Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

O objetivo geral deste procedimento é coletar o RNA total de núcleos cerebrais discretos de maneira repetível, consistente, econômica e livre de RNAs. Isso é feito primeiro preparando um ambiente de trabalho livre de RN e removendo todo o cérebro de um camundongo decapitado. Em seguida, um picador de tecido operado por micrômetro é usado para cortar seções de tecido em série de tamanho uniforme.

Em seguida, as regiões cerebrais de interesse são microdissecadas usando um núcleo de tecido de diâmetro definido, mantendo o tecido em um ambiente de meio livre de RNA. Finalmente, o RNA total é isolado dos núcleos cerebrais excisados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram rendimento e qualidade de RNA total suficientes para a preparação da biblioteca de CDNA a jusante e perfil do transcriptoma por meio de ensaios fotométricos ou fluorométricos de espectros.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a excisão da região cerebral assistida por microscopia anatômica grosseira ou de captura a laser, é que várias regiões cerebrais discretas de interesse podem ser coletadas de um cérebro de camundongo individual de maneira repetível e de custo suficiente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como se perfis distintos de expressão de transcrição dentro de regiões cerebrais associadas a nenhum circuito neuronal podem estar correlacionados com certos traços comportamentais, respostas ambientais e/ou estado de doença. Para se preparar para a microdissecção, suplemente 100 mililitros de solução salina balanceada de Earl ou EBSS com 0,44 gramas de bicarbonato de sódio e 0,884 gramas de glicose.

Trate o EBSS com 0,1 mililitros de DEPC em um frasco ou frasco autoclavável com tampa de rosca por pelo menos 12 horas. A 37 graus Celsius. Coloque pipetas de vidro de cinco e três quartos de polegada em um copo de vidro de um litro e coloque pincéis de artista com cerdas voltadas para cima em um cilindro graduado de vidro de 100 mililitros.

Adicione solução de água tratada com DEPC suficiente para cobrir as pipetas e escovas. Cubra o béquer e o cilindro graduado com papel alumínio e incube por pelo menos 12 horas a 37 graus Celsius após a incubação de 12 horas com DEPC, aqueça todos os materiais tratados com DEPC a uma temperatura superior a 100 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Fresco. O EBSS à temperatura ambiente antes do armazenamento a quatro graus Celsius.

Despeje o DD H2O do béquer e do cilindro graduado e continue a incubá-los a mais de 100 graus Celsius até que os materiais estejam secos. Retire-os da incubadora, deixe esfriar em temperatura ambiente e guarde para uso posterior. No dia do experimento, trate todas as superfícies de trabalho para remover o local de contaminação por RNAs e mantenha o EBSS em banho-maria ajustado a 40 graus Celsius para tamponar e oxigenar.

O EBSS se infiltra com 5% de CO2 e 95% de oxigênio, colocando tubos de gás em uma pipeta de pastagem livre de RNA. E inserindo a pipeta no EBSS, cubra a abertura do recipiente EBSS. Configure um cortador de tecido para seccionamento em série do tecido cerebral.

Trate as superfícies superior e inferior do cortador de tecidos. Para remover a contaminação por RNAs, prenda um pedaço retangular de papel de filtro número quatro na superfície de acrílico do picador de tecido. Prenda uma lâmina de barbear de dois gumes ao braço do picador.

Coloque o micrômetro em zero e ajuste a altura mínima do braço do picador para permitir que a lâmina de barbear corte o papel de filtro, mas não a placa de plexiglass. Reúna todos os materiais adicionais necessários para a microdissecção, incluindo placas de cultura de células livres de RNA de 60 por 15 milímetros, pontas de micropipeta de micro litros sem RNA de 200 microlitros, tesouras curvas, gelo seco e tubos para coleta de tecidos. Coloque os tubos em gelo seco depois de decapitar um camundongo usando uma guilhotina de roedor e remover todo o cérebro com o cérebro posterior e os nervos ópticos intactos.

Coloque o cérebro no topo de uma placa de cultura de células livres de RNAs de 60 por 15 milímetros. Em seguida, transfira-o para a superfície de trabalho de amostragem de tecido. Use uma pipeta livre de RNAs para umedecer de forma conservadora o papel de filtro preso ao picador de tecidos com EBSS.

Molhe o tecido cerebral com EBSS. Transfira o cérebro para o picador de tecidos e posicione-o com a superfície ventral apoiada no papel de filtro. A linha média perpendicular à lâmina do picador e a borda rostral do cérebro adjacente à lâmina.

Use o pincel de artista tratado com ADPC para manter o cérebro parado, aplicando uma leve pressão na superfície dorsal do cérebro enquanto mantém o cérebro parado. Levante a alavanca do porta-lâminas cerca de quatro a cinco centímetros acima da superfície do tecido dorsal e segure-a nesta posição. Remova a escova da superfície do cérebro e disque 750 micrômetros.

Usando o micrômetro. Deixe a alavanca cair, cortando o tecido e criando uma seção coronal de 750 micrômetros enquanto a lâmina do picador permanece estacionária. Use um movimento de rolamento com o pincel do artista para deslizar suavemente a seção de tecido para longe da superfície da lâmina.

Coloque imediatamente a seção de tecido no EBSS oxigenado na placa de Petri. Esta fatia está agora pronta para microdissecção. Repita o procedimento de corte até que seções cerebrais seriadas tenham sido obtidas em todo o plano codal rost para realizar a microdissecação.

Primeiro, verifique a iluminação para garantir que a iluminação da amostra não seja obstruída. Ajuste a posição e o fluxo da mistura de O2 CO2 para manter um ambiente oxigenado tamponado para o tecido. Durante o procedimento, identifique a seção coronal do cérebro que inclui a região de interesse e, usando um pincel de artista, oriente-a no fundo da placa de Petri.

Selecione o núcleo de tecido com o diâmetro apropriado. Segure a seção de tecido coronal no lugar com o pincel do artista e traga a ponta de corte do núcleo de tecido para baixo sobre a superfície da seção de tecido. Enquanto aplica pressão, pressione a ponta do núcleo do tecido através da seção do tecido e para baixo firmemente no fundo da placa de Petri.

Use um movimento circular rolante para garantir que a região de interesse tenha sido dissociada do tecido circundante. Levante cuidadosamente o núcleo do tecido para longe da seção do tecido e libere o micro punção, permitindo que ele flutue no EBSS usando um pincel de artista. Deposite imediatamente o micro perfurador de tecido em um tubo de armazenamento estável de 80 graus Celsius negativos mantido em gelo seco.

O tecido deve aderir prontamente à lateral do tubo. Retorne a microsampo contendo o tubo para o gelo seco. Repita essa microdissecção para cada região do cérebro de interesse.

Quando a microdissecção estiver concluída, registre a respectiva etiqueta ou códigos de barras para cada amostra contendo tubo. Coloque as amostras de tecido em um freezer de 80 graus Celsius negativos até a extração do RNA para extrair o RNA das amostras de tecido. Primeiro, prepare um espaço de trabalho livre de RNA.

Faça uma quantidade suficiente de mistura de esferas magnéticas e solução de ligação de lise, conforme descrito no manual do kit de isolamento de RNA total. Remova as amostras de tecido do freezer de 80 graus Celsius negativos e coloque os tubos diretamente no gelo seco. Adicione 100 microlitros da solução de ligação de lise a um tubo de amostra.

Conecte um pilão de tubo de 0,5 mililitro sem nuclease ao misturador de pellets e homogeneize o tecido usando uma ponta de pipeta livre de nuclease de baixa retenção. Transfira a amostra homogeneizada para um poço em uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços usando o mesmo tipo de ponta imediatamente. Adicione 60 microlitros de isopropanol 100% à amostra.

Adicione 20 microlitros da mistura de grânulos à amostra e misture pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes. Siga as etapas do protocolo do kit de isolamento de RNA total para concluir a extração de RNA total. Finalmente, meça a pureza e a concentração do RNA total resultante Os dados de micro socos de várias regiões do cérebro são mostrados nesta tabela.

Amostras de RNA aludidas com 30 microlitros de tampão de evolução forneceram RNA total suficiente para uso com produtos de preparação de CD NA disponíveis comercialmente para aplicações de sequenciamento de RNA. Além disso, o rendimento de RNA e duas proporções de 60 a dois 80 são valores únicos obtidos das respectivas amostras de microdissecção para demonstrar as leituras obtidas de cada região do cérebro e confirmam a alta pureza da amostra Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em oito a 10 minutos se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de minimizar o risco de contaminação por RNA de superfícies de trabalho ou amostras de tecido usando apenas materiais livres de RNA ou tratados com dsy.