Imuno-histoquímica: Seções de parafina Usando o Kit de Vectastain ABC Vector Labs

Olá, sou Victor Chi e sou estudante de pós-graduação no Chandy Lab no Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. Hoje vou demonstrar como corar seções embebidas em parafina usando o kit AB, C da Vector Laboratories. Este procedimento envolve a depilação e hidratação de seções embebidas em parafina, realizando a recuperação de antígenos induzidos pelo calor para desmascarar antígenos, bloquear a peroxidase e a ligação de proteínas não específicas, incubar com CD quatro e tirosina hidroxilase e anticorpos secundários e desenvolver e montar a lâmina.

Então vamos começar. Como as lâminas são codificadas em parafina, o primeiro passo é desparafinar as lâminas. Isso é feito geralmente em uma capela usando três frascos de xileno após três lavagens, consistindo em cinco minutos para cada lavagem.

As lâminas são então colocadas em cem por cento de etanol. Você notará que a cera nas lâminas sumiu, mas tome cuidado para não manusear as lâminas com luvas, pois o xileno dissolverá a borracha das luvas. A partir daí, você carrega as lâminas de cem por cento de etanol de volta ao laboratório, onde elas passarão por um gradiente de hidratação.

Então, aqui vou falar com você sobre o gradiente de hidratação que colocará nossos slides. Começa com dois banhos de cem por cento de etanol. A partir daí, transferimos nossas lâminas para dois banhos compostos por 95% de etanol.

Em seguida, transferimos nossas lâminas para um banho de etanol a 70% e, a partir daí, transferimos nossas lâminas para um banho de etanol a 50%. Depois disso, transferimos nossas lâminas para 30% de etanol e, dois minutos depois, transferiremos nossas lâminas para água bidestilada E após o tratamento com água destilada dupla, deixaremos nosso slide descansar no PBS.

Então agora vou mostrar como carregar os slides de um banho para o outro nas carruagens. Portanto, o primeiro passo é usar o suporte do carro, remover as corrediças e raspar suavemente para remover o excesso de líquido para que você não leve muito líquido para o próximo banho. A partir daí, mergulhe-o e espere dois minutos até a próxima mudança de gradiente.

Muitas vezes, quando os tecidos se fixam, o antígeno fica mascarado para que o anticorpo não possa se ligar a ele. Então, o que vou fazer agora é mostrar a vocês um método de recuperação de antígeno induzido por calor usando citrato de sódio. Então agora estamos aqui no micro-ondas onde vou desmascarar meu antígeno CD oito, que tentarei detectar usando imuno-histoquímica.

E aqui vou colocar minha solução e colocá-la no micro-ondas por 15 minutos. Então, vamos ferver nosso citrato de sódio com nossas lâminas por 15 minutos para garantir que nossas lâminas não sequem. Estaremos observando nossos slides para que, após a fervura, reabasteçamos com citrato de sódio para garantir que os slides permaneçam hidratados.

Então, antes de colocar minhas lâminas no citrato de sódio, já pré-aqueço minha solução por 45 segundos. Então eu coloquei meus slides no citrato de sódio e agora estou aquecendo meu citrato de sódio por 15 minutos. Com as lâminas, geralmente a solução começa a ferver em cerca de dois a dois minutos e meio no processo de fervura.

Nesse ponto, vou parar e substituir o citrato de sódio perdido por citrato de sódio fresco. Depois de ferver o citrato de sódio por 15 minutos, queremos remover nossas lâminas e solução e resfriá-las. Portanto, a melhor maneira de fazer isso é tampar o suporte da lâmina, despejar o excesso de líquido e passá-lo sobre um jato de água fria até que a solução dentro da jarra seja resfriada à temperatura ambiente.

E isso geralmente leva cerca de 10 a 15 minutos. Portanto, depois de remover nossas lâminas da pia, precisamos bloquear a atividade da peroxidase endógena nos tecidos. Então, o que vamos fazer é fazer uma solução de peróxido de hidrogênio utilizando 30% de peróxido de hidrogênio e formando uma solução de peróxido de hidrogênio a 1%.

E a partir daqui, eu apenas transfiro as lâminas diretamente para a solução de peróxido de hidrogênio. E agora vamos incubar nossas lâminas no peróxido de hidrogênio por 20 minutos. Agora, depois de 20 minutos, depois de bloquear a peroxidase endógena, vou agora lavar o peróxido de hidrogênio das lâminas usando lavagens de PBS.

Então, vou transferir meus slides para a carruagem e lavá-los com três lavagens de cinco minutos cada. Portanto, essas lâminas foram colocadas costas com costas para evitar o contato com as outras lâminas que podem danificar o tecido. Então, estou apenas deslizando para fora das lâminas e organizando as lâminas para que o tecido não tenha possibilidade de entrar em contato com o vidro.

Lá transferimos nossos slides para a PBS. Então, depois de lavar nossas lâminas com PBS, agora vou bloquear as lâminas para ligação não específica de proteínas com uma solução de 5% BSA 5% de soro de cabra e 0,1% de azida de sódio. Então você quer mudar o soro de cabra para outra espécie se estiver trabalhando com anticorpos de cabra.

Então, agora, vou colocar os slides em nosso suporte de slides e preenchê-lo com nossa solução. Então, normalmente, eu apenas o preencho até a metade para que o volume das lâminas apenas garanta que os tecidos fiquem submersos. Portanto, uma coisa que você deve ter certeza ao colocar as lâminas no recipiente é evitar que esses tecidos toquem nas laterais do recipiente.

Então, para o último slide, gire-o para dentro para que o tecido não toque no recipiente. Então, agora que bloqueei meus slides durante a noite, vou lavar o excesso de solução de bloqueio com três lavagens de cinco, consistindo em cinco minutos em PBS. Então, neste ponto, queremos desenhar um círculo usando bloqueador líquido ao redor de nosso tecido para minimizar a quantidade de anticorpos usados.

Se você não está preocupado com a conservação de anticorpos, sempre pode incubar as lâminas nos mesmos invólucros em que fizemos a etapa de bloqueio. Então, a partir deste ponto, vou mostrar como desenhamos com bloqueador líquido ao redor do tecido. Então, primeiro removemos o sangue do excesso de líquido, tomando cuidado para não tocar no tecido.

Então, basta limpar os cantos para remover o excesso de líquido. Novamente, tomando muito, muito cuidado para não tocar no tecido. Pegue o pino de bloqueio de líquido, pressione suavemente para fazer o fluxo e, a partir daí, envolva o tecido com a caneta.

Deixe o bloqueador de líquido secar por cerca de 15 segundos. Neste ponto, queremos adicionar o anticorpo primário. E assim, usando uma pipeta, certifique-se de cobrir o tecido com seu anticorpo primário e transferi-lo para sua caixa com umidade controlada.

Então, usamos um lenço umedecido Kim. Casei com um pouco de água nesta caixa para evitar que a lâmina seque enquanto incuba com o anticorpo primário. Agora que nosso anticorpo primário está incubado há uma hora, vamos remover nossas lâminas e lavar o excesso de anticorpo com PBS.

Então, novamente, apenas deixe o líquido escorrer e insira-o em sua lavagem PBS. E, novamente, lave três vezes por cinco minutos. Então, após nossas três lavagens de cinco minutos, vamos adicionar nosso anticorpo secundário ao nosso tecido da mesma forma que adicionamos nosso anticorpo primário.

Então, apenas usando volume suficiente para cobrir seus tecidos, adicione seu anticorpo secundário, que estamos usando é anti-coelho de cabra, e mova seu slide de volta para a câmara com umidade controlada. E então estamos usando um anticorpo secundário, que é biotinilado cabra anti coelho, que é essencial quando você está usando o método A BC. Então, transferimos nosso slide para a câmara com umidade controlada e permitimos que ele incube para uma saída.

Portanto, enquanto o anticorpo secundário está incubando, precisamos preparar o reagente A BC. Então, estamos usando os laboratórios de vetores, reagente A, B, C do kit de coloração vetorial. Portanto, remova o reagente e deixe-o cair três vezes em 15 mililitros de PBS, tomando cuidado para não apertar o tubo porque as gotas devem ser medidas especificamente e de um tamanho específico.

Então, depois que seu anticorpo secundário foi incubado por cerca de uma hora, você pega suas lâminas e coloca, lava-as novamente em PBS, assim como fez com seu anticorpo primário. Então, depois de três lavagens de cinco minutos cada, você transfere suas lâminas para este recipiente, onde adiciona seu reagente A, B, C, que você preparou com 30 a 45 minutos de antecedência. E então você apenas adiciona seu reagente A, B, C aqui e preenche seus slides e permite que ele incube por mais 30 a 45 minutos.

Então, depois que seus slides estiverem em a, B, C por cerca de 34 a cinco minutos, queremos lavar o excesso de solução A, B, C. Então, basta remover seus slides e adicioná-los à sua solução PBS. E então queremos repetir o mesmo procedimento de lavagem três vezes no PBS por cinco minutos a cada lavagem.

Enquanto as lâminas estão sendo lavadas, preparo o substrato de peroxidase DAB de laboratórios de vetores. Eu pego o tampão de pH 7,5 e adiciono duas gotas. Após o tampão de pH 7,5, pego o reagente de reação do substrato DAB e adiciono duas gotas dele.

Novamente, o tamanho da gota é crítico, então não aperte a garrafa e apenas deixe as gotas caírem. Duas gotas para tampão pH 7,5. Então você deseja adicionar quatro gotas do reagente de substrato DAB, permitindo que ele também caia.

Você também deseja adicionar no final, você deseja adicionar duas gotas do reagente substrato de peróxido de hidrogênio. Portanto, é assim que a mistura de reagentes de substrato DAB deve ser. Agora está pronto para adicionar aos slides, remover seus slides e permitir que o PBS simplesmente drene seus slides.

Assim, com o tempo, o reagente DAB torna-se mais marrom. Então, queremos adicioná-lo aos nossos slides neste momento. Portanto, pegue volume suficiente para cobrir os tecidos e adicione-o diretamente nas amostras de tecido.

Portanto, basta pegar o volume apropriado e adicioná-lo diretamente sobre suas amostras de tecido e permitir que a solução se desenvolva, pois suas amostras de tecido devem ficar mais marrons com o tempo. Depois de adicionar sua solução DAB, você pode ver nesta seção do cérebro onde o tecido fica marrom aqui e aqui. O DAB marrom em pé revela a região que contém os neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo.

Depois de desenvolver seus slides de dois a 10 minutos, você deseja adicionar seus, então você deseja adicionar seus slides à água gelada para interromper a reação. Portanto, deixe a solução escorrer e adicione seus slides diretamente na água gelada. Depois de mergulhar os slides na água gelada, leve o banho para a pia e coloque água fria nele por aproximadamente cinco minutos para garantir que toda a solução DAB seja drenada deste banho.

Portanto, ao adicionar a pia, tenha cuidado para não deixar o fluxo atingir o lenço de papel e fazê-lo atingir um dos cantos e permitir que ele transborde para que seus lenços não sejam perturbados pelo fluxo de água. Então, depois de remover as lâminas da lavagem, você deve fazer uma contra-mancha. Então, por que você pode querer uma contra-mancha?

Bem, uma razão é que você pode querer ver a estrutura do seu tecido. Outra é visualizar todas as células. Então, para nossos propósitos, vamos combater a coloração com hemat toin, que significa núcleos.

Então, queremos apenas pegar nossas lâminas, remover o excesso de líquido e mergulhá-lo uma vez na solução de Hemat Hematin. Um, retire-o e adicione-o diretamente na água. Depois de adicionar seus slides na água da torneira, você deseja pegá-los e colocá-los debaixo d'água, assim como fez anteriormente com o banho de água gelada.

Portanto, para a lavagem do hemat Toin, deixe-a correr em água corrente até que a água dentro da jarra fique clara. Então, depois de remover nossos escorregadores contra-manchados da água, queremos desidratar novamente nossos escorregadores. E então queremos colocá-lo de volta em nosso gradiente de etanol, mas na ordem inversa.

Então, seria uma lavagem com água deionizada, uma lavagem com 30% de etanol, uma lavagem com 50% de etanol, uma lavagem com 70% de etanol, duas lavagens e 95% de etanol, e duas lavagens e 100% de etanol, cada uma consistindo de dois minutos cada. Portanto, remova as lâminas, limpe o excesso de líquido e adicione-o diretamente ao etanol a 30% e deixe descansar por dois minutos. Então, após a última lavagem com cem por cento de etanol, queremos colocar as lâminas de volta no xileno.

Então pegue seus slides novamente, raspando o excesso de líquido, pegue os slides e adicione-os ao primeiro xileno por cinco minutos. Portanto, serão três lavagens consecutivas de xileno por cinco minutos cada. E agora estamos prontos para montar nossos slides.

Então, o que eu costumo fazer é um minuto antes de as lâminas estarem prontas, pego minha pipeta de pastagem e tiro a solução de montagem permanente, e permito que isso aconteça aproximadamente um minuto antes que minhas lâminas estejam prontas para sair Após a última lavagem de xileno, tomando cuidado para não submergir suas luvas ou molhá-las com xileno, remova-os com uma pinça, tomando cuidado com o lado que contém o tecido. Limpe suavemente o excesso de XLE com um lenço Kim, tomando cuidado para não tocar no lenço, apenas limpe com cuidado nos cantos e nas bordas, permitindo que a maior parte do xileno evapore. Você provavelmente pode trabalhar em dois slides antes que um seque.

Então, quando você terminar de secar uma lâmina, a outra lâmina deve estar pronta para trabalhar. Agora você tem que trabalhar com eles antes que sequem completamente. Então você quer pegar seu perimonte e desenhar uma linha fina ao lado do tecido, tomando cuidado para não tocar no tecido.

Remova o perimount pegando sua lamínula. Aplique em um ângulo de 45 graus e deixe dobrar. Em seguida, deslize a lamínula, certificando-se de que o perimount cubra todos os tecidos.

Em seguida, coloque-o, deite-o e pressione suavemente no centro para remover todo o excesso de bolhas de ar. Deixe-o secar enquanto trabalha em seu segundo tecido é a hora de olhar para nossos slides, não realmente. Portanto, precisamos permitir que a montagem permanente seque durante a noite antes de olhar para nossos slides.

Caso contrário, sob a luz do microscópio, a montagem permanente borbulhará e você estragará sua amostra. Aqui está uma olhada em nossas seções cerebrais após a coloração com produtos químicos, anticorpo policlonal de coelho direcionado contra tirosina hidroxilase. Novamente, a coloração marrom DAB mostra a localização dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo.

A contra-coloração de hematina torna todos os núcleos desse tecido azuis. Acabei de mostrar como corar seções embutidas em parafina utilizando o kit A BC da Vector Laboratories. Agora você vai querer ajustar as condições de acordo com os tipos de tecido que você vai corar e os anticorpos que você vai usar.

Então, boa sorte em seus experimentos.