Name: Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a selecionar parasitas Plasmodium falciparum para citoadesão em células endoteliais cerebrais humanas. Este método in vitro permite estudar mecanismos da malária cerebral e identificar potenciais alvos terapêuticos.

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Agradecemos a Francisco Candal, CDC Transferência de Tecnologia Escritório, Atlanta Geórgia para HBEC-5i células. Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (4 anos bolsa de estudo para doutorado e AC Fellowship sênior em ciência biomédica básica para JAR, conceder número 084226).

Recomendações gerais Cérebro humano microvascular cultura de células endoteliais (HBEC-5i) tem sido descrito anteriormente em 6, 8. P. parasitas falciparum foram cultivadas como no 9. Ambos HBEC-5i e P. culturas falciparum parasita devem ser mantidos em condições estéreis em todos os momentos. Todos os reagentes devem ser pré-aquecido a 37 ° C. Recomendamos que verifique regularmente se há contaminação por micoplasma 10 por PCR (Minevera Biolabs, as instruções do fabricante do seguinte). O protocolo está resumida na Figura 1. 1. Cultura de rotina da célula endotelial <ol><li> Prepare os reagentes necessários. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Médio para se preparar </td><td> Reagentes </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> "DMEM incompleto" </td><td> DMEM-F12 Ham </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> &amp;nbsp; </td><td> L-glutamina 200mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Penicilina estreptomicina / 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (ajustar o pH a 7.4) </td></tr><tr><td> "DMEM completo" </td><td> "DMEM incompleto" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Fetal bovino soro inativado pelo calor </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> Suplemento de crescimento da célula endotelial </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura HBEC-5i num frasco de 25 centímetros 2 perfurada com 10ml meio DMEM completo em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. </li><li> Células passagem quando eles se tornam confluentes. Remover o meio de idade por sucção e lavar duas vezes com DMEM incompleta ou cultura de tecidos grau PBS (Ca 2 + e Mg 2 + livre) pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de pré-aquecido Tentepsin-EDTA (0,025% Tripsina, 0,5 mM EDTA), agite para cobrir a totalidade do frasco e incubar por ~ 2 min a 37 ° C. </li><li> Seleção em microscópio invertido que pelo menos 90% das células foram destacados. Se necessário, delicadamente bater o fundo do frasco para retirar células aderentes. Adicionar 10 ml de meio completo DMEM para impedir as células de tripsina e transferir para um tubo cônico 15ml. Centrifugar por 4 min a 300 g à temperatura ambiente (RT). </li><li> Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 10 ml de meio completo DMEM. Pipeta a solução cima e para baixo completamente ressuspender as células. </li><li> Adicionar 1 ou 2 ml da suspensão de células para um balão nova cultura e adicione 8ml de meio fresco para manter a cultura. Avaliar o crescimento da cultura todos os dias sob um microscópio invertido e mudança de médio a cada 2 ou 3 dias antes que ele fica amarelo. </li></ol> 2. Preparar células endoteliais para uma seleção <ol><li> Dois dias antes do dia da seleção e n, adicione fibronectina diluído em PBS estéril (2 mg / cm 2) em um (ou mais) 60 mm placa de Petri. Incubar o prato por 5 a 20 min a 37 ° C, em seguida, remova a solução fibronectina, que pode ser armazenado a 4 ° C por um mês e re-utilizado uma vez. </li><li> Células passagem como descrito nas seções 1.3. para 1,5. Assumindo 100% de células confluentes foram destacados e ressuspenso em 10ml meio DMEM completo (seção 1.6., Ressuspender com um volume equivalente de médio se a confluência é menor, por exemplo, ressuspender com 8ml se a confluência foi de 80%), adicionar 1,5 ml da suspensão células à placa de Petri revestidas fibronectina e outro de 1,5 ml de meio completo DMEM. </li><li> Coloque a placa de Petri semeadas na incubadora. Nota: Idealmente, a confluência será em torno de 90% no momento da seleção dois dias depois. </li><li> Opcional. Para ativar HBEC-5i, adicione o TNF de citocina (fator de necrose tumoral) em uma concentração final de 50μg/ml 24 horas antes da seleção. </li></ol>e_title "&gt; 3. Plasmodium falciparum cultura de rotina <ol><li> Prepare os reagentes necessários (veja a tabela aqui abaixo). Prepare células vermelhas do sangue (RBC), separando sangue total (grupo O +) pela passagem através de um filtro de remoção de leucócitos (ver "Métodos de Pesquisa em Malária" publicação 11 para cultura geral parasitas da malária). Lavar RBC duas vezes por centrifugação a 400 g por 5 min e ressuspensão com 10 ml RPMI incompleta. Mantenha RBC lavado a 4 ° C em meio incompleta em hematócrito de 50%. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Médio para se preparar </td><td> Reagentes </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> "RPMI incompleto" </td><td> RPMI 1640 (com bicarbonato) </td><td> 500ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glicose a 20% </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td> L-glutamina 200mM <td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (ajustar o pH a 7.2) </td></tr><tr><td> "RPMI completo" </td><td> "RPMI incompleto" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Agrupados humano (não imunes) de soro </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura P. falciparum infectados RBC com meio completo RPMI a 37 ° C com 3% de CO 2, 1% O 2, e 96% N 2. hematócrito em 2% e incubar Faça Giemsa esfregaço 11 diárias para avaliar o estágio de desenvolvimento de parasitas (Figura 2). </li><li> Regularmente (aproximadamente uma vez por semana) sincronizar cultura por tratamento sorbitol 12. O dia antes do ensaio da selecção, objectivo para uma cultura anel de estágio na parasitemia 5% ou mais (de preferência pelo menos 10%). </li></ol> 4. Seleção de P. falciparum para cytoadhesion às células endoteliais <ol><li> No dia do ensaio, a cultura deve ser parasita na fase trofozoíto pigmentados (Figura 2) (idealmente parasitemia 10%), enquanto HBEC-5i cultura deve ser de 50 a 100% confluência (idealmente 90%). Volume celular 30μl repleta de cultura parasita é necessário por HBEC-5i placa de Petri. </li><li> Lavar parasitas duas vezes por centrifugação (500 g por 5 min) 1,5 ml da cultura parasita. Elimine o sobrenadante e ressuspender com 10ml de preparados na hora, aquecido meio DMEM, incompleta. Repita a lavagem pela segunda vez. Ressuspender o volume celular 30μl embalado com 1,5 ml de DMEM incompleta com BSA 1%. </li><li> Lave o HBEC-5i placa de Petri revestidas por duas vezes aspiração médio e adicionando 3 ml de DMEM incompleta. </li><li> Adicionar a solução de parasitas para o prato HBEC-5i e incubar a 37 ° C por 75min. Ressuspender parasitas duas vezes (aos 30 e 60 min) durante a incubaçãosuavemente balanço o prato nas quatro direções, bem como no sentido horário e anti-horário. </li><li> Após a incubação, lavar o prato 5 vezes por meio de aspiração, usando um plástico Pasteur pipeta para adicionar 3 ml de meio DMEM quente incompleta, e de balanço suave. Se muitos pratos estão sendo utilizados, mantê-los em uma superfície quente, como um grande frasco cheio de água a 37 ° C. </li><li> Verifique o prato sob um microscópio invertido. Se muitos RBC não infectados ainda são visíveis, não lava mais como descrito acima. Lidar com a placa de Petri com muito cuidado para evitar qualquer risco de contaminação. </li><li> Remova o meio do prato e adicionar 3 ml de meio RPMI quente completo com volume celular 40μl repleta de uRBC fresco. </li><li> Coloque o prato em uma câmara hermética de incubação, o gás por 3 min e colocar a câmara em uma incubadora a 37 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, colher os parasitas por lavagem com RPMI médio incompletos, de um modo semelhante ao descrito na seção 4.4. mas de forma mais vigorosa. Keep todos usados ​​médio (contendo ressuspenso RBC) em um tubo de 15ml cônico. Seleção em microscópio invertido que todos RBC foram removidos do prato. </li><li> Pellet os parasitas, desprezar o sobrenadante, ressuspender em meio RPMI 5ml completo e coloque a mistura em um frasco de cultura normal. </li></ol> 5. Resultados representante Parasitas não selecionados mostram um baixo nível de ligação a HBEC-5i (Figura 3A). Assim, após a primeira rodada de seleção, os parasitas poucos serão colhidos e pode demorar até um mês de cultura para chegar a uma parasitemia suficiente para a segunda rodada de seleção. Após cada rodada de seleção, mais parasitas e mais se ligam a células endoteliais e as seleções pode ser repetido em intervalos de tempo mais curto. Após 4-5 rodadas de seleção, as populações de alta ligação parasita são obtidos (Figura 3). Em nossas mãos, a ligação de HB3-HBEC para HBEC-5i ou ativado HBEC TNF-5i era de simhomólogos de nível (dados não mostrados). O protocolo descrito aqui foi testado com 4 p. cepas falciparum: HB3, IT/FCR3, 3d7 e DD2 (Tabela 1). Apenas o último não provou ser capaz de se ligar a HBEC-5i, mesmo depois de cinco rodadas de seleção. HB3 parasitas também foram selecionados para a citoaderência Humanos dérmica e pulmonar células endoteliais microvasculares (HDMEC e HPMEC). Após 4 rodadas de seleção, usando o método descrito aqui, uma população de alto-binding foi obtido em ambos os HDMEC e HPMEC (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visão geral do processo de seleção. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Estágios figura 2. Desenvolvimento de P. falciparum glóbulos vermelhos infectados. Esfregaço Giemsa visualizados sob microscópio com ampliação de 1000X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Exemplo típico de parasitas ligação a HBEC-5i. (A) A camada azul é HBEC-5i fixado em glutaraldeído e corados com Giemsa, visualizados sob microscópio com ampliação de 1000X. Fotos foram tiradas após uRBC e iRBC unbound foram lavados. O painel esquerdo mostra um único P. falciparum HB3 (não selecionados) parasita obrigado a HBEC-5i. No painel direito os parasitas HB3-HBEC tinha sido seleccionado para cinco rounds. (B) Os dados representam a média de dois experimentos independentes, cada uma realizada em duplicata. O número de parasitas obrigados por célula endotelial foi contado. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Resumo das cepas de Plasmodium falciparum que foram selecionados com sucesso para a ligação com HBEC Nota-5i. HB3 que também foi selecionado no TNF-activated HBCE-5i. Após 5 rodadas de seleção, a tensão DD2 não mostrou aumento na ligação para HBEC-5i comparação com unselected-DD2. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ligação do P. falciparum HB3 parasitas para dérmica (HDMEC) e pulmonar (HPMEC) células endoteliais, antes e depois de quatro rodadas de seleção. Embora o meio de cultura para HDMEC e HPMEC ligeiramente diferente (veja as instruções do fornecedor), o protocolo usado para a seleção foi idêntica como com HBEC-5i. Fotos tiradas com ampliação de 400X. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM-F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> L-glutamina 200mM </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Para DMEM e meio completo RPMI </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / 100X (10.000 unidades / ml e 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> Fetal bovino soro inativado pelo calor </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,025% Tripsina, 0,5 mM EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> Suplemento de crescimento da célula endotelial </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Por meio completo DMEM </td></tr><tr><td> Cultura de tecidos tratados 60 milímetros X 15 milímetros placas de Petri </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> A fibronectina humana </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> Use a 2 mg / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> R &amp;D Systems </td><td> 210-TA </td><td> opcional, use a 50 mg / ml </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167f </td><td> Por meio completo RPMI </td></tr><tr><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Por meio completo RPMI </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> BE17-737E </td><td> Por meio completo RPMI </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> Linhagem de células primárias </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> Linhagem de células primárias </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Obtido a partir de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Materiais

<ol><li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+malaria%3A+in+situ+switching%2C+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li>
<li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li>
<li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li>
<li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li>
<li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria%3A+sequestration%2C+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li>
<li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li>
<li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li>
<li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li>
<li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li>
<li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li>
<li>Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoll%2C+K+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , MR4/ATCC. (2009).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li>
<li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor%28s%29+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li>
<li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMP-420%2C+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li>
<li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

A marca da malária cerebral é o seqüestro de P. falciparum iRBC dentro do cérebro microvasculatura 2, 3. No entanto, em culturas in vitro de P. falciparum apenas mal cytoadhere para HBEC-5i, um modelo de cérebro humano endotélio microvascular. Aqui desenvolvemos um ensaio simples para enriquecer uma população para a ligação com HBEC-5i, um mais &quot;in-vivo, como&quot; fenótipo. Três em cada 4 p. cepas falciparum foram selecionados com sucesso usando este método. Além disso, HB3 também foi selecionado em HDMEC e HPMEC, indicando que este protocolo pode ser usado para vários tipos e parasita das células endoteliais. Diferentes hipóteses podem explicar a falta de ligação com a cepa DD2. O mais provável é o fato de que esta linha parasita é knobless, que impede a profundamente citoaderência 13, 14. Recomendamos parasitas cultura não selecionados ao longo do pro seleçãocesso para fornecer um controle para comparação. Isto irá permitir, por exemplo, comparando o transcriptoma de parasitas vinculativa e não vinculativa, com a esperança de descobrir candidatos ligante do parasita. TNF é uma citocina encontrados em nível elevado em pacientes com malária cerebral e foi mostrar para induzir a expressão de proteínas de superfície muitas das HBEC-5i (Claessens et al, em preparação e 8, 15, 16). Neste caso, a quantidade de iRBC ligada foi semelhante em HBEC-5i comparação com ativado HBEC-5i. Este &quot;modelo de sequestro&quot; também pode ser usado para estudar a interação molecular entre os iRBC e as células endoteliais, bem como o efeito do suposto anti-citoaderência drogas. Neste caso, recomendamos plating HBEC-5i em poços menores, tais como &quot;slides oito bem-câmara&quot; (BD 354628) ou &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

seleção de plasmodium falciparum parasitas para cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

A maioria das mortes por malária humana é causada por parasitas do sangue estágio Plasmodium falciparum. Malária cerebral, a complicação mais risco de vida da doença, é caracterizada por um acúmulo de Plasmodium falciparum glóbulos vermelhos infectados (iRBC) na fase trofozoíto pigmentada na microvasculatura do cérebro 2-4. Esta obstrução microvascular (seqüestro) leva à hipóxia, acidose e prejudiciais citocinas inflamatórias (revisto em 5). Seqüestro também é encontrado na maioria dos tecidos microvascular do corpo humano 2, 3. O mecanismo pelo qual iRBC anexar às paredes dos vasos sanguíneos é ainda mal compreendida. O imortalizado Human Brain microvascular linhagem de células endoteliais (HBEC-5i) tem sido usado como um modelo in vitro da barreira hemato-encefálica 6. No entanto, o Plasmodium falciparum iRBC anexar apenas mal ao HBEC-5i in vitro, ao contrário do sequestrat densaion que ocorre em casos de malária cerebral. Por isso, desenvolveu um ensaio panning para selecionar (enriquecer) p. vários cepas falciparum para adesão ao HBEC-5i, a fim de obter populações de alto-binding parasitas, mais representativa do que ocorre in vivo. Uma amostra de uma cultura parasita (mistura de RBC iRBC e não infectadas) na fase de trofozoíto pigmentada é lavado e incubado em uma camada de HBEC-5i cultivados em uma placa de Petri. Após a incubação, o prato é cuidadosamente lavado e livre de uRBC iRBC desacoplado. URBC fresco são adicionadas ao iRBC alguns anexados a HBEC-5i e incubadas durante a noite. Como parasitas estágio esquizonte estourar, merozoítos reinvade RBC e estes parasitas estágio anel são colhidas no dia seguinte. Parasitas são cultivadas até material suficiente é obtida (geralmente 2 a 4 semanas) e uma nova rodada de seleção pode ser realizada. Dependendo do P. falciparum tensão, 4-7 rodadas de seleção são necessários a fim de obter uma populaçãoonde a maioria dos parasitas se ligam a HBEC-5i. O fenótipo de ligação é progressivamente perdida depois de algumas semanas, indicando uma mudança na expressão do gene variante antígeno de superfície, assim, a seleção regulares sobre HBEC-5i é necessária para manter o fenótipo. Em resumo, nós desenvolvemos um ensaio de renderização seleção P. parasitas falciparum uma forma mais &quot;cerebral da malária adesivo&quot; fenótipo. Fomos capazes de selecionar 3 de 4 p. cepas falciparum em HBEC-5i. Este ensaio também tem sido usados ​​com sucesso para selecionar os parasitas para a ligação com humanos dérmica e pulmonar de células endoteliais. Importante, este método pode ser usado para selecionar populações de tecidos específicos do parasita, a fim de identificar ligantes do parasita candidato para a ligação ao endotélio cerebral. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para triagem de suposto seqüestro de anti-drogas 7.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para o seqüestro de malária cerebral é descrita<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Glóbulos vermelhos infectados são selecionados para a ligação com células cerebrais humanas imortalizadas microvascular endoteliais. Os parasitas selecionados mostram um fenótipo distinto. O processo de seleção pode ser aplicado usando diversos<em&gt; P. falciparum</em&gt; Cepas e linhagens de células endoteliais.

Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

A maioria das mortes por malária em humanos é causada por parasitas *Plasmodium falciparum* no estágio sanguíneo. A malária cerebral, a complicação mais letal da...

O objetivo geral deste procedimento é selecionar plasmodium, fpar e parasitas para ligação a células endoteliais cerebrais humanas. Isso é realizado primeiramente incubando uma cultura de plasmodium, fpar e parasitas, que contém uma mistura de hemácias infectadas e não infectadas, com uma camada de células endoteliais cerebrais humanas. O próximo passo é lavar as hemácias não infectadas e não ligadas, realizando várias lavagens com meio de cultura. Em seguida, são adicionadas hemácias frescas para permitir o crescimento adicional da população de parasitas.O passo final, algumas semanas depois, consiste em repetir a seleção geral assim que um número suficiente de parasitas for alcançado. Em última análise, a microscopia é utilizada para demonstrar uma alta quantidade de parasitas ligados às células epiteliais bronquiais humanas (HBE) cinco i. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da malária cerebral, como a identificação de ligantes parasitários ou moléculas receptoras do hospedeiro envolvidas no processo de citoadsorção.Prepare os eritrócitos humanos a partir de sangue total do grupo O positivo separando os eritrócitos dos leucócitos por meio da passagem através de um filtro de esgotamento de leucócitos. Centrifugue as células a 1000 G por 10 minutos e ressuspenda o pellet com todo o PMI. Meio incompleto.Repita este passo de lavagem mais uma vez, então re-suspenda o pellet. Em nosso meio PMI incompleto com hematócrito de 50%, os glóbulos vermelhos são armazenados a quatro graus Celsius durante uma semana. Cultive os glóbulos vermelhos infectados com Odium Valspar.Com meio RPMI completo a 2% de hematócrito, incubar a 37 graus Celsius com 3% de dióxido de carbono, 1% de oxigênio e 96% de nitrogênio diariamente. Prepare um esfregaço de gemas para avaliar a fase de desenvolvimento dos parasitas. Troque o meio diariamente centrifugando o cultivo a 500 G durante cinco minutos.Aspirar o sobrenatante e adicionar meio RPMI completo fresco cerca de uma vez por semana. Sincronizar os parasitas por tratamento com sorbitol aquoso a 5%. O ensaio de seleção pode ser realizado no dia seguinte a um cultivo em estágio anelar, quando for observado um mínimo de 5% a 10% de parasitemia.Além disso, é necessário um volume suficiente de cultura de parasitas para formar um volume celular P de 30 microlitros por placa de 60 milímetros de células hbe cinco olho. Prepare uma placa de cultura tecidual de 60 milímetros para receber a linhagem de células endoteliais microvasculares do cérebro humano ou H de volta cinco i, adicionando dois microgramas por centímetro quadrado de fibronectina e salina estéril à placa.Incube o recipiente a 37 graus Celsius por cinco a 20 minutos, depois aspire a solução de fibronectina. Em seguida, colete as células HBE cinco I de um frasco de tecido de 25 centímetros quadrados por ionização e centrifugação Reese, suspenda o pellet celular em 10 mililitros de DMEM, meio completo. Em seguida, adicione 1,5 mililitro dessa suspensão celular ao recipiente de cultura de tecido tratado com fibronectina e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias, até que o cultivo atinja 50 a 100% de confluência e os cultivos de parasitas estejam prontos para citocianina no dia do ensaio.A cultura de HBE cinco I deve estar com cofluência de 50 a 100%. Enquanto isso, a cultura de parasita deve estar na fase de trofozoítas pigmentados, com pelo menos 5 a 10% de parasitas e 2% de hematócrito. Primeiro, pipete 1,5 mililitro da cultura de parasita do frasco de cultura e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugue a cultura a 500 G durante cinco minutos e ressuspenda em 10 mililitros de DMEM incompleto, um meio previamente aquecido. Repita este passo de lavagem uma segunda vez após a conclusão da centrifugação final.Aspire o meio DMEM incompleto e re-suspenda o pellet de 30 microlitros em 1,5 mililitros de DMEM incompleto, suplementado com 1% de BSA. Em seguida, recupere a placa de 60 milímetros de hvac.Five.As células oculares aspiram o meio de cultura e lavam duas vezes com três mililitros de DMEM. Meio incompleto. Adicione a solução de parasitas, o prato de cinco células oculares HPE e incube no incubador de cultura de tecidos por um total de 75 minutos.Duas vezes durante a incubação, resuspenda os parasitas agitando suavemente e girando o recipiente após a incubação. Lave o recipiente cinco vezes, aspirando o meio com uma pipeta plástica tipo espaguete, adicionando três mililitros de meio DMEM incompleto aquecido e, em seguida, agitando suavemente a placa. Após a lavagem final, examine o recipiente em um microscópio invertido. Se muitas hemácias não infectadas ainda estiverem visíveis, repita o procedimento de lavagem conforme descrito acima para removê-las.Após aspirar o meio do recipiente, ressuspenda 40 microlitros de volume celular empacotado de hemácias frescas em meio RPMI completo aquecido e adicione a suspensão celular ao recipiente. Coloque o recipiente em uma câmara de incubação com ar. Em seguida, borbulhe o recipiente com 3% de dióxido de carbono, 1% de oxigênio e 96% de nitrogênio por três minutos.E coloque a câmara em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. Durante essa incubação, os esquizontes em estágio de parasitas rompem e merozoítos reinfectam as hemácias. No dia seguinte, colete os parasitas em estágio anelar lavando.Com meio RPMI incompleto, de maneira semelhante ao anterior, mas com pipetagem mais vigorosa do meio e agitação da placa. Mantenha todo o meio utilizado, que conterá os eritrócitos em suspensão, em um tubo cônico de 15 mililitros. Verifique a placa ao microscópio invertido para assegurar que todos os eritrócitos tenham sido removidos da placa antes da centrifugação.O tubo contendo o meio da placa lavada para centrifugar os parasitas, descarte o sobrenadante e ressuspenda em cinco mililitros de meio RPMI completo e coloque a mistura em um frasco quadrado de 25 centímetros quadrados para cultivo. Os parasitas são cultivados por duas a quatro semanas até que seja obtido material suficiente e uma nova rodada de seleção possa ser realizada.Parasitas HB três não selecionados mostram um baixo nível de ligação às células endoteliais hbe cinco. Esta imagem mostra células hbe cinco fixadas com 2% de glutaraldeído e coradas com Giemsa, visualizadas ao microscópio com aumento de 1000 vezes. As imagens foram obtidas após a lavagem de glóbulos vermelhos não infectados e de glóbulos vermelhos infectados não ligados. Após cada rodada de seleção, um número crescente de parasitas se liga às células endoteliais, e as seleções podem ser repetidas em intervalos de tempo mais curtos após cinco rodadas de seleção.Populações de parasitas com alta capacidade de ligação são obtidas, como mostrado aqui com os parasitas HB três HBE. Esta tabela apresenta um resumo das linhagens de Plasmodium alspar que foram selecionadas com sucesso para ligação ao HE cinco. Observo que HB três também foi selecionado em HE cinco ativado por TNF após cinco rodadas de seleção.A linhagem DD dois não mostrou aumento na ligação a HBE cinco I em comparação com a DD dois não selecionada. Esta imagem com aumento de 400 vezes mostra a ligação de parasitas plasmodium alspar HB três a células endoteliais dérmicas HD MEK antes da seleção. Aqui, a ligação de parasitas plasmodium alspar HB três à mesma linhagem de células endoteliais dérmicas é mostrada após quatro rodadas de seleção.Esta figura mostra a ligação de parasitas Plasmodium spar HB três a células endoteliais pulmonares HP ME antes da seleção. Agora, a ligação de parasitas Plasmodium spar HB três às células HP ME aumentou após quatro rodadas de seleção. Embora o meio de cultura para hd e, C e HP EC difira ligeiramente, o protocolo utilizado para a seleção foi idêntico ao do hbe cinco I. Após este procedimento, métodos como R-T-P-C-R ou microanálise podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como caracterizar a transcrição do antígeno de superfície variante em parasitas não selecionados e selecionados.

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Research

JoVE Journal

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