Imuno-histoquímica: Seções de parafina Usando o Kit de Vectastain ABC Vector Labs

Olá, sou Victor Chi e sou aluno de pós-graduação no laboratório Chandy, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vou demonstrar como colorir cortes em parafina utilizando o kit A b, C da Vector Laboratories. Este procedimento envolve desparafinização e hidratação de cortes em parafina, realização de recuperação de antígenos induzida por calor para expor os antígenos, bloqueio da peroxidase e da ligação proteica não específica, incubação com anticorpos primários CD4 e tirosina hidroxilase e com anticorpos secundários, além de revelação e montagem da lâmina.

Então vamos começar. Como as lâminas estão embebidas em parafina, o primeiro passo é desparafinizar as lâminas. Isso é feito geralmente em uma câmara de fluxo laminar utilizando três frascos de xilol, após três lavagens, cada uma com duração de cinco minutos.

As lâminas são então colocadas em etanol a cem por cento. Você notará que a parafina das lâminas desapareceu, mas tenha cuidado para não manipular as lâminas com luvas, pois o xilol dissolve a borracha das luvas. Em seguida, transfira as lâminas em etanol a cem por cento de volta para o laboratório, onde passarão por um gradiente de hidratação.

Aqui vou falar com você sobre o gradiente de hidratação ao qual submeteremos nossas lâminas. Ele começa com dois banhos de etanol a cem por cento. A partir daí, transferimos nossas lâminas para dois banhos contendo etanol a 95%.

Em seguida, transferimos nossas lâminas para um banho de etanol a 70%, e dali as transferimos para um banho de etanol a 50%. Depois disso, transferimos nossas lâminas para etanol a 30%, e dois minutos depois as transferimos para água bidestilada. E após o tratamento com água bidestilada, deixaremos nossa lâmina em PBS.

Agora vou mostrar como transportar as lâminas de um banho para o próximo nos porta-lâminas. O primeiro passo é, usando o suporte do porta-lâminas, retirar as lâminas e raspá-las suavemente para remover o excesso de líquido, evitando assim carregar muito líquido para o próximo banho. Em seguida, mergulhe-o e aguarde dois minutos até a próxima mudança de gradiente.

Muitas vezes, quando os tecidos são fixados, o antígeno fica mascarado, de modo que o anticorpo não consegue se ligar a ele. Então, o que vou fazer agora é mostrar um método de recuperação de antígeno induzida por calor, utilizando citrato de sódio. Agora estamos aqui no micro-ondas, onde vou desmascarar meu antígeno CD8, que tentarei detectar por meio de imuno-histoquímica.

E aqui vou colocar minha solução e aquecê-la no micro-ondas por 15 minutos. Então, fervemos o citrato de sódio com nossas lâminas por 15 minutos para garantir que as lâminas não sequem. Vamos observar nossas lâminas para, em caso de transbordamento, reabastecê-las com citrato de sódio, assegurando que permaneçam hidratadas.

Então, antes de colocar minhas lâminas no citrato de sódio, já aqueci previamente minha solução por 45 segundos. Em seguida, coloquei as lâminas no citrato de sódio e agora estou aquecendo o citrato de sódio por 15 minutos, com as lâminas dentro. Normalmente, a solução começa a transbordar entre dois e dois minutos e meio após o início da fervura.

Nesse momento, eu paro e repõe o citrato de sódio perdido com citrato de sódio fresco. Após ferver o citrato de sódio por 15 minutos, queremos remover nossas lâminas e a solução e resfriá-las. Assim, a melhor maneira de fazer isso é tampar o porta-lâminas, derramar o líquido em excesso e passá-lo sob uma corrente de água fria até que a solução dentro do frasco seja resfriada à temperatura ambiente.

E isso geralmente leva cerca de 10 a 15 minutos. Após remover nossas lâminas da pia, precisamos bloquear a atividade de peroxidase endógena nos tecidos. Para isso, vamos preparar uma solução de peróxido de hidrogênio utilizando peróxido de hidrogênio a 30% e preparando uma solução de peróxido de hidrogênio a 1%.

E a partir daqui, transfiro diretamente as lâminas para a solução de peróxido de hidrogênio. Agora, vamos incubá-las no peróxido de hidrogênio por 20 minutos. Após decorridos os 20 minutos, depois de bloquear a peroxidase endógena, vou agora lavar o peróxido de hidrogênio das lâminas utilizando lavagens com PBS.

Então, vou transferir minhas lâminas para a platina e lavá-las com três lavagens, cada uma com duração de cinco minutos. Essas lâminas foram colocadas encostadas uma na outra, voltadas para trás, para evitar o contato com as demais lâminas, o que poderia danificar o tecido. Estou simplesmente retirando as lâminas e as organizando de modo que o tecido não tenha possibilidade de entrar em contato com o vidro.

Aqui transferimos nossas lâminas para PBS. Após lavar as lâminas com PBS, agora vou bloquear as lâminas para ligação não específica de proteínas com uma solução de 5% BSA, 5% soro de cabra e 0,1% azida de sódio. Portanto, você deve substituir o soro de cabra por outro de espécie diferente se estiver trabalhando com anticorpos de cabra.

No momento, vou colocar as lâminas no porta-lâminas e preenchê-lo com nossa solução. Normalmente, preencho apenas até a metade, para que o volume das lâminas garanta que os tecidos fiquem submersos. Um ponto importante ao colocar as lâminas no recipiente é evitar que os tecidos toquem nas laterais do recipiente.

Então, para o último lâmina, gire-a para dentro para que o tecido não toque o recipiente. Agora que bloqueei minhas lâminas durante a noite, vou lavar o excesso da solução bloqueadora com três lavagens de cinco minutos cada em PBS. Neste momento, queremos desenhar um círculo ao redor do nosso tecido usando um bloqueador líquido para minimizar a quantidade de anticorpo utilizada.

Se você não estiver preocupado em conservar o anticorpo, então pode sempre incubar as lâminas nas mesmas cubas utilizadas na etapa de bloqueio. A partir de agora, vou mostrar como desenhamos com o bloqueador líquido ao redor do nosso tecido. Primeiro, removemos o sangue e o líquido em excesso, tomando cuidado para não tocar o tecido.

Então, basta passar pelas bordas para remover o líquido em excesso. Novamente, tendo muito, muito cuidado para não tocar o tecido. Pegue o pino bloqueador de líquido, pressione suavemente para iniciar o fluxo e, a partir daí, contorne o tecido com a caneta.

Deixe o bloqueador líquido secar por cerca de 15 segundos. Neste momento, devemos adicionar o anticorpo primário. Usando uma pipeta, certifique-se de cobrir o tecido com o anticorpo primário e transfira-o para a caixa com umidade controlada.

Então, usamos uma toalha de papel Kim. Colocamos uma toalha umedecida com água desionizada nesta caixa para evitar que a lâmina seque durante a incubação com o anticorpo primário. Agora que nosso anticorpo primário está em incubação há uma hora, vamos remover nossas lâminas e lavar o anticorpo em excesso com PBS.

Então novamente, basta permitir que o líquido escorra e insira-o na sua lavagem com PBS. E novamente, lave três vezes por cinco minutos. Após nossas três lavagens de cinco minutos, vamos adicionar nosso anticorpo secundário ao nosso tecido da mesma forma que adicionamos o anticorpo primário.

Então, usando apenas o volume suficiente para cobrir seus tecidos, adicione seu anticorpo secundário, que no nosso caso é anticabo de cabra anti coelho, e coloque novamente a lâmina na câmara com umidade controlada. Estamos utilizando um anticorpo secundário biotinilado de cabra anti coelho, o qual é essencial quando se utiliza o método A BC. Assim, transferimos nossa lâmina para a câmara com umidade controlada e deixamos incubando por uma hora.

Portanto, enquanto o anticorpo secundário está em incubação, precisamos preparar o reagente A BC. Estamos utilizando o reagente A, B, C da Vector Laboratories, proveniente do kit de coloração Vector. Remova o reagente a, prime-o e permita que caia três vezes em 15 mililitros de PBS, tomando cuidado para não apertar o tubo, pois as gotas devem ser rigorosamente dosadas e de tamanho específico.

Após o anticorpo secundário ter sido incubado por cerca de uma hora, você retira suas lâminas e as lava novamente em PBS, da mesma forma que fez com o anticorpo primário. Após três lavagens, cada uma com duração de cinco minutos, transfira suas lâminas para este recipiente, no qual você adiciona o reagente A, B, C, que foi preparado entre 30 a 45 minutos antes. Adicione então o reagente A, B, C aqui, cubra completamente as lâminas e deixe incubando por mais 30 a 45 minutos.

Então, após suas lâminas permanecerem em A, B, C por cerca de 3 a 5 minutos, queremos lavar a solução em excesso de A, B, C. Portanto, basta remover suas lâminas e adicioná-las à solução de PBS. E queremos repetir o mesmo procedimento de lavagem três vezes em PBS, por cinco minutos cada lavagem.

Enquanto as lâminas estão sendo lavadas, preparo o substrato de peroxidase DAB dos laboratórios Vector. Pego o tampão de pH 7,5 e adiciono duas gotas. Após o tampão de pH 7,5, pego o reagente do substrato DAB e adiciono duas gotas desse também.

Novamente, o tamanho da gota é crítico, portanto não aperte o frasco e apenas permita que as gotas caiam. Duas gotas para o tampão pH 7,5. Assim, você deve adicionar quatro gotas do reagente substrato DAB, permitindo que ele também caia em gotas.

Você também deseja adicionar, ao final, duas gotas do reagente substrato de peróxido de hidrogênio. Assim é como a mistura de reagente substrato DAB deve ficar. Agora está pronta para ser adicionada às lâminas; retire suas lâminas e permita que o PBS escorra completamente delas.

Com o tempo, o reagente DAB torna-se mais marrom. Portanto, queremos adicioná-lo às nossas lâminas neste momento. Pegue um volume suficiente para cobrir os tecidos e adicione-o diretamente sobre as amostras de tecido.

Então, basta pegar o volume apropriado e adicioná-lo diretamente sobre suas amostras de tecido, permitindo que a solução reaja enquanto suas amostras de tecido ficam mais marrons ao longo do tempo. Após adicionar a sua solução de DAB, é possível observar nesta seção do cérebro onde o tecido fica marrom aqui e aqui. A coloração marrom do DAB revela a região contendo neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo.

Após desenvolver suas lâminas por um período de dois a 10 minutos, você deve adicionar suas lâminas à água gelada para interromper a reação. Portanto, basta permitir que a solução escorra e adicione diretamente suas lâminas à água gelada. Após imergir suas lâminas na água gelada, leve o banho até a pia e passe água fria sobre ele por aproximadamente cinco minutos para garantir que toda a solução de DAB seja removida desse recipiente.

Portanto, ao adicionar na pia, tenha cuidado para que o fluxo não atinja o tecido, fazendo com que ele atinja antes um dos cantos e permitindo que apenas transborde, de modo que seus tecidos não sejam perturbados pelo fluxo contínuo de água. Após remover suas lâminas da lavagem, você deve realizar uma coloração de contraste. Mas por que você usaria uma coloração de contraste?

Bem, uma razão é que você pode querer observar a estrutura do seu tecido. Outra é visualizar todas as células. Assim, para os nossos propósitos, vamos realizar uma coloração de contraste com hematoxilina, que marca os núcleos.

Então, queremos pegar nossas lâminas, remover o líquido em excesso e mergulhá-las uma vez na solução de Hemat Hematina. Uma vez retiradas, adicione-as diretamente na água. Após colocar as lâminas na água da torneira, você deve pegá-las e passá-las sob água corrente, como fez anteriormente com o banho de água gelada.

Para a lavagem com hematoxilina, basta deixar correr sob água corrente até que a água dentro do frasco fique transparente. Após remover nossas lâminas contracoradas da água, devemos reidratar nossas lâminas. Assim, queremos passá-las novamente pelo nosso gradiente de etanol, mas em ordem inversa.

Portanto, seriam uma lavagem com água desionizada, uma lavagem com etanol a 30%, uma lavagem com etanol a 50%, uma lavagem com etanol a 70%, duas lavagens com etanol a 95% e duas lavagens com etanol a 100%, cada uma com duração de dois minutos. Remova suas lâminas, limpe o líquido em excesso e adicione-as diretamente ao etanol a 30%, deixando repousar por dois minutos. Após a última lavagem com etanol a cem por cento, devemos colocar as lâminas novamente no xilol.

Então pegue novamente suas lâminas, removendo o excesso de líquido, e coloque-as no primeiro xilol por cinco minutos. Serão três lavagens consecutivas em xilol, cada uma por cinco minutos. Agora estamos prontos para montar nossas lâminas.

O que eu geralmente faço é, um minuto antes de os lâminas estarem prontas, pegar minha pipeta de Pasteur e aspirar a solução de montagem permanente, deixando-a repousar por aproximadamente um minuto antes de retirar as lâminas após a última lavagem com xilol. Após a última lavagem com xilol, tomando cuidado para não submergir as luvas nem molhá-las com xilol, remova as lâminas com uma pinça, atento ao lado que contém o tecido. Limpe suavemente o excesso de xilol com um lenço de papel Kim, tomando cuidado para não tocar o tecido, limpando apenas com cuidado os cantos e as bordas, permitindo que a maior parte do xilol evapore. Você provavelmente pode trabalhar com duas lâminas antes que uma delas seque completamente.

Portanto, ao terminar de secar um lâmina, a outra lâmina deve estar pronta para ser manipulada. Agora você precisa trabalhar com elas antes que sequem completamente. Então, você deve pegar seu perimount e traçar uma linha fina ao lado do seu tecido, tomando cuidado para não tocar o tecido.

Remova o Perimount pegando seu lamínula. Aplique-o em um ângulo de 45 graus e permita que ele se curve para baixo. Em seguida, deslize a lamínula, certificando-se de que o Perimount cubra todos os tecidos.

Em seguida, deite-o, coloque-o sobre a lâmina e pressione suavemente no centro para remover todas as bolhas de ar em excesso. Deixe secar enquanto trabalha com seu segundo tecido; este é o momento de observar nossas lâminas, não exatamente. Portanto, precisamos deixar o meio de montagem permanente secar durante a noite antes de examinar nossas lâminas.

Caso contrário, à luz do microscópio, o montante permanente formará bolhas e você estragará sua amostra. Aqui está uma visão de nossas secções cerebrais após coloração com produtos químicos, anticorpo policlonal de coelho direcionado contra tirosina hidroxilase. Novamente, a coloração marrom de DAB mostra a localização dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo.

A contracoloração com hematina torna todos os núcleos neste tecido azuis. Acabei de mostrar como corar seções embebidas em parafina utilizando o kit ABC da Vector Laboratories. Agora você precisará ajustar as condições de acordo com os tipos de tecido que irá corar e os anticorpos que utilizará.

Boa sorte em seus experimentos.