Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

O objetivo geral deste procedimento é selecionar plasmodium, fpar e parasitas para ligação a células endoteliais cerebrais humanas. Isso é realizado primeiramente incubando uma cultura de plasmodium, fpar e parasitas, que contém uma mistura de hemácias infectadas e não infectadas, com uma camada de células endoteliais cerebrais humanas. O próximo passo é lavar as hemácias não infectadas e não ligadas, realizando várias lavagens com meio de cultura. Em seguida, são adicionadas hemácias frescas para permitir o crescimento adicional da população de parasitas.

O passo final, algumas semanas depois, consiste em repetir a seleção geral assim que um número suficiente de parasitas for alcançado. Em última análise, a microscopia é utilizada para demonstrar uma alta quantidade de parasitas ligados às células epiteliais bronquiais humanas (HBE) cinco i. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da malária cerebral, como a identificação de ligantes parasitários ou moléculas receptoras do hospedeiro envolvidas no processo de citoadsorção.

Prepare os eritrócitos humanos a partir de sangue total do grupo O positivo separando os eritrócitos dos leucócitos por meio da passagem através de um filtro de esgotamento de leucócitos. Centrifugue as células a 1000 G por 10 minutos e ressuspenda o pellet com todo o PMI. Meio incompleto.

Repita este passo de lavagem mais uma vez, então re-suspenda o pellet. Em nosso meio PMI incompleto com hematócrito de 50%, os glóbulos vermelhos são armazenados a quatro graus Celsius durante uma semana. Cultive os glóbulos vermelhos infectados com Odium Valspar.

Com meio RPMI completo a 2% de hematócrito, incubar a 37 graus Celsius com 3% de dióxido de carbono, 1% de oxigênio e 96% de nitrogênio diariamente. Prepare um esfregaço de gemas para avaliar a fase de desenvolvimento dos parasitas. Troque o meio diariamente centrifugando o cultivo a 500 G durante cinco minutos.

Aspirar o sobrenatante e adicionar meio RPMI completo fresco cerca de uma vez por semana. Sincronizar os parasitas por tratamento com sorbitol aquoso a 5%. O ensaio de seleção pode ser realizado no dia seguinte a um cultivo em estágio anelar, quando for observado um mínimo de 5% a 10% de parasitemia.

Além disso, é necessário um volume suficiente de cultura de parasitas para formar um volume celular P de 30 microlitros por placa de 60 milímetros de células hbe cinco olho. Prepare uma placa de cultura tecidual de 60 milímetros para receber a linhagem de células endoteliais microvasculares do cérebro humano ou H de volta cinco i, adicionando dois microgramas por centímetro quadrado de fibronectina e salina estéril à placa.

Incube o recipiente a 37 graus Celsius por cinco a 20 minutos, depois aspire a solução de fibronectina. Em seguida, colete as células HBE cinco I de um frasco de tecido de 25 centímetros quadrados por ionização e centrifugação Reese, suspenda o pellet celular em 10 mililitros de DMEM, meio completo. Em seguida, adicione 1,5 mililitro dessa suspensão celular ao recipiente de cultura de tecido tratado com fibronectina e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias, até que o cultivo atinja 50 a 100% de confluência e os cultivos de parasitas estejam prontos para citocianina no dia do ensaio.

A cultura de HBE cinco I deve estar com cofluência de 50 a 100%. Enquanto isso, a cultura de parasita deve estar na fase de trofozoítas pigmentados, com pelo menos 5 a 10% de parasitas e 2% de hematócrito. Primeiro, pipete 1,5 mililitro da cultura de parasita do frasco de cultura e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue a cultura a 500 G durante cinco minutos e ressuspenda em 10 mililitros de DMEM incompleto, um meio previamente aquecido. Repita este passo de lavagem uma segunda vez após a conclusão da centrifugação final.

Aspire o meio DMEM incompleto e re-suspenda o pellet de 30 microlitros em 1,5 mililitros de DMEM incompleto, suplementado com 1% de BSA. Em seguida, recupere a placa de 60 milímetros de hvac.Five.

As células oculares aspiram o meio de cultura e lavam duas vezes com três mililitros de DMEM. Meio incompleto. Adicione a solução de parasitas, o prato de cinco células oculares HPE e incube no incubador de cultura de tecidos por um total de 75 minutos.

Duas vezes durante a incubação, resuspenda os parasitas agitando suavemente e girando o recipiente após a incubação. Lave o recipiente cinco vezes, aspirando o meio com uma pipeta plástica tipo espaguete, adicionando três mililitros de meio DMEM incompleto aquecido e, em seguida, agitando suavemente a placa. Após a lavagem final, examine o recipiente em um microscópio invertido. Se muitas hemácias não infectadas ainda estiverem visíveis, repita o procedimento de lavagem conforme descrito acima para removê-las.

Após aspirar o meio do recipiente, ressuspenda 40 microlitros de volume celular empacotado de hemácias frescas em meio RPMI completo aquecido e adicione a suspensão celular ao recipiente. Coloque o recipiente em uma câmara de incubação com ar. Em seguida, borbulhe o recipiente com 3% de dióxido de carbono, 1% de oxigênio e 96% de nitrogênio por três minutos.

E coloque a câmara em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. Durante essa incubação, os esquizontes em estágio de parasitas rompem e merozoítos reinfectam as hemácias. No dia seguinte, colete os parasitas em estágio anelar lavando.

Com meio RPMI incompleto, de maneira semelhante ao anterior, mas com pipetagem mais vigorosa do meio e agitação da placa. Mantenha todo o meio utilizado, que conterá os eritrócitos em suspensão, em um tubo cônico de 15 mililitros. Verifique a placa ao microscópio invertido para assegurar que todos os eritrócitos tenham sido removidos da placa antes da centrifugação.

O tubo contendo o meio da placa lavada para centrifugar os parasitas, descarte o sobrenadante e ressuspenda em cinco mililitros de meio RPMI completo e coloque a mistura em um frasco quadrado de 25 centímetros quadrados para cultivo. Os parasitas são cultivados por duas a quatro semanas até que seja obtido material suficiente e uma nova rodada de seleção possa ser realizada.

Parasitas HB três não selecionados mostram um baixo nível de ligação às células endoteliais hbe cinco. Esta imagem mostra células hbe cinco fixadas com 2% de glutaraldeído e coradas com Giemsa, visualizadas ao microscópio com aumento de 1000 vezes. As imagens foram obtidas após a lavagem de glóbulos vermelhos não infectados e de glóbulos vermelhos infectados não ligados. Após cada rodada de seleção, um número crescente de parasitas se liga às células endoteliais, e as seleções podem ser repetidas em intervalos de tempo mais curtos após cinco rodadas de seleção.

Populações de parasitas com alta capacidade de ligação são obtidas, como mostrado aqui com os parasitas HB três HBE. Esta tabela apresenta um resumo das linhagens de Plasmodium alspar que foram selecionadas com sucesso para ligação ao HE cinco. Observo que HB três também foi selecionado em HE cinco ativado por TNF após cinco rodadas de seleção.

A linhagem DD dois não mostrou aumento na ligação a HBE cinco I em comparação com a DD dois não selecionada. Esta imagem com aumento de 400 vezes mostra a ligação de parasitas plasmodium alspar HB três a células endoteliais dérmicas HD MEK antes da seleção. Aqui, a ligação de parasitas plasmodium alspar HB três à mesma linhagem de células endoteliais dérmicas é mostrada após quatro rodadas de seleção.

Esta figura mostra a ligação de parasitas Plasmodium spar HB três a células endoteliais pulmonares HP ME antes da seleção. Agora, a ligação de parasitas Plasmodium spar HB três às células HP ME aumentou após quatro rodadas de seleção. Embora o meio de cultura para hd e, C e HP EC difira ligeiramente, o protocolo utilizado para a seleção foi idêntico ao do hbe cinco I. Após este procedimento, métodos como R-T-P-C-R ou microanálise podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como caracterizar a transcrição do antígeno de superfície variante em parasitas não selecionados e selecionados.