCl dissolvido em ~ 1800 ml água destilada com ajuste de pH para 7,8 usando solução-mãe, seguido de diluição de 2 litros com água destilada. TBS (pH 7,4) A 200 ml da solução-mãe é adicionado 18 g de NaCl dissolvidos em dissolvido em ~ 1800 ml água destilada com ajuste de pH para 7,4 usando solução-mãe, seguido de diluição de 2 litros com água destilada. Solução de tripsina (0,05% de tripsina, 0,1% CaCl 2) Contém 0,1 g e 0,2 g de tripsina CaCl 2 em 200 ml TBS (pH 7,8). Solução de sacarose 2,5% Contém 5 g de sacarose em 200 ml TBS (pH 7,8). Solução estoque de azida de sódio 1% em TBS (pH 7,4) Contém 1 g Na-azida em 100 ml com TBS (pH 7,4). Diluindo buffer: 0,1% BSA, 0,01% Na-azida (Usado para diluir os anticorpos no ABC Vectastain kit). Contém 0,1 g de albumina bovina sérica (BSA) e 1 ml de 1% Na-azida, diluído para 100 ml com TBS (pH 7,4). ABC kit Vectastain PK 4002, peroxidase ABC rato IgG Soro de cavalo normal; bloqueio soro; solução amarela: 3 drops/10 ml de tampão de diluição. Anticorpo biotinilado; anti-mouse IgG; solução de azul: um tampão de diluição drop/10 ml. ABC reagentes: solução de laranja, 2 gotas mais marrom solução de 2 ml drops/10 TBS (pH 7,4). Misture as soluções 20 minutos antes de usar! Mouse (monoclonal) endotélio anti-rato (Biosource International, Camarillo, CA, EUA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalogo </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clone # </td><td> OX MRC-43 </td></tr></tbody></table> Este anticorpo é dirigido contra todas as células do endotélio vascular em ratos, com exceção dos que estão no cérebro. Peroxidase Vectastain Avidin Biotina Complexo (ABC) kit O kit contém o anticorpo primário, o anticorpo secundário biotinilado, avidina-biotinilado complexo enzimático (ABC), e do substrato da enzima. Ver <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> ou <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> para protocolos. Albumina sérica bovina (BSA) (catálogo da Sigma-Aldrich, # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-diaminobenzidina Isopac (Sigma-Aldrich, catalogo D 9015). Tripsina de pâncreas bovino (Sigma-Aldrich, catalogo T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, Suécia)

rat assay angiogenesis mesentery

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

O adulto de ratos mesentério ensaio angiogênese janela é biologicamente apropriada e é excepcionalmente adequado para o estudo de germinação angiogênese in vivo [ver artigos de revisão], que é a forma dominante de angiogênese em tumores humanos e não-tecidos tumorais, como discutido na revisão solicitada papers 1,2. Angiogênese induzida nas partes membranosas mesentérica por injeção intraperitoneal (ip) de um fator pró-angiogênico pode ser modulada por via subcutânea (sc), intravenosa (iv) ou oral (po) o tratamento com agentes modificadores de escolha. Cada parte membranosa do mesentério é translúcido e emoldurado por tecido adiposo, dando-lhe uma aparência janela-like. O ensaio tem as seguintes características vantajosas: (i) o tecido de teste é nativamente vascularizado, apesar da baixa densidade, e uma vez que é extremamente fina, a rede microvascular é praticamente bidimensional, que permite que toda a rede a ser avaliados microscopicamente in situ; ( ii) em ratos adultos o tecido teste carece de angiogênese fisiológica significativa, o que caracteriza a maioria dos adultos normais tecidos de mamíferos, o grau de vascularização nativa é, no entanto, correlacionada com a idade, como discutido no 1; (iii) o nível insignificante de trauma angiogênese induzida garante alta sensibilidade; (iv) o ensaio reproduz a situação clínica, como as drogas angiogênese modulador de teste são administrados por via sistémica e as respostas observadas refletem o efeito líquido de todos os metabólica, celular e alterações moleculares induzidas pelo tratamento, (v) o ensaio permite avaliações de objetivo, quantitativo, variáveis ​​imparciais sobre extensão espacial microvascular, densidade e formação de padrões de rede, bem como de germinação capilar, permitindo assim robusta análises estatísticas da dose-efeito e molecular relações estrutura-actividade, e (vi ) o ensaio revela com alta sensibilidade aos efeitos tóxicos ou nocivos dos tratamentos em termos de diminuição da taxa de ganho de peso-fisiológicos, como ratos adultos crescer robustamente. Mast-mediada por células angiogênese foi demonstrada pela primeira vez com este ensaio 3,4. O modelo demonstra um alto nível de discriminação em relação dose-efeito e os efeitos medidos administrada sistemicamente quimicamente ou funcionalmente drogas intimamente relacionados e proteínas, incluindo: (i) de baixa dosagem, administrada metronomicamente quimioterápicos padrão que produzem diversos, drogas efeitos específicos (isto é, atividades angiogênese-supressiva, neutro ou angiogênese estimulante 5), (ii) natural de ferro-insaturados lactoferrina humana, o que estimula VEGF-A-angiogênese mediada 6, e natural de ferro-insaturados lactoferrina bovina, que inibe o VEGF-A- angiogênese mediada 7, e (iii) as frações de baixo peso molecular, a heparina produzida por vários meios 8,9. Além disso, o ensaio é altamente adequado para estudos dos efeitos combinados sobre a angiogênese de agentes que são administrados por via sistémica, de forma concomitante ou seqüencial. A idéia de fazer este vídeo originou-se do falecido Dr. Judah Folkman, quando visitou nosso laboratório e testemunhou a metodologia que está sendo demonstrada. Revisão papers (convidados) discutindo e avaliando o ensaio Norrby, K. Em modelos in vivo da angiogênese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, K. O teste de drogas com modelos de angiogênese. Especialista Opin. Drogas. Descoberta. 3, 533-549 (2008).

Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

O ensaio de angiogênese em janela mesentérica de rato adulto é biologicamente apropriado e é excepcionalmente adequado para o estudo da angiogênese por brotamento em...

Bem-vindo ao Departamento de Patologia do Hospital Universitário GaN, em Guttenburg, Suécia. Sou o Dr. Klaus Norby, e o método que você está prestes a ver foi desenvolvido no meu laboratório. A angiogênese clinicamente relevante, que ocorre em conexão com hipóxia, tumores sólidos ou qualquer outra doença angiogênica, acontece quase exclusivamente em tecidos nativamente vascularizados. Em pequenos roedores adultos, o mesentério, que conecta o intestino delgado à parede posterior do corpo, contém diversas partes finas e membranosas. Em ratos, existem cerca de 40 a 50 dessas janelas mesentéricas. Elas são virtualmente transparentes e, portanto, semelhantes a janelas à vista desarmada, sendo cada janela cercada por tecido adiposo em ratos machos adultos.As janelas mesentéricas são naturalmente vascularizadas e não apresentam angiogênese fisiológica mensurável. Elas, portanto, oferecem uma oportunidade para estudar a angiogênese de novo em tecido mamífero adulto naturalmente vascularizado. Isto é, a iniciação de uma resposta angiogênica completa do zero, superando os inibidores de angiogênese que atuam endogenamente no tecido testado, como em todos os tecidos normais em camundongos, os microvasos nativos que podem atuar como microvasos parentais estão ausentes em muitas janelas, o que infelizmente torna o ensaio imprevisível em camundongos na forma nativa.As janelas mesent&eacute;ricas em ratos normalmente cont&ecirc;m um n&uacute;mero relativamente pequeno de pequenos vasos sangu&iacute;neos localizados na periferia em ratos adultos. Essas janelas mesent&eacute;ricas t&ecirc;m naturalmente entre cinco e dez micr&ocirc;metros de espessura. Isso permite que o tecido intacto seja espalhado sobre l&acirc;minas e observado microscopicamente, possibilitando assim a visualiza&ccedil;&atilde;o de todos os vasos em cada janela e conferindo aos vasos uma extens&atilde;o essencialmente bidimensional.O método oferece uma oportunidade sem igual para realizar medições quantitativas da extensão espacial, densidade, formação de padrões e tamanho dos microvasos sanguíneos. O sítio subcutâneo é popular para estudos de angiogênese; no entanto, devido à heterogeneidade das células endoteliais e às propriedades específicas dos tecidos, o controle da angiogênese em tecidos subcutâneos e tumores em crescimento subcutâneo pode não prever o controle da angiogênese em órgãos viscerais metastáticos, como pulmão, fígado, osso e cérebro. Isso é notável, pois as metástases viscerais geralmente são as responsáveis, em última instância, pela letalidade do câncer.O fato de a janela mesentérica ser visceral deve ser vantajoso neste aspecto. O objetivo do nosso projeto é estudar quantitativamente aspectos da angiogênese de novo. Portanto, injetamos um fator pró-angiogênico estabelecido ou uma substância em teste por via intraperitoneal.Nós normalmente injetamos cinco mililitros de cada vez em ratos adultos não anestesiados. Um volume desse tipo expõe rapidamente todo o mesentério ao líquido injetado. Qualquer solução injetada por via intraperitoneal, desde que seu volume não seja diminuto, deve afetar todas as células no tecido analisado, especialmente porque a camada mesotelial de células que reveste a janela mesentérica extremamente fina é altamente permeável a solutos; como nenhum procedimento cirúrgico é necessário, a angiogênese a ser estudada na janela mesentérica não é afetada pela angiogênese induzida pela cicatrização de feridas, portanto, o tratamento angiogênico é administrado na forma de injeções intraperitoneais.Por razões práticas, utilizamos um protocolo de tratamento composto por duas injeções diárias durante um período de cinco dias, da manhã de segunda-feira à manhã de sexta-feira, como padrão ao estudar os efeitos angiogênicos de proteínas definidas, tais como VEGF 1 65, 1 64 e FGF básico, por exemplo. Normalmente, utiliza-se a solução de infusão Pharmacia como veículo. O número de tratamentos pode parecer elevado, mas demonstrou-se que nem sempre é possível induzir angiogênese estatisticamente significativa, mesmo ao usar fatores pró-angiogênicos tão potentes quanto VEGF e FGF básico quando administrados em níveis aproximadamente fisiológicos em uma única dose ou em poucas doses espaçadas; deve-se lembrar que potentes inibidores endógenos de angiogênese atuam no tecido.A administração de modalidades terapêuticas moduladoras da angiogênese imita uma situação terapêutica clínica. Um ou mais fatores moduladores da angiogênese podem ser administrados por via sistêmica, subcutânea, intravenosa ou oral. Por exemplo.Isso simula uma situação de tratamento clínico, pois permite estudar o efeito não apenas da molécula original, mas também de seus metabólitos. O sistema permite certo grau de controle sobre os efeitos tóxicos de agentes moduladores da angiogênese administrados sistemicamente. Como ratos adultos crescem fisiologicamente e podem aumentar seu peso em cerca de 40% durante um experimento com duração de duas ou três semanas, é possível, mediante pesagem dos animais, avaliar o grau em que o tratamento retardou o aumento do peso corporal, o que pode ser considerado uma expressão dos efeitos tóxicos.Isso permite evitar doses tóxicas de substâncias testadas que modulam a angiogênese. Um benefício importante, pois pode ser impossível interpretar os resultados em termos de efeitos antiangiogênicos específicos. Se um efeito tóxico estiver envolvido, como as ratas adultas crescem consideravelmente mais rápido que os camundongos adultos, o efeito de agentes tóxicos sobre o ganho de peso corporal deve ser um indicador mais sensível de efeitos tóxicos gerais em ratas do que em camundongos.Agora gostaríamos de mostrar como são confeccionados os espécimes de janela mesentérica. Esses animais foram mortos utilizando CO2. As janelas mesentéricas são espalhadas sobre lâminas comuns de 3 por 1 polegada, iniciando distalmente no mesentério.A angiogênese não pode ser observada a olho nu na janela mesentérica, começando pela válvula íleo-cecal e movendo-se em direção retrógrada. As quatro janelas coletadas da parte mais distal do mesentério são utilizadas. O espécime sobre a lâmina é seco à temperatura ambiente por 20 minutos.O coto intestinal é removido. Os espécimes são então mantidos em um congelador a menos 20 graus centígrados. Dessa forma, os espécimes podem ser conservados por vários meses, talvez até anos, sem deterioração acentuada na qualidade.A coloração é realizada utilizando um anticorpo monoclonal contra o endotélio de rato; deixe o espécime secar ao ar, não monte com lamínula. A quantificação dos incidentes de vasos sanguíneos em janelas mesentéricas individuais é feita por meio de microscopia morfométrica auxiliada por computador, utilizando um microscópio de desenho com aumento óptico total entre 14 e 34. Toda a janela mesentérica é visualizada.O aumento é escolhido em passos fixos para que a maior parte possível do campo de visão seja coberta pelo espécime. Toda a área da janela é facilmente delimitada, pois a borda entre a janela e o tecido adiposo circundante é nítida. Todas as partes vascularizadas são então desenhadas de acordo com critérios cuidadosamente definidos.Até os menores vasos sanguíneos recém-formados, cujo diâmetro em aumentos maiores foi encontrado em torno de 2,5 a 3,0 micrômetros, podem ser claramente discernidos. O fato de que o diâmetro médio do eritrócito de rato é igual ou maior que 6,3 micrômetros demonstra o quão pequenos são esses vasos. A área de todas as partes vascularizadas em uma janela, expressa como porcentagem da área total da janela, é conhecida como área vascularizada relativa va.É, para todos os efeitos, uma medida da extensão espacial dos vasos, já que esses possuem essencialmente uma extensão bidimensional, podendo a AV ser facilmente medida por meio de telemetria assistida por computador, por exemplo. O próximo passo envolve o registro da densidade dos microvasos e da formação de padrões em três partes centrais das áreas vascularizadas de cada janela. Essas partes são escolhidas aleatoriamente de forma sistemática com um aumento óptico de 80.Cada vaso é visualizado como uma única linha utilizando um microscópio de desenho. A imagem de cada campo de visão é transferida para uma imagem digitalizada e para um analisador de imagens, e cada vaso na imagem digitalizada é então reduzido a uma espessura de um único pixel. O equipamento então mede o número de pixels, que representa os vasos e é expresso como uma fração de todos os pixels no campo de visão.Este valor percentual, o comprimento microvascular ou MVL, representa o comprimento dos microvasos em cada unidade da área vascularizada e é uma medida composta da densidade dos microvasos. Multiplicando-se a média de VA de quatro janelas por animal pela média de MVL do grupo de tratamento correspondente, calcula-se o comprimento total dos microvasos por animal, o TMVL. Desenvolvemos ainda técnicas para análise quantitativa detalhada da densidade e composição dos microvasos por meio de análise de imagem.Esses incluem a medição da distância real entre dois microvasos sucessivos, pontos de ramificação, IE, o comprimento de microvasos individuais, segmentos LEMS, o número de microvasos, segmentos por unidade de volume tecidual, NOMS, e o número de pontos de ramificação de microvasos por unidade de volume tecidual. NOBP. O grau de tortuosidade nos microvasos MVT é dado pela diferença entre a distância mais curta e a distância real entre dois pontos de ramificação sucessivos, pela ocorrência de cruzamento de microvasos sobre o índice de interseção INIS e pela formação de alças interconectadas. O índice de formação de alças INLF também pode ser medido com precisão usando técnicas semelhantes na periferia da rede de microvasos.Também é possível quantificar variáveis correspondentes para brotos, incluindo o comprimento dos brotos, LESP, e o número de brotos por unidade de volume tecidual, NOSP, planejando experimentos, pois podem existir diferenças significativas entre animais no mesmo grupo de tratamento e até entre janelas mesentéricas de um mesmo animal. Verificamos que o seguinte delineamento pode ser prático: o número de animais por grupo de tratamento durante o período de observação, de oito a 12; o número de janelas por animal que são analisadas em termos de VA; o número de campos de visão para cada janela que são analisados em termos de comprimento microvascular, MVL; comprimento dos microvasos, segmentos, LEMS; número de segmentos microvasculares, NOMS; número de pontos de bifurcação dos microvasos, NOBP; tortuosidade do microvaso, MVT; índice de interseção, I; índice de formação de alças, INF. Três animais tratados com veículo são utilizados como controles. O ensaio de angiogênese em janela mesentérica é particularmente adequado para estudos de efeito dose-resposta e para análises cinéticas da angiogênese.Isso pode ser feito tratando grupos de animais com diferentes doses de fator pró-angiogênico e sacrificando esses animais em diferentes momentos durante a resposta angiogênica. A fase expansiva, o pico e a subsequente fase angiorregressiva podem assim ser discernidas em termos quantitativos. Estudos desse tipo revelaram que a resposta angiogênica de novo a qualquer citocina fator de crescimento testada é especificamente dependente da dose em termos de velocidade, potência e duração.Além disso, o padrão dos novos vasos em termos de extensão espacial e alterações nos microvasos, densidade, é frequentemente nitidamente dependente da dose e do tempo, em comparação com a angiogênese mediada por VEGF ou FGF básico em doses aproximadamente fisiológicas. A angiogênese mediada por mastócitos, MCMA induzida por ativação seletiva de mastócitos in situ, apresenta potência consideravelmente maior e duração notavelmente mais longa. Na verdade, a angiogênese mediada por mastócitos foi descrita pela primeira vez utilizando este ensaio, devido à capacidade de quantificar variáveis objetivas de angiogênese, ao alto grau de relevância biológica do sistema e à possibilidade de verificar efeitos tóxicos do tratamento.A metodologia é especialmente adequada para análises de estrutura-atividade e resposta à dose. O MWAA em ratos apresenta um modelo para o estudo da angiogênese em um tecido visceral vascularizado nativamente em animais adultos, que não apresenta angiogênese fisiológica e não é afetado por cirurgia, excluindo assim qualquer influência da angiogênese induzida por cicatrização de feridas. O ensaio é verdadeiramente quantitativo e avalia com precisão diversas variáveis objetivas biologicamente relevantes que descrevem a extensão espacial, densidade e formação de padrões dos microvasos.O ensaio é muito adequado para estudar os efeitos sistêmicos da angiogênese, fatores moduladores e para estudos de estrutura-atividade e resposta à dose. A metodologia descrita aqui foi desenvolvida no laboratório do Dr. Kloss Carl Norby, no Departamento de Patologia, Hospital Universitário Reka, Universidade Jute Borg Gotemburgo, na Suécia. Todos os estudos deste projeto foram apoiados pelo Conselho Sueco de Pesquisa Médica, número do projeto 5 9 4 2.Agradecemos o habilidoso auxílio técnico da Sra. Gun Effer, envolvida desde o início do projeto, da Sra. Monica Anderson, ausente, e da Sra. Ann Nemar Lindgren.Espero que esta breve apresentação tenha lhe dado uma ideia do potencial do ensaio. Se você utilizar este ensaio em seu laboratório, ficarei feliz em ajudá-lo caso encontre algum problema técnico. Além disso, agradeceria muito qualquer sugestão que você possa ter.Obrigado.

Research

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Biology

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