Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Olá, meu nome é Rob Edwards. Sou o diretor da instalação de microscopia de captura a laser da Universidade da Califórnia em Irvine. Vou descrever para vocês o uso do microscópio de captura a laser que temos aqui.

Nosso instrumento é um Leica A-S-L-M-D, que adquirimos há aproximadamente três anos. Existem dois tipos diferentes de sistemas de captura a laser. Um deles pode ser comparado a um soldador por pontos, no qual se tem um fragmento de tecido sobre uma lâmina de vidro posicionada acima de uma membrana plástica, a qual recobre o tecido.

Uma fonte a laser é então usada para derreter a membrana, efetivamente soldando localmente o tecido à membrana, e em seguida essa membrana é removida, levando consigo o tecido capturado. Ok. Para iniciar o sistema de MCL, ligamos sequencialmente vários instrumentos aqui. Começaremos com a caixa de controle A-S-L-M-D, que é ligada aqui.

Em seguida, ligamos o computador, o que é bastante simples. Se você tiver uma amostra que exija óptica de fluorescência para identificar as células a serem capturadas, deverá ligar a lâmpada de mercúrio para a iluminação de fluorescência. No entanto, não utilizaremos esse recurso nesta demonstração.

Se você deseja capturar imagens de alta qualidade dos espécimes antes e depois, pode-se ligar a câmera spot separadamente bem aqui, após ligar a caixa lógica e o computador; em seguida, liga-se a unidade de controle de potência do laser aqui, que na verdade é ligada por uma chave localizada na parte traseira, na base do instrumento. Por fim, liga-se o monitor do computador. Há diversos controles presentes na tela com os quais você precisará se familiarizar.

Você os usará com bastante frequência. Este é um programa clássico baseado no Microsoft Windows e, portanto, há vários menus que discutiremos. Mas, primeiro, permita-me falar sobre a área de trabalho aqui.

Há uma janela ao vivo que mostrará o que o microscópio está realmente vendo. E ao longo da barra de menu aqui, você pode ver um botão para imagens ao vivo e também um botão de congelamento que pode ser alternado, e então usar o menu de arquivo para capturar imagens fixas de uma parte do tecido, por exemplo, antes da captura e depois da captura, a fim de documentar o tecido que você isolou. O microscópio pode funcionar em modo de campo claro ou em modo de fluorescência, dependendo se você está capturando tecido corado com contra-coloração de hematina ou tecido corado com fluorescência.

Os dois próximos botões incluem o modo espécime, que foca no plano da platina do microscópio, e depois há um modo coletor que remove a lâmina de vidro do caminho e permite visualizar o tecido capturado na parte superior do tubo de coleta. Esta é uma configuração do tipo controle de qualidade. A seguir, na barra de menu, há várias ferramentas de desenho, que você usará para identificar as porções de tecido ou células que deseja capturar.

Em seguida, ao longo do lado direito da tela, há algumas ferramentas adicionais de desenho e captura, incluindo opções de formas de desenho, opções de corte e os botões de controle de corte. Também no painel de controle localizado na parte inferior está o dispositivo coletor, que é a parte do microscópio abaixo da platina, onde se encontram os tubos einor nos quais seu tecido é capturado. Esses quatro botões identificados como A, B, C e D controlam qual tubo deve ser movido diretamente sob o espécime que está sendo capturado.

Este é um exemplo de um tecido de corte congelado típico que foi processado para microdissecção a laser. Estas são seções coronais de uma cabeça embrionária de camundongo que foram capturadas em um lâmina com filme de tinta. Tratava-se de cortes congelados de oito mícrons que, em seguida, foram secos e contracoloridos com hematina e armazenados a menos 80 graus Celsius até o uso.

Para montar essas lâminas no microscópio, o microscópio vem com um suporte especial e lembre-se de que o tecido será capturado em um tubo einor, que fica abaixo do plano da platina. Assim, o tecido está neste lado da lâmina. Na verdade, ele será montado no suporte da lâmina com o lado do tecido voltado para baixo, como mostrado.

O lâmina se encaixa ali e é mantida no lugar pela pressão da mola. E então esta peça intacta, este orifício. O porta-lâminas é colocado sobre a platina do microscópio entre essas duas guias.

Você observará que há um pequeno entalhe que se encaixa sob um clipe na parte traseira da platina, mantendo o espécime no lugar. E ao ser inserido, você sente um clique definido. Ok, a próxima etapa a ser configurada são os tubos einor, que na verdade capturarão o tecido.

Pode-se optar por usar tubos einor de 0,2 ou 0,5 mililitro, e eles se encaixam nesses pequenos suportes, que por sua vez se encaixam nesta bandeja, a qual vai em um compartimento especial sob o estágio. Assim, o tecido será efetivamente capturado dentro da parte superior da tampa do tubo einor. E o tubo einor, estou usando um tubo de 0,5 mililitro para fins ilustrativos aqui.

Então, o capilar é inserido deslizando-o por baixo, dessa forma, e os lábios do capilar são mantidos no lugar por esses dentes, e então o capilar é encaixado por baixo, assim, e todo esse capilar é colocado no suporte. Agora, se alguém estiver capturando ácidos nucleicos, particularmente para o isolamento de RNA, pode-se colocar uma gota de várias centenas de microlitros de uma solução de triol diretamente no capilar. É importante não derramar isso no instrumento, é claro, devido ao fenol e a outros produtos químicos cáusticos presentes no reagente de triol.

Este é o controlador do microscópio, como mencionei anteriormente; os objetivos e a iluminação e o foco são totalmente motorizados neste instrumento. Assim, o botão de foco está aqui na parte superior. O controle de translação em Y para a platina é este botão.

O controle de translação X está aqui. Na parte inferior, à esquerda, está o controle de diafragma, que varia a iluminação, e o microscópio lembra qual nível de iluminação foi definido em cada aumento. Assim, quando você muda de objetiva para objetiva, a iluminação é ajustada automaticamente.

Por fim, no lado direito do controlador, está o controle do revólver de objetivas, que permite alternar entre as objetivas. Este instrumento possui cinco objetivas: uma de 4x, uma de 10x, uma de 20x, uma de 40x e uma de 63x. O primeiro passo para capturar efetivamente o tecido é alinhar o microscópio de modo que o que você vê na tela corresponda exatamente ao que será capturado, a fim de alinhar o microscópio.

Passamos para a opção do menu laser e selecionamos calibrar, aceitamos e clicamos em continuar. Agora estou na configuração quatro x e você pode ver que há uma área relativamente grande de membrana aqui. Observe que não há tecido.

Realizamos o alinhamento em um canto do lâmina. O laser fez um entalhe em forma de cruz no canto superior direito da tela, e usarei o mouse para centralizá-lo nessa tela e, em seguida, clicarei sobre a cruz ou nela e clicarei; o computador cortará outra cruz. Alinharei com essa e clicarei, e então ele cortará uma terceira cruz, e nela faremos o alinhamento.

A calibração para o objetivo de quatro vezes agora está completa para o microscópio, que agora está alinhado e pronto para realmente capturar o tecido. Você pode ter notado durante o processo de alinhamento que as cruzetas que estavam sendo cortadas eram bastante grossas. E isso ocorre porque a potência de controle do laser estava definida em um nível muito alto.

Provavelmente não precisamos desse grau de potência de corte. Assim, vou demonstrar como se ajusta a potência do laser cortando uma linha. Se eu desenhar à mão livre uma linha diagonal na tela, selecionar uma tampa e depois clicar em iniciar corte, o computador fará o corte ao longo da linha que defini.

E você pode ver quão larga é essa linha. Preciso reduzir a potência do laser. Faça isso.

Vou ao menu do laser, acesso o controle e você notará que a intensidade foi ajustada ao máximo. Vou reduzir a intensidade do laser para aproximadamente 30 ou algo em torno disso e aceitarei essa configuração. Agora, se eu traçar uma nova linha e cortá-la, você verá que a largura do tecido queimado ou da membrana queimada é consideravelmente menor.

E, portanto, como princípio geral, deseja-se ajustar a potência de controle do laser ao nível mais baixo possível para minimizar a quantidade de tecido que está sendo vaporizada. Agora demonstrarei a captura real de um tecido utilizando este olho espelhado. Estou atualmente com a lente objetiva Forex e tentarei capturar uma porção relativamente grande de tecido.

Vamos isolar toda a lente do centro deste olho. Para isso, farei um corte manual. Utilizando o controle de desenho na parte superior da tela, realizarei o corte.

Vou desenhar uma linha ao redor do espécime a ser capturado. Estou fazendo isso com uma ampliação muito baixa. Se alguém tiver interesse em cortes mais precisos ou em áreas menores de tecido, obviamente pode capturar com uma ampliação maior.

Então, selecionei a área a ser cortada e agora vou até o menu desenhar formas; normalmente mantenho a opção de linhas fechadas ativada. O que a opção de linhas fechadas faz é, caso se desenhe uma forma irregular ao redor de algo sem envolver completamente o objeto a ser capturado, traçar uma linha reta entre as extremidades abertas da forma. Assim, com a área a ser cortada identificada, iniciaremos então o processo de corte e você verá que a caixa de controle focaliza o laser através das áreas e corta quase completamente.

Costumamos ter uma borda solta frequentemente ao capturar grandes fragmentos de tecido. Nem sempre se obtém uma separação completa do tecido. Portanto, a primeira coisa a tentar é cortar novamente, e o laser seguirá ao redor do tecido.

Às vezes, você pode simplesmente, onde estiver pendurado, desenhar um pequeno espaço e cortar isso, fazendo com que ele caia. Assim, agora capturamos esta porção de tecido. Como mencionei anteriormente, podemos ir para o modo coletor e verificar se esse pedaço de tecido está, de fato, no coletor ou na tampa do tubo einor.

Então, vou até aqui no botão de controle do coletor, pressioná-lo, e você verá que o microscópio agora mudará a visualização. E agora estamos observando a superfície interna do tubo eior, e há o fragmento de tecido capturado na porção inferior direita da tela; ao focar, conseguimos ver as células individuais. Assim, confirmamos que, de fato, capturamos o tecido que selecionamos.

Agora, o processo de captura não ocorre com eficiência de cem por cento, porque esses tecidos que estão sendo capturados são essencialmente como folhas caindo. Uma pequena porcentagem certa de fragmentos de tecido capturados não cairá dentro da tampa do tubo einor, mas a taxa de perda é muito baixa uma vez que se concluiu a captura do tecido desejado. O próximo passo, é claro, é remover o tubo einor com o tecido capturado do instrumento e tampá-lo com segurança.

E para fazer isso, puxamos muito suavemente para fora, em linha reta, no suporte, assim. E então, lembrando-se de manter a tampa do tubo na posição vertical, remova o suporte da bandeja e, em seguida, puxe suavemente o tubo para fora. Deslize assim, retire-o do suporte e depois mova o einor, não a tampa, assim.

Agora, se você já tiver colocado uma gota de triol na tampa, seu tecido já começará o processo de solubilização e você poderá retornar ao seu laboratório e concluir o seu isolamento de RNA. Há diversos fabricantes que produzem kits de isolamento de RNA em microescala, como a Amon, que é a fabricante que nós preferimos. E é só isso.

Hoje, mostrei a vocês a instalação do microscópio de captura a laser aqui na UC Irvine. Demonstramos como capturar tecidos em cortes congelados de lâminas revestidas com folha de alumínio, em preparação para o isolamento de RNA a partir desse tecido. Agradecemos sua atenção e desejamos boa sorte com sua própria microdissecção a laser.