Name: Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a analisar a morfologia de dendritos e axônios de neurônios sensoriais periféricos em larvas de Drosophila usando mosaicos genéticos com marcação GFP e microscopia confocal.

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Os autores agradecem RIKEN para financiamento. Agradecemos também Cagri Yalgin, Caroline Delandre, e Jay Parrish para discussões sobre protocolos de genética e imuno-histoquímica.

1.Preparação de reagentes <ol><li> Prepare Ca + + livre HL3.1 salina 28. <ol><li> Em mM: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sacarose, trealose e 5; pH 7.2. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. Nota: Ca + + livre solução impede a contração muscular durante a dissecção. </li></ol></li><li> Faça poli-L-lisina (PLL) lamínulas. <ol><li> Dissolver 100mg PLL em água 4.2ml e fazer alíquotas em tubos de Eppendorf 300 ul e congelar a -20 ° C. </li><li> Antes de lamínulas de revestimento, primeiro degelo uma alíquota, trazê-lo até 10ml em DDH 2 O e adicionar 20μl do Kodak Photo-Flo, a concentração final PLL é de 0,7 mg / ml. </li><li> Lamínulas submergir por 30 minutos em solução PLL, remover e seca, em seguida, lavar rapidamente com água e seca. Repita duas vezes. Lamínulas tratados durar aproximadamente um mês. </li></ol></li></ol> 2. Cruzamentos genéticos <ol><li> To gerar clones MARCM. Aqui está um exemplo cruz usando um driver de pan-DA 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP; banheira Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> Para gerar FLP-out clones. Aqui está uma cruz exemplo usando uma classe de driver específico IV-8: ppk-Gal4 x yw, hsFLP; UAS-FRT-CD2, + y-stop-FRT-mCD8:: GFP </li></ol> 3. Colheita de embriões <ol><li> Mantenha cruza Drosophila em um frasco coletor a 25 ° C e coletar embriões em um suco de maçã espalhar placa agar 29 com uma fina camada de pasta de levedura 30,31. </li></ol> 4. Tratamento de choque térmico de embriões <ol><li> Coloque um prato vazio em oposição à placa de ágar suco de maçã sobre a qual os embriões tenham sido estabelecidas. Selo em torno destas duas placas com Parafilm (Fig. 2). </li><li> Durante o choque de calor ª submergir,placa e no banho de água e segure-o para baixo, usando um peso de metal. </li><li> Para embriões MARCM <ol><li> Coletar embriões para 2h e incubar em um prato de 10 centímetros de Petri rodeada por lenços umedecidos a 25 ° C para uma 2h adicionais. Nota: Ajuste o protocolo de choque térmico altera a freqüência em que clones são gerados. </li><li> Para um número menor de clones, visando única neurônios isolados, submergir e choque térmico em banho-maria por 1h a 38 ° C. </li><li> Para um maior número de clones, de choque térmico para 45mins a 38 ° C, recuperar a RT 30mins, depois de choque térmico novamente para um 30mins adicionais. </li></ol></li><li> Coletar FLP-out embriões para 24h, e de choque térmico por 1h a 38 ° C. </li></ol> 5. Triagem de clones <ol><li> Depois de choque térmico, retire a tampa do arranjo à prova d'água e coloque o suco de maçã placa de ágar numa placa de Petri 10 centímetros cercado por lenços umedecidos. Cultura dos embriões e larvas subseqüentes a 25 ° C até vagaring 3 º instar. Nota: condições de cultura, especialmente nutrição, têm sido mostrados para alterar a morfologia DA arbor dendríticas 32,33. Certifique-se que as larvas crescem têm acesso à pasta de fermento em todos os momentos; monitorar e repor o fermento colar, conforme necessário. </li><li> Deste ponto em diante no protocolo, manipular larvas delicadamente usando uma pinça de insetos. </li><li> Brevemente e lave as larvas na água da torneira, em seguida, coloque em uma placa de ágar. Nota: Este passo reduz de fundo auto-fluorescência de comida ou sujeira na superfície da larva. </li><li> Examine as larvas sob um poderoso microscópio de fluorescência de dissecação. Identificar larvas com GFP-positivos neurônios / células da parede do corpo. </li></ol> 6. Imagem in vivo em de dendritos <ol><li> Coloque a larva em um vidro corrediça depressão com uma pequena gota de glicerol 80%. Coloque uma lamela em slide para imobilizar a larva. Garantir que nenhum ar permanece entre a larva eo coverslip. </li><li> Empurre cuidadosamente a lamínula para rolar a larva para permitir a visualização do neurônio de interesse. A imagem da mCD8:: GFP-etiquetadas arbor dendríticas através de microscopia confocal. </li></ol> 7. Dissecação das larvas Nota antes de começar: dendrites DA neurônio degradam rapidamente após o início da dissecção. Dissecar cada larva individuais em menos de 5min para garantir a morfologia dendrite bom. <ol><li> Dissecar vagando 3 de larvas em uma placa Sylgard como descrito anteriormente 34 com as seguintes modificações: <ol><li> Para a imagem do axônio do neurônio DA termini, certifique-se que o SNC está intacta e os nervos segmentares não são quebradas. Depois de abrir as larvas, primeiro corte cuidadosamente as conexões traqueal contra a parede do corpo e, em seguida, remova cuidadosamente a tripa inteira. </li><li> Se os dendritos de imagem por si só, remova o CNS para permitir um alisador de montagem. </li></ol></li></ol> 8. Fixation e bloqueio de filetes larval <ol><li> Com a larva ainda preso à placa Sylgard, corrigi-lo em PFA 4% em PBS durante 20 minutos à temperatura ambiente em um agitador rotativo delicadamente. </li><li> Remoção de vestígios de tecidos larval (de gordura corporal, traquéia, etc) após a fixação. </li><li> Lavar em PBST (PBS com 0,1% Triton X-100) 10mins 3x na placa Sylgard e shaker. Se examinar termini axônio, manter o filé no prato Sylgard. (Se dendrites coloração é possível transferir os filetes larval a um tubo de 0,5 ml nesta etapa 34) </li><li> Bloquear as larvas de 20mins a RT em 5% de soro normal de burro (NDS) em PBST em um shaker. </li></ol> 9. Coloração dos filetes larval <ol><li> Remover a solução de bloqueio e incubar em anticorpo primário (em 5% NDS / PBST) overnight a 4 ° C em um recipiente Tupperware pequena, rodeada por lenços umedecidos. </li><li> Remover os tubos de 4 ° C e incubar uma hora adicional de RT. </li><li> Lavar 10mins 6x no PBST. Adicione o antib secundárioody (em 5% NDS / PBST), e tampa para evitar a foto-branqueamento fluoróforo 34. </li><li> Incubar quer no RT por duas horas, ou durante a noite a 4 ° C seguido por uma hora em temperatura ambiente. </li><li> Lavar a 10mins larvas 6x no PBST e prossiga para a montagem. </li></ol> 10. Montagem de filetes de larvas para exame do arbor dendrite <ol><li> Monte cada filé larval tão plana quanto possível, utilizando uma tesoura ou um bisturi de dissecação para cortar a cabeça (incluindo os ganchos na boca), ea posterior (incluindo o espiráculos) 34. </li><li> Coloque o filé larval no slide cutícula voltada para baixo, montado em glicerol 80%, e selar os lados da lamela com unha polonês para um 'quick' mount 34. </li><li> Para uma montagem permanente e uma imagem mais clara <ol><li> Coloque o filé dissecados larval músculo lateral-down em uma gota de PBS em uma lamela PLL, ele vai rapidamente aderir à lamínula. </li><li> Remover o líquido que for possível após a montagem, however não permitir que ele para secar completamente. </li><li> Pegue a lamela (com filé larval em anexo) através de uma série de etanol: o etanol 35%, seguido por 50%, 70%, 95% e, finalmente, 2x 100% de etanol para cada 10 minutos (o segundo 100% solução EtOH devem ser mudados frequentemente ) e, finalmente, lavar 2-3x 10 minutos em xileno. </li><li> Coloque uma gota de montagem DPX (Distyrene Xileno plastificante) em uma lâmina limpa e cuidadosamente coloque o filé de lamela lado-down no topo. Manter no escuro, e esperar um dia para o DPX para definir antes de imagem. </li></ol></li></ol> 11. Montagem de filetes de larvas para exame dos términos axônio <ol><li> Manter os nervos segmentares correndo entre o PNS e do SNC intacto durante a fixação, a dissecção e coloração para permitir o rastreamento dos axônios das células sensoriais do corpo de neurônio periférico para o VNC. </li><li> Monte cada larval filé cutícula voltada para baixo em 80% de glicerol em um slide depression. Traçar os axônios do corpo celular para o DAVNC sob o microscópio confocal. Nota: PNS neurônios em cada segmento do corpo do projeto de parede para o segmento de cognato do VNC. </li></ol> 12. Resultados representativos: Resultados representativos são mostrados nas figuras 3-5. Fig. 3 mostra a arbor inteiro de um neurônio da classe IV, capturado in vivo sob o microscópio confocal. Fig. 4 mostra um close-up de parte da arbor dendrite de um imunohistoquímica rotulados classe III neurônio que foi corretamente fixada para preservar a morfologia. A inserção associados mostra a degradação que pode ocorrer após uma dissecção sem sucesso e fixação (ambos corados com anti-GFP de anticorpos). Fig. 5 mostra uma única classe IV terminal axônio no SNC (anti-GFP, verde); todos os terminais de classe IV são co-corados com anti-CD2 (magenta). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg"> Figura 1 Visão geral do protocolo. a) Coletar e, em seguida, de choque térmico-embriões. b) Selecione uma larva com GFP-positivos DA neurônio clone, e depois a imagem do GFP-etiquetadas dendrite arbor na larva viva. c) dissecam a larva, e depois imunohistoquímica manchar o filé. d) Monte o filé manchado, e depois a imagem da árvore dendrítica e projeções axonal do neurônio DA clones. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg"> Figura 2 Preparação da placa de ágar suco de maçã para o choque térmico. Pegue a placa (seta branca, ab), adicionar uma segunda placa de petri em cima (seta vermelha b) e vedação ao redor com Parafilm (seta azul, b). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg"> Figura 3 na imagem in vivo do arbor dendrite de um mCD8:: GFP-etiquetadas clone MARCM (genótipo como em 2.1), representando uma classe IV (v'ada) neurônio de uma larva instar 3 rd. Barra de escala é de 50 ìm. d/3111/3111fig4.jpg "/&gt; Figura 4 mCD8:: GFP-etiquetadas MARCM clone de um neurônio III classe (ddaA) corado com anticorpos anti-GFP, mostrando boa morfologia após a dissecção de sucesso e fixação (verde). A inserção mostra a degradação dendrite (setas brancas) que ocorram após dissecção sem sucesso e fixação (magenta). Barra de escala é 25μm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg"> Figura 5 O 3 º instar larval VNC. Um clone FLP-out de uma classe VI único terminal axônio (VDAB) (genótipo como em 2.2) é detectada através de anticorpos anti-GFP (verde). Anti-CD2 rótulos toda a classe IV termini (magenta). Barra de escala é 25μm.

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<li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A Drosophila larval DA modelo de neurônio fornece um excelente sistema genético para investigar os mecanismos de controle que a morfologia dos neurônios ea formação do circuito. MARCM é geralmente utilizada para rotulagem e para a geração de clones mutantes DA neurônio. Para MARCM que usar uma pan-neural (por exemplo Gal4 C155) ou DA motorista neurônio-específica. Usando um driver de pan-neural é possível usar diretamente diversas unidades populacionais amplamente disponível a partir...

<table border="1"><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> SZX16 microscópio de dissecção de fluorescência (com GFPHQ filtro) </td><td> Olimpo </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça viver Insect </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26 milímetros x 76 milímetros de vidro corrediça depressão </td><td> Toshinriko Co. </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (ou Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P-1524 </td><td> Este produto tem se mostrado mais eficaz </td></tr><tr><td> DPX meio de montagem </td><td> Sigma </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> De coelho anti-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> Diluição 1:500 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> Diluição 1:200 </td></tr><tr><td> Rato anti-CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> Diluição 1:700 </td></tr><tr><td> Rato anti-Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1d4 </td><td> Diluição de 1:10 </td></tr></table>

análise morfológica de drosophila larval sensorial periférica dendrites neuron e axônios usando mosaicos genéticos

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Desenvolvimento do sistema nervoso requer a especificação correta de neurônio posição e identidade, seguido por desenvolvimento precisa dendríticas do neurônio específico de classe e fiação axonal. Recentemente, a arborização dendrítica (DA) neurônios sensoriais da larval Drosophila sistema nervoso periférico (SNP) tornaram-se poderosos modelos genéticos em que para elucidar os mecanismos gerais e específicas de classe de diferenciação neuronal. Há quatro principais classes DA neurônio (I-IV) 1. Eles são nomeados em ordem crescente de complexidade arbor dendrite, e têm diferenças de classe específica no controle genético da sua diferenciação 2-10. O sistema DA sensorial é um modelo prático para investigar os mecanismos moleculares por trás do controle da morfologia dendrítica 13/11 porque: 1) pode aproveitar as poderosas ferramentas genéticas disponíveis na mosca da fruta, 2) o neurônio DA dendrite arbor se espalha em apenas duas dimensões sob uma ótica clear cutícula larval tornando-o fácil de visualizar com alta resolução in vivo, 3) a diversidade de classe específico em morfologia dendrítica facilita uma análise comparativa para encontrar elementos-chave controlando a formação de simples contra altamente ramificados árvores dendríticas, e 4) arbor dendríticas estereotipada formas diferentes de neurônios DA facilitar morfométricas análises estatísticas. DA atividade do neurônio modifica a saída de um gerador de padrão larval locomoção centrais 14-16. As diferentes classes de DA neurônio têm distintas modalidades sensoriais, e sua ativação provoca diferentes respostas comportamentais 14,16-20. Além disso diferentes classes de enviar projeções stereotypically axonal no sistema central de Drosophila larval nervoso no cordão nervoso ventral (VNC) 21. Essas projeções terminar com representações topográficas dos dois modalidade neurônio sensorial e DA a posição na parede do corpo do campo dendríticas 7,22De 23. Por isso o exame de projeções DA axonal pode ser usado para elucidar os mecanismos subjacentes mapeamento topográfico 7,22,23, bem como a fiação de um circuito simples locomoção larval modulando 14-17. Nós apresentamos aqui um guia prático para gerar e analisar mosaicos genéticos 24 neurônios marcação DA via MARCM (Análise Mosaic com um marcador de células repressor) 1,10,25 e FLP-out 22,26,27 técnicas (resumidos na Figura 1.).

A arborização dendrítica de neurônios sensoriais da<em&gt; Drosophila</em&gt; Sistema periférico larval nervoso são modelos úteis para elucidar tanto gerais como neurônio específico de classe mecanismos de diferenciação de neurônios. Nós apresentamos um guia prático para gerar e analisar arborização dendrítica mosaicos neurônio genética.

Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

O desenvolvimento do sistema nervoso requer a especificação correta da posição e identidade dos neurônios, seguida por um desenvolvimento dendrítico preciso e específico para cada classe de neurônio...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a morfologia detalhada dos neurônios larvais de arborização dendrítica de drosófila. Isso é realizado primeiramente coletando embriões, envelhecendo-os e gerando clones genéticos marcados com GFP por meio da expressão induzida por choque térmico da lipase. O segundo passo consiste em selecionar larvas com clones neuronais fluorescentes e obter uma imagem de suas ABAs dendríticas.Após a aquisição de imagens da larva, elas são dissecadas, fixadas e submetidas à imunomarcação para que possam ser montadas e suas arborizações dendríticas e as morfologias dos terminais axonais possam ser visualizadas por meio de microscopia confocal de imunofluorescência. Hoje demonstrarei um protocolo para análise morfológica dos neurônios sensoriais periféricos inferiores sula e seus éxons utilizando moscas geneticamente modificadas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo do desenvolvimento neural, como quais são os programas genéticos que controlam a identidade neural, a forma das arborizações dendríticas e a conexão externa?Inicie este protocolo coletando embriões em placas com suco de maçã. O choque térmico é aplicado em banho-maria a 38 graus Celsius, e a duração varia conforme a genética dos embriões e o tamanho desejado dos clones. Para este protocolo, gere clones markum a partir de embriões com um marcador de neurônio de arborização dendrítica pand. Antes do choque térmico, mantenha os embriões marcadores a 25 graus Celsius, rodeados por tecidos úmidos, durante duas horas.Prepare as placas de coleta para o choque térmico tornando-as submersíveis com o uso de placas vazias e parafilina. Em seguida, submeta os embriões marcadores a choque térmico por uma hora para gerar clones pequenos ou marcação de neurônios individuais. Para aumentar o número de clones, utilize um choque térmico prolongado incubando por 45 minutos no banho, seguido por 30 minutos em temperatura ambiente e, depois, mais 30 minutos no banho.Para gerar clones flipout, colete embriões por 24 horas contínuas. Este protocolo utiliza um driver específico da classe quatro. Submeta os embriões flipout a choque térmico por uma hora após o choque térmico.Coloque as placas de coleta em uma placa de Petri de 10 centímetros cercada por tecidos úmidos e cultura. Os embriões são mantidos a 25 graus Celsius durante o monitoramento da cultura de embriões, e reabasteça a pasta de levedura conforme necessário. Porque a nutrição afeta criticamente o desenvolvimento neuronal.Mantenha a cultura até que larvas de terceiro instar possam ser coletadas; enxágue brevemente e suavemente as larvas de terceiro instar em água da torneira e transfira-as para uma placa de ágar. Em seguida, examine as larvas utilizando um microscópio estereoscópico de fluorescência potente e pinças para insetos. Identifique larvas com neurônios positivos para GFP na parede corporal e transfira-as para uma lâmina de depressão com uma gota de glicerol 80%.Coloque uma lamínula sobre a lâmina para imobilizar a larva. Certifique-se de que não reste nenhum ar entre a larva e a lamínula. Utilize microscopia confocal padrão para visualizar os neurônios de interesse através da cutícula da larva.Para alterar a posição da lava para um ângulo de visualização melhorado, empurre suavemente a lamínula para rolar a lava. Inicie este protocolo transferindo uma lava para a placa de proteção SIL usando pinças para insetos. Em seguida, fixe-a nas extremidades anterior e posterior.Em seguida, adicione o tampão HL 3.1 sem cálcio. Agora, corte até a metade em ambas as extremidades da larva, perpendicularmente ao eixo anterior-posterior. Em seguida, corte ao longo da linha média entre as duas traqueias.Corte cuidadosamente cada conexão traqueal individual até a parede do corpo antes de remover suavemente o intestino. Isso mantém os nervos segmentares que percorrem entre o SNP e o SNC intactos. Com a larva ainda fixada na placa de suporte, fixe-a em paraformaldeído 4% em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente em um agitador suave, realizando cada dissecação em menos de cinco minutos.Caso contrário, os filetes dos neurônios de autorização dendrítica começarão a degradar. Após a fixação, remova os tecidos larvais em excesso. Em seguida, lave os filetes três vezes com PBST, durante 10 minutos por lavagem.Após as lavagens, incubar as larvas por 20 minutos à temperatura ambiente em solução bloqueadora com agitação suave. Após a conclusão do bloqueio, substituir a solução bloqueadora pela solução de anticorpo primário. Colocar a amostra no recipiente plástico pequeno cercado por tecidos úmidos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, continuar a incubação por mais uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, lave o filé de lava seis vezes em PBST durante 10 minutos por lavagem. Agora, adicione o anticorpo secundário e coloque os filés em um recipiente escuro para evitar o desbotamento da Fluor. Incube os filés por algumas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius, seguido de uma hora à temperatura ambiente.Por fim, lave os filés seis vezes em PBST durante 10 minutos por lavagem. Os tecidos estão então prontos para serem montados. Para visualizar os terminais axônicos, basta montar a cutícula do filé larval com o lado da cutícula voltado para baixo em glicerol 80% em uma lâmina com cavidade.Para obter imagens mais nítidas de dendritos, faça um lâmina permanente com lamínulas revestidas com PLL. Para codificar as lamínulas, adicione uma alíquota de PLL, complete com 10 mililitros de água bidestilada e acrescente 20 microlitros de Kodak photo flow.Mergulhe as lamínulas por 30 minutos na solução de PLL e seque-as ao ar após a remoção. Em seguida, enxágue-as brevemente com água e deixe secar ao ar novamente.Repita este processo duas vezes. A partir do banho de PLL, as lamínulas tratadas durarão aproximadamente um mês. Agora, monte um músculo de filé larval dissecado com a face muscular voltada para baixo em uma gota de PBS sobre uma lamínula de PLL.O filé aderirá rapidamente à lamínula com o auxílio de um pedaço de papel-toalha. Remova o máximo de líquido possível, porém, não permita que ele seque completamente. Em seguida, desidrate os filés larvais com uma série de banhos de etanol de 10 minutos, iniciando com etanol a 35%, seguido por 50%, depois 70%, depois 95%, depois 100% e, finalmente, um segundo banho com etanol a 100%.Após os banhos de etanol, realize dois ou três banhos de 10 minutos em xilol. Em seguida, coloque uma gota de DPX sobre uma lâmina limpa e posicione cuidadosamente a lamínula sobre o DPX, preenchendo-a com a face voltada para baixo. Mantenha a lâmina no escuro e aguarde um dia para que o DPX solidifique.Antes de realizar a imagem do tecido utilizando microscopia in vivo e focal, é possível capturar imagens como esta. A árvore completa de um neurônio de arborização dendrítica da classe quatro. Este é um close de uma árvore dendrítica de um neurônio da classe três marcado por IHC que foi corretamente fixado para preservar a morfologia.O detalhe mostra a degradação que pode ocorrer após uma dissecação e fixação mal-sucedidas. Esta sobreposição mostra um único terminal axonal da classe quatro no SNC. O axônio é marcado com anti-GFP em verde e todos os termite da classe quatro são contra-marcados com anti-CD2 em magenta.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de dissecar e fixar as amostras rapidamente, seguindo os axônios da periferia até o SNC. É útil ter em mente que os neurônios do SNP em cada segmento do corpo projetam-se para o segmento correspondente do cordão nervoso ventral. Além disso, se desejar visualizar apenas as dendrites, remova os CNAs durante a dissecação, e a coloração pode ser realizada em tubos em vez de em placas.Ao montar esses filetes para a imagem de dendritos, corte primeiro a cabeça com os ganchos bucais e a extremidade posterior com brilhos. Para um preparo agradável.

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JoVE Journal

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