Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a morfologia detalhada dos neurônios larvais de arborização dendrítica de drosófila. Isso é realizado primeiramente coletando embriões, envelhecendo-os e gerando clones genéticos marcados com GFP por meio da expressão induzida por choque térmico da lipase. O segundo passo consiste em selecionar larvas com clones neuronais fluorescentes e obter uma imagem de suas ABAs dendríticas.

Após a aquisição de imagens da larva, elas são dissecadas, fixadas e submetidas à imunomarcação para que possam ser montadas e suas arborizações dendríticas e as morfologias dos terminais axonais possam ser visualizadas por meio de microscopia confocal de imunofluorescência. Hoje demonstrarei um protocolo para análise morfológica dos neurônios sensoriais periféricos inferiores sula e seus éxons utilizando moscas geneticamente modificadas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo do desenvolvimento neural, como quais são os programas genéticos que controlam a identidade neural, a forma das arborizações dendríticas e a conexão externa?

Inicie este protocolo coletando embriões em placas com suco de maçã. O choque térmico é aplicado em banho-maria a 38 graus Celsius, e a duração varia conforme a genética dos embriões e o tamanho desejado dos clones. Para este protocolo, gere clones markum a partir de embriões com um marcador de neurônio de arborização dendrítica pand. Antes do choque térmico, mantenha os embriões marcadores a 25 graus Celsius, rodeados por tecidos úmidos, durante duas horas.

Prepare as placas de coleta para o choque térmico tornando-as submersíveis com o uso de placas vazias e parafilina. Em seguida, submeta os embriões marcadores a choque térmico por uma hora para gerar clones pequenos ou marcação de neurônios individuais. Para aumentar o número de clones, utilize um choque térmico prolongado incubando por 45 minutos no banho, seguido por 30 minutos em temperatura ambiente e, depois, mais 30 minutos no banho.

Para gerar clones flipout, colete embriões por 24 horas contínuas. Este protocolo utiliza um driver específico da classe quatro. Submeta os embriões flipout a choque térmico por uma hora após o choque térmico.

Coloque as placas de coleta em uma placa de Petri de 10 centímetros cercada por tecidos úmidos e cultura. Os embriões são mantidos a 25 graus Celsius durante o monitoramento da cultura de embriões, e reabasteça a pasta de levedura conforme necessário. Porque a nutrição afeta criticamente o desenvolvimento neuronal.

Mantenha a cultura até que larvas de terceiro instar possam ser coletadas; enxágue brevemente e suavemente as larvas de terceiro instar em água da torneira e transfira-as para uma placa de ágar. Em seguida, examine as larvas utilizando um microscópio estereoscópico de fluorescência potente e pinças para insetos. Identifique larvas com neurônios positivos para GFP na parede corporal e transfira-as para uma lâmina de depressão com uma gota de glicerol 80%.

Coloque uma lamínula sobre a lâmina para imobilizar a larva. Certifique-se de que não reste nenhum ar entre a larva e a lamínula. Utilize microscopia confocal padrão para visualizar os neurônios de interesse através da cutícula da larva.

Para alterar a posição da lava para um ângulo de visualização melhorado, empurre suavemente a lamínula para rolar a lava. Inicie este protocolo transferindo uma lava para a placa de proteção SIL usando pinças para insetos. Em seguida, fixe-a nas extremidades anterior e posterior.

Em seguida, adicione o tampão HL 3.1 sem cálcio. Agora, corte até a metade em ambas as extremidades da larva, perpendicularmente ao eixo anterior-posterior. Em seguida, corte ao longo da linha média entre as duas traqueias.

Corte cuidadosamente cada conexão traqueal individual até a parede do corpo antes de remover suavemente o intestino. Isso mantém os nervos segmentares que percorrem entre o SNP e o SNC intactos. Com a larva ainda fixada na placa de suporte, fixe-a em paraformaldeído 4% em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente em um agitador suave, realizando cada dissecação em menos de cinco minutos.

Caso contrário, os filetes dos neurônios de autorização dendrítica começarão a degradar. Após a fixação, remova os tecidos larvais em excesso. Em seguida, lave os filetes três vezes com PBST, durante 10 minutos por lavagem.

Após as lavagens, incubar as larvas por 20 minutos à temperatura ambiente em solução bloqueadora com agitação suave. Após a conclusão do bloqueio, substituir a solução bloqueadora pela solução de anticorpo primário. Colocar a amostra no recipiente plástico pequeno cercado por tecidos úmidos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, continuar a incubação por mais uma hora à temperatura ambiente.

Em seguida, lave o filé de lava seis vezes em PBST durante 10 minutos por lavagem. Agora, adicione o anticorpo secundário e coloque os filés em um recipiente escuro para evitar o desbotamento da Fluor. Incube os filés por algumas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius, seguido de uma hora à temperatura ambiente.

Por fim, lave os filés seis vezes em PBST durante 10 minutos por lavagem. Os tecidos estão então prontos para serem montados. Para visualizar os terminais axônicos, basta montar a cutícula do filé larval com o lado da cutícula voltado para baixo em glicerol 80% em uma lâmina com cavidade.

Para obter imagens mais nítidas de dendritos, faça um lâmina permanente com lamínulas revestidas com PLL. Para codificar as lamínulas, adicione uma alíquota de PLL, complete com 10 mililitros de água bidestilada e acrescente 20 microlitros de Kodak photo flow.

Mergulhe as lamínulas por 30 minutos na solução de PLL e seque-as ao ar após a remoção. Em seguida, enxágue-as brevemente com água e deixe secar ao ar novamente.

Repita este processo duas vezes. A partir do banho de PLL, as lamínulas tratadas durarão aproximadamente um mês. Agora, monte um músculo de filé larval dissecado com a face muscular voltada para baixo em uma gota de PBS sobre uma lamínula de PLL.

O filé aderirá rapidamente à lamínula com o auxílio de um pedaço de papel-toalha. Remova o máximo de líquido possível, porém, não permita que ele seque completamente. Em seguida, desidrate os filés larvais com uma série de banhos de etanol de 10 minutos, iniciando com etanol a 35%, seguido por 50%, depois 70%, depois 95%, depois 100% e, finalmente, um segundo banho com etanol a 100%.

Após os banhos de etanol, realize dois ou três banhos de 10 minutos em xilol. Em seguida, coloque uma gota de DPX sobre uma lâmina limpa e posicione cuidadosamente a lamínula sobre o DPX, preenchendo-a com a face voltada para baixo. Mantenha a lâmina no escuro e aguarde um dia para que o DPX solidifique.

Antes de realizar a imagem do tecido utilizando microscopia in vivo e focal, é possível capturar imagens como esta. A árvore completa de um neurônio de arborização dendrítica da classe quatro. Este é um close de uma árvore dendrítica de um neurônio da classe três marcado por IHC que foi corretamente fixado para preservar a morfologia.

O detalhe mostra a degradação que pode ocorrer após uma dissecação e fixação mal-sucedidas. Esta sobreposição mostra um único terminal axonal da classe quatro no SNC. O axônio é marcado com anti-GFP em verde e todos os termite da classe quatro são contra-marcados com anti-CD2 em magenta.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de dissecar e fixar as amostras rapidamente, seguindo os axônios da periferia até o SNC. É útil ter em mente que os neurônios do SNP em cada segmento do corpo projetam-se para o segmento correspondente do cordão nervoso ventral. Além disso, se desejar visualizar apenas as dendrites, remova os CNAs durante a dissecação, e a coloração pode ser realizada em tubos em vez de em placas.

Ao montar esses filetes para a imagem de dendritos, corte primeiro a cabeça com os ganchos bucais e a extremidade posterior com brilhos. Para um preparo agradável.