Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

Existem relativamente poucos medicamentos disponíveis para tratar o Mycobacterium tuberculosis, portanto, a resistência a qualquer medicamento é uma preocupação. Este artigo em vídeo descreve um procedimento para testar a resistência a antibióticos de M tuberculosis a 12 drogas microbianas diferentes simultaneamente. Assim, a capacidade de detectar rapidamente a resistência antimicrobiana de M tuberculosis é muito importante no esforço de controlar o aumento de cepas de resistência aqui para testar a suscetibilidade a antibióticos.

M tuberculosis é cultivado primeiro em meio sólido ou em caldo, uma suspensão bacteriana. O inóculo é preparado e adicionado a uma placa de microtitulação contendo diferentes concentrações de 12 medicamentos, incluindo medicamentos de primeira e segunda linha Após a incubação. A extensão do crescimento em cada poço é determinada manualmente usando uma caixa de espelho ou usando um leitor de placas semi-automatizado.

Os dados resultantes indicam a concentração inibitória mínima para cada droga testada e mostram a quais antibióticos a cepa de TB testada é resistente. Esses resultados auxiliam na escolha do medicamento adequado para o tratamento da tuberculose. Olá, meu nome é Nancy Ek e sou diretora do Laboratório de Bacteriologia Myco da Mayo Clinic em Rochester, Minnesota.

Hoje vamos descrever um método para fazer testes de suscetibilidade a antibióticos para Mycobacterium tuberculosis. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a diluição de macro caldo, é que um MIC é determinado para cada medicamento e 12 antibióticos são testados simultaneamente. Demonstrando o procedimento estará Kurt Jude, um especialista em qualidade em meu laboratório, trabalhando em uma bancada de laboratório.

Prepare-se para este procedimento rotulando uma placa de ágar sangue, três placas Middlebrooks sete H 10, um tubo de esferas de vidro de interpolação salina e uma placa de microtitulação com o nome do paciente e o número de identificação da amostra. Além disso, rotule o ágar sangue e sete placas H 10 como pureza. Verifique o rótulo de uma dessas sete placas H 10 como uma para uma contagem de colônias e a outra como uma para 50 contagem de colônias.

Em seguida, coloque a bandeja na passagem. Em seguida, prepare-se para trabalhar na instalação de nível três de biossegurança BSL três, vestindo um avental frontal sólido, luvas de cobertura de cabeça, capas de sapato e um respirador. Aqui, um respirador pappa é usado.

Em seguida, recupere a bandeja da passagem. Em seguida, nas três instalações da BSL, desinfete a superfície do gabinete de segurança biológica. Em seguida, coloque uma toalha de papel embebida em desinfetante dentro do capô, a aproximadamente quinze centímetros do painel de ventilação ao lado da toalha de papel.

Coloque alças de inoculação, pipetas e pontas, um recipiente apropriado para descarte de resíduos, um néfi, TER e um vórtice. Uma vez que o capuz esteja preparado, coloque o organismo na toalha de papel junto com um rack com um caldo McFarland 0.5 padrão A seven H nine com OADC e um tubo de cordão salino. Esta configuração é feita a partir de sólido, médio.

Prepare o inóculo a partir de uma cultura de meio sólido a partir da amostra de um paciente. Use um laço estéril para raspar as colônias e transferi-las para o tubo de esferas de vidro de interpolação salina. Vortex a suspensão por 30 a 60 segundos.

Inspecione visualmente a amostra, comparando-a com o padrão McFarland. O valor transferido deve ser igual ou superior ao padrão. Caso contrário, adicione mais da amostra bacteriana e do vórtice. Outra vez.

Uma vez que o padrão McFarland é correspondido, deixe o inóculo assentar por 15 minutos para permitir que aglomerados maiores de bactérias se assentem. Em seguida, use um nefi TER para medir a densidade das bactérias suspensas a zero. O nephi ter.

Primeiro coloque um tubo de interpolação de esferas salinas em branco no nephi ter. Pressione o botão calibrar para zerar o instrumento, depois coloque o padrão McFarland 0.5 no Nephi ter e pressione o botão calibrar novamente. Uma vez calibrado o instrumento, remova o padrão McFarland e insira o inóculo.

A leitura do inóculo deve ser igual à leitura padrão de McFarland. Se a leitura for muito baixa, remova o tubo e transfira mais bactérias da placa. Em seguida, faça um vórtice e leia a amostra novamente.

Se a leitura for muito alta, adicione interpolação salina ao vórtice do tubo. Em seguida, leia o exemplo novamente. Continue ajustando o inóculo conforme necessário até que a concentração da bactéria corresponda ao padrão de McFarland.

Em seguida, use uma pipeta de 200 microlitros e uma ponta de pipeta longa resistente a aerossóis para remover 100 microlitros de inóculo do terço superior do tubo. Para evitar aglomerados que se depositem no fundo do inóculo, o caldo Middlebrook seven H nine vórtice lentamente o caldo inoculado por 20 segundos para colocar o inóculo em placas Comece removendo a placa de microtitulação da embalagem do fabricante. Se o dessecante for azul ou se a embalagem de alumínio estiver danificada, não o use.

A placa já contém os 12 antimicrobianos a serem testados em cada poço, incluindo os medicamentos mais eficazes ou de primeira linha e os medicamentos de segunda linha. Despeje cuidadosamente o inóculo de caldo sete H nove em um trth, tomando cuidado para não gerar aerossóis. Em seguida, coloque a placa de microtitulação com o rótulo voltado para fora, conforme mostrado aqui, e use um pipetador de 12 canais para adicionar 100 microlitros de inóculo a cada poço.

Em seguida, prepare as placas para realizar a contagem de colônias. Primeiro, prepare uma placa não diluída transferindo um loop de um microlitro de amostra do poço de controle positivo para as sete placas H 10 rotuladas de um para um. Em seguida, use o laço para listrar a placa conforme mostrado aqui.

Em seguida, para preparar uma diluição de um a 50, transfira um loop de um microlitro do poço de controle positivo e gire-o no tubo com 50 microlitros de faixa de água. Um microlitro dessa diluição na placa rotulada de um a 50. Inocular as placas de pureza pipetando 50 microlitros do inóculo do trth para o ágar sangue devidamente marcado e sete placas H 10 e riscar para isolamento.

Em seguida, empilhe outro trth em cima do trth inoculado e coloque-os delicadamente no recipiente de descarte. Coloque um selo adesivo na placa de microtitulação. Em seguida, usando o suporte branco, pressione firmemente cada poço para garantir o teto adequado, garantindo que não haja vincos.

Desinfete a placa de micro titulação limpando-a com uma toalha de papel embebida em um desinfetante cida tuberculoso. Em seguida, coloque a placa de microtitulação em um saco plástico e feche-a com um selo térmico. Por fim, desinfete todos os materiais, incluindo o néfi, o vórtice ltro, as placas e os tubos, limpando-os com um desinfetante cida tuberculoso.

Aqui, o spray profissional é usado após o tempo suficiente para garantir a desinfecção. 15 minutos para o spray profissional. As placas são coladas com fita adesiva colocadas em sacos plásticos e os suprimentos lacrados são removidos do gabinete de biossegurança e colocados na passagem.

O saco vermelho de descarte é fechado e selado com um laço de torção neste ponto, removido o vestido, as botas e as luvas. Depois de prosseguir para a ante-sala e lavar as mãos, retire o respirador e desinfete-o e guarde-o depois de lavar as mãos novamente, coloque um avental novo e deixe a suíte BSL três. Em seguida, o recipiente de descarte é autoclavado.

Em seguida, incube a placa de microtitulação e as sete placas H 10 e trado de sangue com o lado direito para cima na incubadora de 35 a 37 graus Celsius com cinco a 10% de CO2 no laboratório BSL dois. Isso é aceitável porque a placa está bem selada e em um saco plástico, o tempo de geração de mycobacterium tuberculosis é de aproximadamente 12 a 24 horas, portanto, levará pelo menos uma semana antes que o crescimento possa ser visto como a formação de um pellet celular no fundo do controle. Bem, no dia 10, faça uma leitura manual do espelho colocando a lâmina selada de um micro titulação ST na plataforma da caixa do espelho.

Use uma lâmpada de mesa para ajudar a visualizar o ajuste de crescimento conforme necessário para obter o melhor contraste. Verifique os poços de controle de crescimento neste caso, H 11 e H 12 olhando para o espelho. Se houver crescimento, o poço parecerá turvo ou parecerá ter sedimentos, como mostrado aqui.

Se não houver crescimento como mostrado neste exemplo, o poço parecerá estar limpo. Nesse caso, coloque a placa de volta na incubadora e continue incubando por até 21 dias. Para cada condição, compare o crescimento com o controle.

Pois bem, para cada registro de medicamento, a primeira diluição que não tem crescimento. Esta é a concentração inibitória mínima ou MIC para o medicamento examinar os resultados usando um leitor de placa automatizado, como a visão, comece abrindo o software de placa Myco TB a ST e registrando a placa selada com o código de barras voltado para fora. Como mostrado aqui, o crescimento aparece como turbidez ou como um depósito de células no fundo de um poço na tela do computador.

Primeiro, examine os controles de crescimento. Como antes. Se isso for negativo para o crescimento, coloque a placa de volta na incubadora por até 21 dias.

Se isso for positivo, registre os resultados tocando no primeiro poço, que não mostra o crescimento na tela para cada medicamento. Em alguns casos, bactérias, sedimentos ou drogas precipitam para o fundo do poço. Esse fenômeno, conhecido como trailing, é indicado por vários poços com pellets do mesmo tamanho e não é realmente considerado crescimento positivo.

Em seguida, as sete placas H 10 e de ágar sangue são examinadas para determinar as concentrações bacterianas e avaliar a pureza. A placa de ágar sangue não deve mostrar crescimento após 48 horas. O crescimento na placa de ágar sangue indica contaminações com bactérias de crescimento rápido.

Se houver crescimento, o teste de microtitulação deve ser repetido. A placa de pureza sete H 10 deve ter crescimento de um organismo. A tuberculose do tipo EM deve parecer amarelada, colorida, enrugada e áspera Se contaminado, o teste de microtitulação precisa ser repetido a partir de uma cultura pura.

Para avaliar a concentração bacteriana, contar as colônias nas sete placas H 10. Em seguida, usando a tabela no documento escrito que acompanha, calcule a contagem de colônias. Mycobacterium tuberculosis foi cultivado a partir de uma amostra de paciente e a resistência a antibióticos foi avaliada conforme descrito neste vídeo na placa mostrada aqui, 12 medicamentos diferentes estão presentes em concentrações crescentes com as concentrações mais altas na parte superior e as concentrações mais baixas na parte inferior.

A concentração inibitória mínima, ou CIM, do fármaco foi indicada pela menor concentração do fármaco que não apresentou crescimento e está circulada na imagem aqui mostrada usando pontos de interrupção padronizados estabelecidos pelo Clinical and Laboratory Standards Institute. Os dados mostrados aqui sugerem que essa cepa de TB será resistente ao Isid e à Rifampicina. In vitro, os microfones altos observados em vários outros medicamentos, incluindo oin, moxifloxacina, estreptomicina e rifabutina, sugerem a resistência da cepa EM tuberculosis a esses agentes.

Os resultados do MIC devem ser usados por um especialista em doenças infecciosas com experiência no tratamento da tuberculose para desenvolver um plano de tratamento individualizado. Uma vez dominada, essa técnica leva cerca de 40 minutos para configurar um isolado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este é um patógeno respiratório e, depois de gerar aerossóis, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o Mycobacterium tuberculosis, teste de suscetibilidade antimicrobiana usando o método de diluição de micro caldo. Não se esqueça de que trabalhar com mycobacterium tuberculosis pode ser extremamente perigoso, e precauções como proteção respiratória devem sempre ser tomadas onde for necessário.