Name: Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a monitorar dinâmica espaciotemporal de eventos de sinalização durante quimiotaxia em Dictyostelium discoideus usando microscopia confocal de fluorescência avançada. Este método permite visualizar ativação de proteínas G e produção de PIP3 em células vivas.

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Este trabalho é apoiado pelo fundo intramural do NIAID, NIH.

1. Preparação de células competentes quimiotática de Dictyostelium discoideum <ol><li> Para gerar células discoideum D. que são quimiotáticos para o acampamento chemoattractant, células colheita crescendo em D3-T rich media de uma cultura agitação a 22 ° C. </li><li> Lave as células duas vezes em não-nutrientes tampão de desenvolvimento (buffer DB contendo 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2, e 0,1 mM CaCl 2). </li><li> Re-suspender as células em tampão DB a uma densidade de 2x10 7 células / ml. </li><li> Agite 10 células ml em um frasco de 250 ml a 100 rpm a 22 ° C durante uma hora. </li><li> Entregar 100 l de 7,5 mM de ações cAMP aos 10 células ml cada seis minutos mais de 6 horas para obter uma concentração final de 75 nM cAMP, um processo designado como tratamento cAMP pulsante. Após 5-6 horas de tratamento cAMP pulsante, D. células discoideum se tornar competente na direção do gradiente quimiotático cAMP. </li><li> Coletar células por centrifugação a 200 g por 5 min e depois ressuspender as células com tampão contendo 2,5 DB cafeína mM, e agitar a 200 rpm a 22 ° C por 20 min para basolate célula para uma situação quimiotáticos. </li></ol> 2. Células imagem chemotaxing em um gradiente chemoattractant visível e manipulável <ol><li> Backfill micropipeta um com um recém-preparados 30 mL de solução de 1 mM cAMP e Alexa 594 em 0.1μg/μl em tampão DB. </li><li> Anexar o Femtotip a um detentor micropipeta e conectar o tubo a um aparelho de alimentação de pressão, Eppendorf sistema FemtoJet. </li><li> Prender o conjunto de micropipeta para um micromanipulador (Eppendorf TransferMan NK2) motorizada micromanipulador para fornecer uma pressão constante, a fim de estabelecer um gradiente estável. </li><li> Montar uma bem-câmara LabTek preenchido com 6 ml de tampão DB sobre uma lente de 40X de óleo em um microscópio confocal e uso brilhante de campo óptica, o centro Femtotip para o campo de visão. </li><li> Ligue a fonte de pressão e ajustar a pressão de compensação (Pc) para 70 hPa para estabelecer um gradiente de campo / Alexa 594 mistura. </li><li> Visualize gradiente cAMP através do monitoramento da mistura de concentração desejada de cAMP e fluorescência Alexa 594 usando uma linha de excitação com laser de 543 nm. </li><li> Use auto-posicionamento função do micromanipulador para colocar micropipeta para as posições desejadas e defini-las como posição 1, posição 2, 3 e posição para manipular o gradiente a que estão expostos a célula. </li></ol> 3. Sistema de célula de imóveis nonpolarized facilita eventos de imagens de sinalização envolvidos na cAMP gradiente de sensoriamento <ol><li> Após o tratamento a cafeína, retire uma alíquota de células e centrifugar a 500 g por 3 min. </li><li> Remover tampão e diluir as células a 5x10 5 células / ml com tampão contendo 2,5 DB fresco cafeína mM. </li><li> Aplicar 1 ml de suspensão de células de uma única câmara-assim ou 0,4 ml a cada poço de uma câmara de quatro bem. </li><li> Permitir que as células aderem por 10 min, com cuidado pipeta fora do tampão para remover as células solto e substituir com o mesmo volume. </li><li> Localizar as células desejadas sob o microscópio e começar de imagem. </li><li> Para um experimento projetado para monitorar a dinâmica de sinalização nas células componentes expondo a um gradiente estabilizado, tratar as células com 5,0 mM (concentração final) Latrunculin B por 10 min antes dos experimentos. </li></ol> 4. Simultânea de monitoramento heterotrimeric ativação da proteína G e PIP 3 produção <ol><li> cAMP pulsando desenvolver células co-expressando GαCFP e YFPGβ (células G) e células que expressam PIP 3 Indicador de PH GFP (células PH) 7. </li><li> Misture estes dois tipos de células com relação de 1:1 e placa-los em câmaras de um bem ou quatro poços. </li><li> Criar e salvar a emissão de impressões digitais de referência da curva PCP, YFP e GFP utilizando Lambda modo de Aquisição de pilha dentro da faixa espectral 464-624 nm com uma largura de 10 nm. </li><li> Simultaneamente ativação da proteína G de imagem em células G e produção PIP 3 em células PH usando com o mesmo modo de Aquisição Stack Lambda dentro da faixa espectral 464-544 nm com incrementos de 10 nm. </li><li> Aplicar função desmistura Linear Zeiss de software usando 510META salvo CFPand YFP e impressões digitais de emissão para calcular matematicamente a contribuição de cada fluoróforo na Stack Lambda para separar o PCP ea intensidade YFP em canais individuais em G. </li><li> Com a mesma estratégia, aplicar função desmistura Linear usando GFP salvos e impressões digitais de emissão de fundo para calcular matematicamente intensidade GFP em células PH. </li></ol> 5. Resultados representativos: <ol><li> Um sistema excelente modelo de D. discoideum para GPCR quimiotaxia mediada. A ameba social, D. discoideum exibe uma impressionante quimiotaxia durante o ciclo de vida. Devido às suas vantagens genéticas e bioquímicas, D. d fornece uma poderosa sistema para estudar a quimiotaxia. </li><li> Quimiotaxia de células em um campo visível e manipulável chemoattract. Aqui, mostramos primeiro uma metodologia simples para obter uma relação linear entre a concentração de cAMP e da intensidade de um corante fluorescente Alexa 594 por uma série de diluição de 2 cAMP M misturado com 10 mg / mL Alexa 594 (Fig. 2A). Em seguida, fornecer uma maneira fácil de visualizar o gradiente, além disso, estabelecer uma medida quantitativa da concentração de cAMP de um gradiente pela intensidade do Alexa 594 (Fig. Fig.. 2B). </li><li> Motilidade celular é desacoplado com polarização celular e detecção direcional. Um inibidor de polimerização de actina elimina pré-existentes polaridade morfológicas e também impede a movimentação das células, mantendo a capacidade das células de detecção direcional (Fig. 3A). Emprego de estimulação cAMP visível e manipulável garante a entrada, por exemplo estímulos uniformemente aplicada ou um gradiente. Este método permite uma análise quantitativa de AMPc induzida redistribuição dos principais componentes de sinalização nas máquinas gradiente de detecção. Medida dinâmica espaço-temporal destes componentes de sinalização nos permitem compreender como a rede de sinalização alcança a adaptação aos estímulos uniforme ao gerar polarizada respostas bioquímicas a gradientes (Fig. 3B). </li><li> Medições sistêmica da cinética de chemosensing rede de sinalização após a exposição a um gradiente constante. É fundamental para medir a dinâmica / cinética da direcionais de detecção de sinalização componentes para entender como cada componente contribui para o estabelecimento de polarização intracelular quando as células experiência primeiro gradiente. Aplicação de imagens de células vivas com um ritmo de alta resolução espacial, primeiro mostrar uma produção PIP3 bifásica de celular que é exposto a um gradiente de cAMP constante (Fig. 4A-C). Aplicação de imagens de células vivas, temos sistematicamente medida dinâmica da direcionais de detecção de rede de sinalização específicas de estímulo para cAMP PIP3 de produção (Fig. 4D, E). </li><li> Simultânea de monitoramento ativação da proteína G e heterotrimeric PIP 3 a estimulação da produção de AMPc uniformemente aplicadas. Förster ressonância a transferência de energia (abreviado FRET) constitui uma estratégia eficiente para monitorar a ativação da proteína G heterotrimeric (dissociação) com a estimulação do AMPc. Aqui, descrevemos um sistema de fácil adotar conveniente para uma medição simultânea de ativação da proteína G heterotrimeric e produção PIP 3 monitorando o FRET mudança e translocação de membrana de PIP 3 sonda, PH GFP-in G e células PH, respectivamente (Fig. 5 ). A estimulação cAMP uniformemente aplicadas desencadeia uma ativação da proteína G persistente, enquanto que desencadeia um transiente PIP 3 produção. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Um sistema excelente modelo de D. discoideum para quimiotaxia mediada GPCR. A. Esquema mostra um caminho breve sinalização de detecção direcional. B. gradiente AMPc induz quimiotaxia rápida de D. células discoideum. Células expressam sonda PIP 3, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) é visualizado por Alexa 594. Barra de escala = 50 ìm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Quimiotaxia de células sob uma campos visíveis e manipuláveis ​​chemoattract. A. Gráfico mostra uma relação linear entre a concentração de cAMP e da intensidade de um corante fluorescente Alexa 594 por uma série de diluição de 2 cAMP M misturado com 10 mg / mL Alexa 594. B. Determinação quantitativa da concentração de cAMP de um gradiente pela relação linear da concentração de cAMP e intensidade do corante fluorescente Alexa em 594 A. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: motilidade celular é desacoplado com polarização celular e detecção direcional. Imagem A. mostra que as células imóvel pelo tratamento de actina inibidor de polimerização Latrunculin B manter a capacidade de detecção direcional. Células expressam sonda PIP 3, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) é visualizado por Alexa 594. B. cAMP manipulável sistema de célula de estimulação e imóvel permite abordar questões-chave de detecção direcional. Barra de escala = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: medidas sistêmicas da cinética de chemosensing rede de sinalização após a exposição a um gradiente constante. A. Montagem mostra um bifásico PIP 3 produção (Verde) do celular que é exposto a um gradiente de cAMP estacionário (vermelho). B. A imagem mostra as regiões de interesse (ROIs) para a medição da cinética de produção PIP 3 apresentados em C. C . Kinetics of PIP 3 de produção nas células expostas a um gradiente constante. D. Esquema mostra a rede de sinalização de detecção direcional de estímulo à produção de cAMP PIP 3. Sua cinética após a exposição a um gradiente de equilíbrio é apresentado nas linhas de mesma cor sólida em E. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: monitoramento simultâneo de vários eventos de redes GPCR sinalização. Esquema de A. mostra a medição simultânea de ativação da proteína G heterotrimeric e produção PIP 3 monitorando o FRET mudança e translocação de membrana de PIP3 sonda, PH-GFP em células G e PH, respectivamente. B. Montagem de imagens arco-íris de G e células PH mostra que um estímulo cAMP uniformemente aplicadas desencadeia uma ativação da proteína G persistente na célula periféricos, enquanto que desencadeia uma produção PIP3 transitória. Os momentos são antes (0s) e após a estimulação para 4.9s, 10.2s e 20.4s. C. Cinética de ativação da proteína G e PIP3 produção em cima de um estímulo cAMP uniformemente aplicadas.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
<li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li>
<li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li>
<li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li>
<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li>
<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os processos de atingir estágio competente quimiotáticos de células Para o tipo selvagem D. células discoideum, leva cerca de 5 ~ 6 horas pulsando desenvolvimento à temperatura ambiente para induzi-los em um estágio bem quimiotáticos competente durante o qual células apresentam uma morfologia bem polarizada celular e migração celular rápida (Fig. 1). Vários fatores, tais como a concentração de cAMP pulsação, temperatura e diferentes origens genéticas, podem afetar o processo d...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> D3-T meios de crescimento </td><td> KD Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cafeína </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Sondas moleculares </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Sondas moleculares </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol temporizador programável XT </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 bomba peristáltica </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plataforma agitador rotativo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet alimentação de pressão microcapilar </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Único e quatro bem-Lab-Tek II lamela câmaras </td><td> Nalge Nunc Internacional </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM META 510 ou microscópio de fluorescência equivalente </td><td> Zeiss </td><td></td><td> um 40X 60X 1,3 ou 1,4 NA NA óleo lente objetiva DIC Plano Neofluar- </td></tr><tr><td> Olympus X81 ou equivalente </td><td> Olimpo </td><td></td><td> Requer um 100X 1,47 NA TIRF lente objetiva </td></tr></tbody></table>

receptor de imagem proteína g-coupled (gpcr) mediada por eventos de sinalização que quimiotaxia de controle de dictyostelium discoideum</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Muitas células eucarióticas pode detectar gradientes de sinais químicos em seus ambientes e migrar de acordo 1. Esta migração celular guiada é referido como quimiotaxia, que é essencial para várias células para realizar suas funções, tais como tráfico de células do sistema imunológico e padronização de células neuronais 2, 3. A grande família de G receptores acoplados à proteína (GPCRs) detecta variável pequenos peptídeos, conhecido como quimiocinas, para dirigir a migração celular in vivo 4. O objetivo final da quimiotaxia pesquisa é compreender como um sentidos máquinas GPCR quimiocina gradientes e controles de sinalização eventos que levam a quimiotaxia. Para este fim, usamos técnicas de imagem para monitorar, em tempo real, as concentrações de espaço-temporal de quimioatrativos movimento celular, em um gradiente de chemoattractant, GPCR mediada ativação da proteína G-heterotrimeric, e eventos de sinalização intracelular envolvidas na quimiotaxia de células eucarióticas 08/05 . O organismo simples eucarióticas, Dictyostelium discoideum, exibe comportamentos quimiotático que são semelhantes aos de leucócitos, e D. discoideum é um sistema modelo para estudar a quimiotaxia chave eucarióticas. Como amebas de vida livre, D. discoideum células dividem-se em meio rico. Após a fome, as células entrar em um programa de desenvolvimento em que agregada através AMPc mediada por quimiotaxia para formar estruturas multicullular. Muitos componentes envolvidos na quimiotaxia ao AMPc foram identificados em D. discoideum. A ligação de AMPc a um GPCR (car1) induz a dissociação da heterotrimeric G-proteínas em Gγ e subunidades Gβγ 7, 9, 10. Subunidades Gβγ ativar Ras, que por sua vez ativa PI3K, convertendo PIP PIP 2 em 3 na membrana celular 11-13. PIP 3 servem como sítios de ligação para proteínas com pleckstrin Homologia (PH) domínios, assim, o recrutamento dessas proteínas para a membrana 14, 15. Ativação de receptores car1 também controla as associações de membrana de PTEN, que desfosforila PIP PIP 3 a 2 16, 17. Os mecanismos moleculares são evolutivamente conservada em quimiotaxia quimiocina GPCR mediada das células humanas, tais como neutrófilos 18. Nós apresentamos métodos a seguir para estudar a quimiotaxia de D. células discoideum. 1. Preparação de células componentes quimiotáticos. 2. Quimiotaxia de imagem de células em um gradiente de cAMP. 3. Monitoramento de uma ativação induzida de GPCR heterotrimeric proteína G-in único de células vivas. 4. Imagem PIP chemoattractant dinâmica desencadeada três respostas em um único células vivas em tempo real. Nossos métodos de imagem desenvolvida pode ser aplicada para estudar a quimiotaxia de leucócitos humanos.

Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Muitas células eucarióticas conseguem detectar gradientes de sinais químicos em seus ambientes e migrar adequadamente 1. Essa migração celular guiada é referida como...

O objetivo geral deste procedimento é aplicar microscopia confocal de fluorescência avançada para monitorar a dinâmica espaço-temporal de eventos de sinalização durante a quimiossensação em células de Dictyostelium discoideum. Primeiro, células de Dictyostelium discoideum primeiramente competentes para quimiotaxia são preparadas. Em seguida, um gradiente controlado de quimioatraente é imageado para estabelecer uma relação linear entre a concentração do quimioatraente e a intensidade fluorescente do quimioatraente. O terceiro passo é obter um sistema de células imóveis para imagear eventos de sinalização envolvidos na detecção de gradientes de AMP cíclico.O passo final consiste em monitorar simultaneamente dois eventos de sinalização controlados por receptores acoplados à proteína G em células vivas: a ativação da proteína G heterotrimérica e a produção de PIP três. Em última instância, alterações espaço-temporais nas intensidades de fluorescência em células individuais que são estimuladas com um quimioatraente. O AMP cíclico pode ser visualizado por meio de imagem em tempo real de células vivas utilizando microscopia confocal avançada.A principal vantagem dessa técnica é permitir a obtenção de informações espaciais e temporais sobre eventos de sinalização em células vivas. Essas medidas em tempo real permitem uma melhor compreensão de como a rede de sinalização de receptores acoplados à proteína G (A-G-P-C-R) é capaz de detectar um componente quimiotático e gerar respostas adequadas. O procedimento será demonstrado pela Dra. Shu, especialista em métodos de imagem em tempo real. Para gerar células de dsco dium quimiotáticas ao agente quimiotático AMP cíclico, colete células em crescimento em meio D três trich a partir de um cultivo agitado a 22 graus Celsius.Lave as células duas vezes em tampão de desenvolvimento sem nutrientes por centrifugação a 400 Gs durante cinco minutos. À temperatura ambiente, ressuspenda as células no tampão DB em uma densidade de duas vezes 10 à sétima células por mililitro. Transfira 20 milhões de células em 10 mililitros de tampão de desenvolvimento para um frasco de 250 mililitros e, em seguida, agite as células a 100 RPM a 22 graus Celsius por uma hora.Em seguida, adicione 100 microlitros de uma solução estoque de 7,5 micromolar de AMP cíclico às 10 mililitros de células a cada seis minutos durante as próximas seis horas, para atingir uma concentração final de 75 anômolares de AMP cíclico. Agora, colete as células competentes quimiotáticas ao AMP cíclico por centrifugação, desta vez a 200 ×g, e então re-suspenda as células em tampão DB contendo cafeína a 2,5 milimolar. Agite novamente as células a 22 graus Celsius por 20 minutos, desta vez a 200 RPM, para dessensibilizar as células para quimiotaxia.Primeiro, preencha retroativamente uma micropipeta com uma solução recém-preparada de 30 mililitros de AMP cíclico de um micromolar e Alexa 594 a 0,1 microgramas por microlitro em tampão DB. Em seguida, acople uma ponteira Femto a um suporte de micropipeta e conecte a tubulação a um aparelho de suprimento de pressão. Para estabelecer um gradiente estável, fixe o conjunto da micropipeta a um micromanipulador motorizado.Preencha uma câmara de laboratório com uma única cavidade com seis mililitros de tampão DB e, em seguida, posicione a câmara sobre uma objetiva de imersão em óleo de 40x em um microscópio confocal, utilizando a óptica de campo claro para centralizar a ponta Femto no campo de visão. Em seguida, ligue a fonte de pressão e ajuste a pressão de compensação para 70 hPa para estabelecer um gradiente da mistura de AMP cíclico e Alexa 594. Visualize o gradiente de AMP cíclico monitorando a mistura na concentração desejada de AMP cíclico e a fluorescência do Alexa 594, utilizando uma linha de laser de excitação de 543 nanômetros.Por fim, utilize a função de posicionamento automático do micromanipulador para posicionar a micropipeta nas posições desejadas e defina a posição um, posição dois e posição três, nesta ordem, a fim de manipular o gradiente ao qual as células são expostas. Após o tratamento com cafeína, retire uma alíquota de células e pelote as células a 500 Gs durante três minutos. À temperatura ambiente, remova o tampão e dilua as células até cinco vezes 10 à quinta células por mililitro.Com tampão DB fresco contendo cafeína 2,5 milimolar. Em seguida, aplique um mililitro da suspensão celular em uma câmara de poço simples. Após permitir que as células adiram por 10 minutos, remova cuidadosamente o tampão com pipeta para eliminar as células não aderidas e, então, substitua pelo mesmo volume de tampão DB fresco com cafeína para iniciar a aquisição de imagens, localizando as células desejadas sob o microscópio.Em seguida, para monitorar a dinâmica dos componentes de sinalização em células expostas a um gradiente constante. Trate as células com cinco micromolares de LA truculent B por 10 minutos antes de qualquer experimento. Este esquema mostra uma breve via de sinalização de detecção direcional neste filme.Pode-se observar como um gradiente cíclico de A MP induz quimiotaxia rápida de células D discost, células que expressam a sonda PIP três. P-H-G-F-P aparece em verde. O gradiente, conforme visualizado por Alexa 5 94, aparece em vermelho. Aqui.Um método simples para obter uma relação linear entre a concentração de AMP cíclico e a intensidade de um corante fluorescente. É apresentada uma série de diluições de dois micromolares de AMP cíclico misturados com 10 microgramas por mililitro de Alexa 594.Em seguida, é demonstrado graficamente um método simples para estabelecer uma medida quantitativa da concentração cíclica de AMP em um gradiente pela intensidade da Alexa 594. Esta figura mostra como células cuja motilidade foi suprimida pela latrunculina B, um inibidor da polimerização da actina, ainda mantêm sua capacidade de senso direcional. As células expressam a sonda para PIP3, P-H-G-F-P, e aparecem verdes, enquanto o gradiente em vermelho é visualizado pela Alexa 594.Neste vídeo, pode-se observar como o uso de um sistema celular simplificado não polarizado e a estimulação cíclica manipulável de AMPc podem abordar questões fundamentais do sensoriamento direcional. Para demonstrar a aplicação de microscopia em tempo real com alta resolução espacial, aqui é mostrada uma célula em verde exibindo uma expressão bifásica de PIP3 em resposta à exposição a um gradiente estável de AMPc em vermelho.Esta imagem mostra as regiões de interesse para a medição da cinética da produção de PIP três. A cinética da produção de PIP três na frente e na traseira das células após exposição a um gradiente constante é apresentada aqui, com a produção de PIP três na frente e na traseira representada em preto e cinza, respectivamente. Aplicando o imageamento de células vivas, medimos sistematicamente a dinâmica de uma rede de sinalização específica para detecção direcional, desde a estimulação do AMP cíclico até a produção de PIP três.Este esquema mostra a rede de sinalização da percepção direcional, desde a estimulação por AMP cíclico até a produção de PIP três. A cinética de cada componente é apresentada com uma linha na mesma cor. Nesta primeira figura, como uma estimulação por AMP cíclico aplicada uniformemente desencadeia uma ativação persistente da proteína G, a qual induz uma produção transitória de PIP três, é representada neste filme.Uma variedade de imagens de células G e pH mostra que uma estimulação cíclica uniforme de AMP desencadeia uma ativação persistente da proteína G na periferia celular, o que simultaneamente provoca uma produção transitória de PIP três. Aqui, são mostradas as cinéticas da ativação da proteína G e da produção de PIP três após uma estimulação cíclica de AMP uniformemente aplicada. Ao realizar esses experimentos, é importante ter em mente que o essencial é obter células reativas, considerando diferentes backgrounds genéticos das células e condições ambientais.As condições de aquisição de imagens alteram toda a fisiologia celular e podem tornar a célula menos responsiva. Após este procedimento, pode-se aplicar modelagem computacional para responder perguntas adicionais, como como as interações dinâmicas dentro de uma rede de sinalização dão origem a um comportamento celular. Estes métodos abrem caminho para pesquisadores na área de quimiotaxia eucariótica.Podemos desenvolver um modelo computacional de detecção de quimioatraentes. Esse modelo pode ser usado para simular a dinâmica de um evento de sinalização. A interação entre o aperfeiçoamento do modelo e a medição do comportamento celular pode levar a uma compreensão mais profunda das quimiotaxes.Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma compreensão melhor de como aplicar a microscopia confocal de fluorescência avançada para monitorar eventos de sinalização em células vivas. Esperamos que você consiga aplicar este método ao seu estudo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O sistema ECIS / Taxis é um sistema automatizado, o ensaio em tempo real que mede a quimiotaxia celulares. Neste ensaio, as células se movem por baixo de uma camada de agarose para se chegar a um eléctrodo de destino. Movimento celular é medida pelo aparecimento de resistência a AC 0 actual.

Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica...

C. elegans Chemotaxis Assay

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

ensaios de quimiotaxia visuais são essenciais para um melhor entendimento de como as células eucarióticas controlar a migração celular mediada por direccional quimioatractor. Aqui, descrevemos métodos detalhados para: 1) em tempo real, monitoramento de alta resolução de vários ensaios de quimiotaxia, e 2) visualizando simultaneamente o gradiente quimioatrativo ea dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização em células HL60 neutrófilos-like.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca2 + lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.

Um cinética baseada em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos

O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através da subfamília de receptores S1P (S1PRs). Aqui, um pipeline é descrito para expor sobre as estruturas e função das S1PRs.

Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Empregando um espectralmente resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia, pixel-nível mapas de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eficiências são obtidas para células que expressam receptores de membrana para formar a hipótese de homo-oligoméricos complexos. Da FRET mapas eficiência, somos capazes de estimar informações sobre o complexo estequiométrico oligômero em estudo.

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

Aprenda a monitorar dinâmica espaciotemporal de eventos de sinalização durante quimiotaxia em Dictyostelium discoideus usando microscopia confocal de fluorescência avançada. Este método permite visualizar ativação de proteínas G e produção de PIP3 em células vivas.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum /em (Vídeo) | JoVE Journal

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum

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