Name: Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Aprenda a realizar teste de susceptibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis usando diluição em caldo em placa de microtitulação. Este método determina a CIM de 12 drogas simultaneamente para orientar o tratamento da tuberculose.

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Gostaríamos de agradecer aos técnicos de laboratório da Clínica Mayo Micobactérias laboratório por sua ajuda durante o estudo.

Cada laboratório deve realizar uma avaliação de risco, em colaboração com o seu Diretor de Segurança Institucional biológica para determinar o nível de biossegurança adequado para preparação do inóculo e para a pipetagem do inóculo na placa. Em nosso laboratório, utilizamos nível de biossegurança 3 de laboratório (BSL3) práticas até as placas de microtitulação são inoculados, e selada com um selo adesivo de plástico. Estas placas são então colocados dentro de um saco plástico, que é o calor, também lacrado. Incubação e interpretação da leitura da placa de microtitulação, é realizado em um laboratório de nível de segurança 2 (BSL2). 1. Rotulagem de materiais <ol><li> Rotular uma placa de ágar sangue, três Middlebrook 7H10 placas, Middlebrook 7H9 caldo, uma solução salina entre tubo de vidro e um talão de microtitulação placa AST com os identificadores apropriados (por exemplo, nome do paciente, número do prontuário) na BSL2. </li><li> Rótulo agar sangue e 7H10 banhado como "check pureza". Contagem de colônias periódica do inóculo são recomendadas para garantir que uma concentração adequada de organismos é usado no teste. Contagem de colônias quando realizada precisará ter duas das placas 7H10 rotulada com "contagem 01/01 colônia" e "Contagem de 1 / 50 colônia". </li></ol> 2. Preparações tecnólogo de ir para o BSL3 <ol><li> Equipamentos de proteção individual apropriado é necessário para trabalhar no BSL3 e inclui sólido frente vestido, cobrir a cabeça, luvas, propés, e um respirador. Cada instituição deverá estabelecer o seu plano de proteção respiratória própria em colaboração com a sua instituição oficial de Higiene Industrial. Em nosso laboratório, temos vários respiradores disponíveis, incluindo os respiradores purificadores de ar alimentado (PAPRs) e equipado com filtro HEPA, N95 meia-face respiradores. </li></ol> 3. Preparação da cabine de segurança biológica <ol><li> No BSL3, prepare o gabinete de segurança biológica (CSB) por desinfecção da superfície e colocando uma toalha de papel embebido com desinfetante aproximadamente 6 polegadas a partir do painel de ventilação de ar. </li><li> Coloque um recipiente do lado esquerdo, e nephlometer pequenas e vortexer à direita. </li><li> Loops inoculação, pipetors e dicas são colocados ao lado da toalha de papel. </li><li> Coloque um rack com o organismo (em caldo ou em meio sólido) e do padrão de McFarland 0,5 na toalha de papel. </li></ol> 4. Calibração do nefelômetro <ol><li> Coloque um tubo de vidro de soro fisiológico entre talão na nefelômetro e defina o instrumento para zero usando o espaço em branco entre salina. </li><li> Coloque o padrão de McFarland 0,5 na nefelômetro e calibrar de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 5. Preparação do inóculo <ol><li> Trabalhando nas colônias BSC, raspe a partir de meio sólido de uma agulha esterilizada para a solução salina tween devidamente rotulados de vidro do tubo até que um talão ≥ 0,5 McFarland padrão é obtido. </li><li> Inspecionar visualmente a amostra, e comparar com o padrão McFarland. </li><li> Amostra Vortex por 30-60 segundos. </li><li> Permitir que o inóculo de se contentar com 15 minutos (definir um temporizador). </li></ol> 6. Inoculação da placa de microtitulação <ol><li> Ajustar o inóculo com caldo de solução salina entre usando o nefelômetro calibrado para o McFarland 0,5 em passos de 4.1 e 4.2. Este deve ser concluída dentro de 30 minutos (por especificações do fabricante). </li><li> Use uma pipeta 200 mL e uma longa aerosol ponta da pipeta resistente a remover 100 mL de inóculo do rd 03/01 TOP do tubo de soro fisiológico entre talão. Inocular o caldo Middlebrook 7H9. Lentamente vortex o caldo 7H9 inoculados por 20 segundos. </li><li> Remova a placa de microtitulação AST da embalagem do fabricante. Não use se o dessecante é azul ou se o pacote folha está danificado. </li><li> Prepare um tubo de diluição 1:50 para uso posterior na preparação da diluição 1:50 pipetando 50 mL de água estéril em um tubo estéril. </li><li> Com cuidado, despeje o caldo 7H9 inóculo em uma calha. Evitar a geração de aerossóis. </li><li> Coloque a placa de microtitulação AST com o rótulo voltado para você. </li><li> Use uma pipeta de 12 canais para adicionar 100 mL do inóculo em cada poço. </li><li> Preparar diluições para contagem de colônias: <ol type="a"><li> A diluição de 1 / 1 é preparado a partir do controlo positivo bem (H12) por listras 1 loop mL sobre a placa 7H10 rotulados como "01/01". </li><li> A diluição de 1 / 50 é preparada através da inoculação de um loop 1 ml de controle positivo bem (H12) e rodando-o no tubo com 50 ul de tubo de água preparada anteriormente. ML raia 1 do presente de diluição para a chapa denominada "1 / 50". </li></ol></li><li> Inocular as placas pureza da calha pipetando 50 mL em um ágar sangue devidamente rotulados e placa 7H10 e raia para o isolamento. </li><li> Lugarum selo adesivo na placa de microtitulação AST. Pressione firmemente cada poço para garantir vedação adequada usando o fundo branco do selo. Evitar vincos. </li><li> Desinfetar a placa de microtitulação esfregando-o com uma toalha de papel embebido com um desinfectante tuberculocida e placa de microtitulação lugar em um saco plástico e feche com um selo de calor ou fita. <ol type="a"><li> O saco de plástico serve como um recipiente secundário para garantir que todo o caldo está contido deve haver um vazamento ou derramamento do prato principal. </li></ol></li></ol> 7. Desinfecção de materiais e cabines de segurança biológica <ol><li> Para evitar a produção de aerossóis, coloque outra calha na parte superior da calha inoculados antes de colocar o suavemente para dentro do recipiente de descarte. </li><li> Desinfetar todos os materiais, incluindo nephlometer, vortexer, chapas, tubos, etc, limpando-se com um desinfectante tuberculocida e esperar o momento adequado para garantir a desinfecção de acordo com as instruções do fabricante antes de remover a partir do BSC. Por exemplo, Prospray, o desinfetante tuberculocida que usamos, requer 15 minutos para matar micobactérias. </li><li> Coloque o recipiente de descarte em um saco de risco biológico e vedação antes da autoclavagem. </li></ol> 8. Incubação <ol><li> As placas devem ser incubadas com meio para baixo e deve ser tomado cuidado para evitar derramamento ou respingos qualquer líquido. </li><li> Incubar a placa AST placa de microtitulação, 7H10 e placas de ágar sangue em uma incubadora de 35-37 ° C com 5-10% CO 2 com CO 2 em 5-10% do laboratório BSL2. <ol class="lalpha"><li> Em nosso laboratório, isso é aceitável, porque a placa é bem fechados e dentro de um saco plástico selado. </li></ol></li><li> Não mais do que duas placas de microtitulação AST devem ser empilhadas na incubadora de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 9. Resultados representativos Interpretação dos resultados: Placas de microtitulação selada AST podem ser lidos manualmente usando um espelho como uma ajuda ou com um leitor automático de placas, como a Vizion (TREK Diagnostics). As placas podem ser examinados logo 7 dias após a inoculação. Examine os poços controlar o crescimento em posições H11 e H12 para determinar se eles são positivos (ou seja, têm um depósito de células no fundo do poço). Se a poços de controlo de crescimento não são positivas, reincubate a placa e re-examinar periodicamente (por exemplo, dia 10, dia 14) até a poços de controlo de crescimento são positivas. <ol type="a"><li> Espelho leia-se: <ol type="i"><li> Lugar selado AST placa de microtitulação para a plataforma; </li><li> Leia poços de controlo de crescimento após 7 dias de incubação, se este for negativo, reincubate AST placa de microtitulação; </li><li> Se os controles de crescimento são aceitáveis, em seguida, ler os poços de drogas que contêm. Para para cada droga, gravar primeira diluição que não tem crescimento, comparando os poços de drogas com o controle do crescimento. </li><li> Crescimento aparece como turbidez ou como um depósito de células no fundo de um poço. </li></ol></li><li> Instrumento de leitura: siga as instruções do fabricante; as instruções abaixo são um exemplo de como a leitura seria feita com a plataforma Vizion: <ol type="i"><li> Log in </li><li> Use "MYCOTB" software placa AST. </li><li> Coloque a placa selada com o código de barras voltado para o usuário. Crescimento aparece como turbidez ou como um depósito de células no fundo de um poço. </li><li> Leia controla o crescimento, se este for negativo, reincubate AST placa de microtitulação; se positivo ler a placa ao tocar a tela com o primeiro poço de cada medicamento que não apresenta crescimento. </li></ol></li></ol> Leia as placas pureza. A placa de ágar sangue não deve apresentar crescimento após 48 horas ea placa de pureza 7H10 deve ter crescimento confluente de um tipo de organismo. Se contaminados, o teste de microtitulação AST precisa ser repetido a partir de uma cultura pura. Calcule contagem de colônias a partir do controle positivo bem usando a tabela abaixo: Chave Contagem de Colônia <table border="1"><tbody><tr><td> # Colônias contou com placa rotulados como "01/01" </td><td> # Colônias contou com placa rotulado como "1 / 50" </td><td> Inóculo Contagem de Colônia (UFC / mL) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 5-10 </td><td> 0-2 </td><td> 5 X 10 4 a 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 X 10 5 de 5 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> Pode haver fuga com para-aminossalicílico em algumas cepas de Mycobacterium tuberculosis. Isto pode ser interpretado, olhando para todos os poços que têm pellets e usando o primeiro poço que tem o mesmo tamanho da pelota como a diluição seguinte como o ponto final. A resistência é rara com este medicamento. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Resultados representativos usando a placa MYCOTB. <table border="1"><tbody><tr><td> Abreviatura de drogas </td><td> Droga </td><td> Μ MIC / mL </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moxifloxacina </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampicina </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> amicacina </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> estreptomicina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutina </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> p-aminossalicílico </td><td> ≤ 0,5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> etionamida </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> cicloserina </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazida </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> canamicina </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> etambutol </td><td> 4,0 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
<li>HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services+Centers+for+Disease+and+Preventions%22">U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions</a>. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).</li>
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<li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+Evaluation+of+the+MB%2FBACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li>
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<li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li>
</ol>

Um exemplo de uma placa de microtitulação AST que controla o crescimento positivo é mostrado na Figura 1 e do MIC endpoint (mg / ml) para cada droga é um círculo. Um estudo realizado em nosso laboratório indicaram que a placa de microtitulação AST método é equivalente ao método de proporção padrão agar ouro para testes de susceptibilidade do Mycobacterium tuberculosis. Mais rápido relato dos resultados foi obtida com microtitulação placa de microtitulação AST quando comparado ao método tradicional agar proporção com a interpretação final para AST placa de microtitulação e método das proporções em ágar 14 e 21 dias, respectivamente.A AST placa de microtitulação tem a vantagem de testar primeiro e segunda linha de medicamentos simultaneamente, o que pode ajudar a prevenir morosidade excessiva com cepas resistentes. O AST placa de microtitulação também é muito mais fácil de configurar e ler que a APM e ambos espelho um manual e um sistema semi-automático como o Vizion pode ser usado para ler as placas. A disponibilidade de um valor de MIC para TB testes de resistência poderiam fornecer novas informações valiosas para os médicos em relação ao valor tradicional concentração crítica, especialmente para aqueles isolados com susceptibilidade &quot;borderline&quot;.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Placas de microtitulação AST e selo adesivo </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> Padrão de McFarland 0,5 </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 placas </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Agar Plates sangue </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Estéril loops 1 mL </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Loops estéril 10 L </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween caldo de contas de vidro </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC Caldo </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Dicas longo Pipetar </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Cochos estéril </td><td> TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Dicas de 1000, 20, 20 mL </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta multicanal </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de CO% 05-10 fevereiro </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Sacos de plástico, pequena, CO 2 permeáveis </td><td> Poly Plásticos, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> Desinfetante TB (Tais como ProSpray C-60) </td><td> Certol International, Commerce City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Box espelho Leitor </td><td> Pescador </td><td></td></tr></tbody></table>

teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo mycobacterium tuberculosis da droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

A rápida detecção de resistência aos antimicrobianos é importante no esforço para controlar o aumento da resistência do Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Testes de susceptibilidade antimicrobiana (AST) de Mtb tem sido tradicionalmente realizada pelo método de agar de proporção ou por meio de testes macrobroth em um instrumento como o BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) ou BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). O método das proporções em ágar, enquanto considerado o padrão &quot;ouro&quot; da AST, é trabalhoso e requer o cálculo de resistência através da realização de contagem de colônias em ágar contendo drogas em relação ao livre de drogas agar. Se houver ≥ crescimento de 1% no meio de drogas que contêm, em comparação com drogas meio livre, o organismo é considerado resistente a esta droga. Os métodos macrobroth requerem instrumentação e ponto de teste de quebra (&quot;crítica&quot;), as concentrações da droga para os medicamentos de primeira linha (isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida). O método descrito aqui é comercialmente disponível em um formato de 96 poços de microtitulação placa [MYCOTB (TREK Diagnostics)] e contém concentrações crescentes de 12 antimicrobianos utilizados para o tratamento de tuberculose, incluindo ambos os primeiro (isoniazida, rifampicina, etambutol) e medicamentos de segunda linha (amicacina, cicloserina, etionamida, canamicina, a moxifloxacina, ofloxacina, para-aminossalicílico, rifabutina, e estreptomicina). Pirazinamida, uma droga de primeira linha, não está incluído na placa de microtitulação, devido à sua necessidade de condições de teste ácido. Vantagens do sistema de microtitulação incluem tanto a facilidade de configurar e mais rápido por sua vez em torno do tempo (14 dias) em comparação com proporção tradicionais com ágar (21 dias). Além disso, a placa pode ser configurada a partir de inóculo preparado usando o caldo de carne ou meio sólido. Desde o formato microplaca é novo e desde Mtb apresenta desafios únicos de segurança no laboratório, este protocolo irá descrever como a segurança de instalação, incubar e ler a placa de microtitulação.

Testes de susceptibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis é um desafio, mas fundamental para o atendimento ao paciente. Este formato de placa de microtitulação oferece testes de 12 drogas antimicobacterianos e fornece concentração inibitória mínima (MIC) valores, o que ajudará no tratamento adequado.

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

A detecção rápida da resistência antimicrobiana é importante no esforço para controlar o aumento de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) resistentes. ...

Existem relativamente poucos medicamentos disponíveis para tratar o Mycobacterium tuberculosis, portanto, a resistência a qualquer fármaco é uma preocupação. Este artigo em vídeo descreve um procedimento para testar a resistência antibiótica do M. tuberculosis a 12 medicamentos antimicrobianos diferentes simultaneamente. Assim, a capacidade de detectar rapidamente a resistência antimicrobiana do M. tuberculosis é muito importante no esforço para controlar o aumento de cepas resistentes. Aqui, para testar a suscetibilidade aos antibióticos.M. tuberculosis é inicialmente cultivado em meio sólido ou em caldo, uma suspensão bacteriana. O inóculo é preparado e adicionado a uma placa de microtitulação contendo diferentes concentrações de 12 fármacos, incluindo medicamentos de primeira e segunda linha. Após a incubação, o grau de crescimento em cada poço é determinado manualmente com o auxílio de uma caixa de espelhos ou por meio de um leitor de placas semiautomatizado.Os dados resultantes indicam a concentração inibitória mínima para cada medicamento testado e mostram a quais antibióticos a cepa testada de TB é resistente. Esses resultados auxiliam na escolha do medicamento apropriado para o tratamento da TB. Olá, meu nome é Nancy Ek e sou diretora do Laboratório de Micobacteriologia da Clínica Mayo em Rochester, Minnesota.Hoje vamos descrever um método para realização de testes de suscetibilidade a antibióticos para Mycobacterium tuberculosis. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a diluição em caldo macro, é que uma MIC é determinada para cada fármaco e 12 antibióticos são testados simultaneamente. A demonstração do procedimento será feita por Kurt Jude, especialista em controle de qualidade do meu laboratório, trabalhando em uma bancada de laboratório.Prepare-se para este procedimento rotulando uma placa de ágar sangue, três placas Middlebrooks sete H 10, um tubo de vidro com esferas de vidro contendo salina tween e uma placa de microtitulação com o nome do paciente e o número de identificação da amostra. Além disso, rotule as placas de ágar sangue e as placas sete H 10 como pureza. Marque uma dessas placas sete H 10 como contagem de colônias um para um e a outra como contagem de colônias um para 50.Em seguida, coloque a bandeja no pass-through. Depois, prepare-se para trabalhar na instalação de biossegurança nível três (BSL-3) colocando uma capa com frente fechada, touca, luvas, capas para sapatos e um respirador. Aqui, utiliza-se um respirador PAPR.Em seguida, retire a bandeja do pass-through. Depois, na instalação de BSL 3, desinfete a superfície da cabine de segurança biológica. Em seguida, coloque uma toalha de papel embebida com desinfetante dentro da capela, aproximadamente a seis polegadas do painel do ventilador de ar, ao lado da toalha de papel.Coloque alças de inoculação, pipetas e ponteiras, um recipiente apropriado para descarte de resíduos, um néfi, TER e um vórtex. Após o preparo da cabine, posicione o organismo sobre a toalha de papel juntamente com um suporte contendo um padrão McFarland 0,5, um caldo sete H nove com OADC e um tubo de bolas salinas. Esta montagem é feita a partir de meio sólido.Prepare o inóculo a partir de uma cultura em meio sólido obtida de uma amostra do paciente. Use um alça estéril para raspar as colônias e transferi-las para o tubo de vidro contendo salina com tween e esferas de vidro. Vortexe a suspensão por 30 a 60 segundos.Inspecione visualmente a amostra, comparando-a ao padrão de McFarland. A quantidade transferida deve ser igual ou maior que a do padrão. Caso contrário, adicione mais da amostra bacteriana e vortexe novamente.Uma vez que o padrão de McFarland seja ajustado, deixe o inóculo decantar por 15 minutos para permitir que os agregados maiores de bactérias sedimentem. Em seguida, utilize um nefi TER para zerar a densidade das bactérias em suspensão. O nephi ter.Primeiro, coloque um tubo em branco com perlas salinas Tween no Nephi ter. Pressione o botão de calibração para zerar o instrumento, depois coloque o padrão McFarland 0,5 no Nephi ter e pressione o botão de calibração novamente. Após a calibração do instrumento, remova o padrão McFarland e insira o inóculo.A leitura do inóculo deve ser igual à leitura do padrão de McFarland. Se a leitura for muito baixa, remova o tubo e transfira mais bactérias da placa. Em seguida, vortexe e leia a amostra novamente.Se a leitura for muito alta, adicione salina tween ao tubo e vortex. Em seguida, leia a amostra novamente. Continue ajustando o inóculo conforme necessário até que a concentração das bactérias corresponda ao padrão de McFarland.Em seguida, utilize uma pipeta de 200 microlitros e uma ponteira longa resistente a aerossóis para remover 100 microlitros do inóculo do terço superior do tubo. Para evitar grumos que estejam sedimentando no fundo, inocular o caldo Middlebrook 7H9 e vórtexar lentamente o caldo inoculado por 20 segundos para plaquear o inóculo. Comece removendo a placa de microtitulação da embalagem do fabricante. Se o dessecante estiver azul ou se a embalagem de folha estiver danificada, não a utilize.A placa já contém os 12 antimicrobianos a serem testados em cada poço, incluindo as drogas mais eficazes ou de primeira linha e as drogas de segunda linha. Despeje cuidadosamente o inóculo de caldo H nove em um trth, tomando cuidado para não gerar aerossóis. Em seguida, posicione a placa de microtitulação com o rótulo voltado para fora, como mostrado aqui, e use um pipetador de 12 canais para adicionar 100 microlitros do inóculo a cada poço.Em seguida, prepare placas para realizar contagens de colônias. Primeiro, prepare uma placa não diluída transferindo um alça de um microlitro da amostra do poço do controle positivo para a placa H 10 sete rotulada um para um. Em seguida, use a alça para semear a placa conforme mostrado aqui.Em seguida, para preparar uma diluição de um para 50, transfira um alça de um microlitro do poço controle positivo e agite-a no tubo contendo 50 microlitros de água de estria. Coloque um microlitro dessa diluição na placa rotulada um para 50. Inocule as placas de pureza pipetando 50 microlitros do inóculo do trth para placas de ágar sangue e placas 7 H 10 devidamente rotuladas e estrie para isolamento.Em seguida, empilhe outro trth sobre o trth inoculado e coloque-os suavemente no recipiente de descarte. Coloque um selo adesivo na placa de microtitulação. Depois, utilizando o suporte branco, pressione firmemente cada poço para garantir um vedamento adequado, assegurando que não haja dobras.Desinfete a placa de microtitulação limpando-a com uma toalha de papel embebida em desinfetante bactericida para tuberculose. Em seguida, coloque a placa de microtitulação em um saco plástico e feche-o com selagem térmica. Por fim, desinfete todos os materiais, incluindo o nefi, o vórtex, as placas e os tubos, limpando-os com um desinfetante bactericida para tuberculose.Aqui, o pro spray é usado após um tempo suficiente ter passado para garantir a desinfecção. 15 minutos para o pro spray. As placas são vedadas com fita adesiva, colocadas em sacos plásticos e os materiais selados são removidos da cabine de segurança biológica e colocados na câmara de passagem.O saco vermelho de descarte é fechado e selado com um prendedor de torção neste momento, retire o avental, as sapatilhas e as luvas. Após seguir para a sala de antecâmara e lavar as mãos, remova o respirador, desinfete-o e guarde-o após lavar as mãos novamente, coloque um avental novo e saia da sala de nível de biossegurança três. Em seguida, o recipiente de descarte é autoclavado.A seguir, incubar a placa de microtitulação e as sete placas H 10 e de escavação sanguínea com a face para cima no incubador a 35 a 37 graus Celsius com 5 a 10% de CO2 no laboratório BSL dois. Isso é aceitável porque a placa está bem selada e dentro de um saco plástico. O tempo de geração do Mycobacterium tuberculosis é de aproximadamente 12 a 24 horas, portanto, será necessário pelo menos uma semana antes que o crescimento possa ser observado na forma de um pellet celular no fundo do poço controle. No dia 10, realizar uma leitura manual com espelho colocando a placa selada de microtitulação AST na plataforma da caixa de espelho.Use uma lâmpada de mesa para ajudar a visualizar o crescimento, ajustando conforme necessário para obter o melhor contraste. Verifique os poços de controle de crescimento, neste caso, H 11 e H 12, observando no espelho. Se houver crescimento, o poço parecerá turvo ou parecerá ter sedimento, como mostrado aqui.Se não houver crescimento, como mostrado neste exemplo, o poço parecerá estar claro. Nesse caso, devolva a placa ao incubador e continue a incubação por até 21 dias. Para cada condição, compare o crescimento com o controle.Bem, então, para cada registro de medicamento, a primeira diluição que não apresenta crescimento. Esta é a concentração inibitória mínima, ou CIM, do medicamento para examinar os resultados usando um leitor automático de placas, como o Vision. Comece abrindo o software Myco TB a ST Plate e fazendo login. Coloque a placa selada com o código de barras voltado para fora. Conforme mostrado aqui, o crescimento aparece como turvação ou como um depósito de células no fundo de um poço na tela do computador.Primeiro, examine os controles de crescimento. Como antes. Se este for negativo para crescimento, devolva a placa ao incubador por até 21 dias.Se for positivo, registre os resultados tocando no primeiro poço que não apresenta crescimento na tela, para cada medicamento. Em alguns casos, bactérias, sedimento ou medicamentos precipitam no fundo do poço. Esse fenômeno, conhecido como trailing, é indicado por vários poços com pelotas do mesmo tamanho e não é considerado crescimento positivo.Em seguida, as sete placas de H 10 e ágar sangue são examinadas para determinar as concentrações bacterianas e avaliar a pureza. A placa de ágar sangue não deve apresentar crescimento após 48 horas. O crescimento na placa de ágar sangue indica contaminação com bactérias de crescimento rápido.Se houver crescimento, o teste em microplaca deve ser repetido. A placa de pureza H 10 deve apresentar crescimento de um único organismo. O tipo EM de tuberculose deve parecer acastanhado, colorido, enrugado e áspero. Se houver contaminação, o teste em microplaca precisa ser repetido a partir de uma cultura pura.Para avaliar a concentração bacteriana, conte as colônias na placa H 10 sete. Em seguida, utilizando a tabela no documento escrito anexo, calcule as contagens de colônias. Mycobacterium tuberculosis foi cultivado a partir de um espécime de paciente e a resistência a antibióticos foi avaliada conforme descrito neste vídeo; na placa mostrada aqui, 12 medicamentos diferentes estão presentes em concentrações crescentes, com as concentrações mais altas na parte superior e as mais baixas na parte inferior.A concentração inibitória mínima, ou CIM do fármaco, foi indicada pela menor concentração do fármaco que não apresentou qualquer crescimento e está circulada na imagem mostrada aqui, utilizando pontos de corte padronizados estabelecidos pelo Clinical and Laboratory Standards Institute. Os dados aqui apresentados sugerem que esta cepa de TB será resistente à Isid e à Rifampina. In vitro, as altas CIMs observadas em diversos outros fármacos, incluindo oin, moxifloxacina, estreptomicina e rifabutina, sugerem a resistência da cepa de tuberculose EM a esses agentes.Os resultados do MIC devem ser utilizados por um especialista em doenças infecciosas com experiência no tratamento da tuberculose para desenvolver um plano de tratamento individualizado. Uma vez dominada, esta técnica leva cerca de 40 minutos para preparar um isolado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este é um patógeno respiratório e que, ao realizar a semeadura, você pode gerar aerossóis. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o teste de suscetibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis utilizando o método de microdiluição em caldo. Não se esqueça de que trabalhar com Mycobacterium tuberculosis pode ser extremamente perigoso, e precauções, como proteção respiratória, devem sempre ser tomadas quando exigidas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A observação microscópica de drogas susceptibilidade-ensaio (MODS) é uma low-cost, low-tech ferramenta de alto desempenho para detecção de tuberculose (TB) e tuberculose multirresistente (TBMR). Este vídeo descreve o MODS líquido método de cultura de mídia.

O método MODS para o diagnóstico da tuberculose e da tuberculose resistente a múltiplas drogas

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Fonte: Koeth, L. M., et. al., Um método de microdiluição de caldo de referência para teste de suscetibilidade in vitro de dalbavancina de bactérias que crescem aeróbicas. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demonstra o método de microdiluição em caldo para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de um antibiótico lipoglicopeptídico contra bactérias Gram-positivas. Abrange o isolamento de colônias bacterianas, diluição, inoculação de poços de microplacas com concentrações variadas de...

Um método de microdiluição em caldo para teste de suscetibilidade a antibióticos de bactérias Gram-positivas

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar a eficácia de medicamentos contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  É gerado um modelo de infecção in vitro contendo agregados de Mtb/macrófagos que mimetiza a infecção in vivo. Após a introdução de antibióticos adequados, sua eficácia é testada por meio do ensaio de resuzarina para monitorar a sobrevivência das bactérias com o aumento das concentrações de drogas.

Um ensaio para avaliar a eficácia do medicamento contra um modelo de infecção por Mycobacterium tuberculosis

Este vídeo demonstra um ensaio em caldo para determinar a eficácia do antibiótico contra o Mycobacterium tuberculosis. A cultura bacteriana é incubada com diferentes concentrações de um antibiótico bactericida. A eficácia bactericida é medida avaliando a presença de bactérias viáveis usando um ensaio de resazurina.

Avaliando a eficácia de um composto de teste contra micobactérias em caldo

O charcoal agar resazurin assay (CARA) é um método semiquantitativo de médio rendimento para avaliar a atividade de agentes de teste contra micobactérias que são replicantes, não replicantes ou ambas.  O CARA permite uma avaliação rápida da atividade dependente do tempo e da concentração e identifica os parâmetros a serem seguidos pelos ensaios de unidade formadora de colônias (UFC).

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

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Aqui, apresentamos um protocolo para identificar potenciais candidatos a medicamentos antituberculosos por meio de triagem fenotípica, abrangendo a síntese química de um composto de 4-aminoquinolina, a determinação de sua concentração inibitória mínima contra Mycobacterium tuberculosis e a avaliação de sua citotoxicidade em linhagens celulares de mamíferos.

Identificação de Potenciais Candidatos Anti-TB: Um Guia Passo a Passo para Síntese, Determinação de CMI e Avaliação de Citotoxicidade em Células de Mamíferos

Aprenda a realizar teste de susceptibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis usando diluição em caldo em placa de microtitulação. Este método determina a CIM de 12 drogas simultaneamente para orientar o tratamento da tuberculose.

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação (Vídeo) | JoVE Journal

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

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