Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

O objetivo geral das técnicas apresentadas aqui é rotular e cultivar tecidos embrionários para medir a deformação morfogenética durante o desenvolvimento inicial para a cultura do embrião de pintinho precoce, começando removendo o embrião do ovo usando um método de suporte de papel de filtro. Dependendo da aplicação experimental, rotule o embrião extraído com corantes lipofílicos fluorescentes administrados por meio de partículas magnéticas de ferro ou com microesferas de poliestireno. Em seguida, rastreie os marcadores durante a cultura usando microscopia de fluorescência ou tomografia de coerência óptica.

Os mapas de deformação morfogenética resultantes da imagem indicam regiões de alongamento, encurtamento e cisalhamento do tecido em duas e três dimensões. Olá, meu nome é Ben Philis e sou estudante de pós-graduação no laboratório do Dr. Larry Tabor no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Washington em St.Louis. Antes de iniciar esses tipos de experimentos, é importante considerar técnicas de cultura de tecidos relevantes em seu sistema modelo, modalidades de imagem às quais você pode ter acesso e também o tipo de dados que você deseja de seus experimentos.

Por exemplo, você está interessado em analisar deformações de tecidos em duas ou três dimensões? Abordamos algumas dessas questões aqui hoje, mostrando duas técnicas de rotulagem complementares no embrião inicial do pintinho. Olá, meu nome é Victor Varner e trabalho no laboratório do Dr. Larry Tabor na Universidade de Washington em St.Louis.

Em ambas as técnicas, rotulamos rápida e simultaneamente centenas de células no embrião Chick inicial. Rastrear o movimento desses rótulos nos permite não apenas determinar os tecidos nos quais essas células eventualmente residem, mas também quantificar a deformação do nível do tecido que molda o embrião inicial. Primeiro, incube os ovos em uma orientação longitudinal até o estágio desejado, conforme definido por hamburger e Hamilton.

Quebre o fundo do ovo na lateral de uma placa de Petri de 150 milímetros. Separe a casca do fundo, esvazie o conteúdo do ovo no prato e, usando uma pinça romba, remova a albumina viscosa mais espessa da gema. Agora faça furos no meio de um papel de filtro circular.

Coloque um dos anéis de papel de filtro na gema de forma que o embrião fique visível através do orifício central do anel. Apare ao redor do perímetro externo do anel de papel de filtro com uma microtesoura. Em seguida, remova o papel com o embrião anexado da gema com uma pinça fina e mergulhe suavemente o embrião em um banho de PBS Para remover as partículas aderentes da gema, transfira o conjunto do papel de filtro para uma placa de cultura de 35 milímetros.

Colocando-o com o lado ventral para cima, envie o embrião com um segundo anel de papel de filtro. Prenda-o com um anel de metal e mergulhe o embrião em meio de cultura. Se o embrião não estiver completamente submerso, a geometria do tecido e a morfogênese subsequente podem ser bastante alteradas por cargas de tensão superficial anormalmente altas.

Durante a cultura, usando um microscópio de campo claro, verifique a morfologia adequada e o estágio embrionário. Primeiro, pegue uma pequena quantidade de pó de ferro e adicione algumas gotas de corante saturado e álcool e seque ao ar com a ponta de uma micropipeta puxada. Quebre as partículas de ferro aglomeradas e transfira-as para um tubo de microcentrífuga.

Após vários enxágues cobertos com a posição de água ionizada, o embrião colhido se localiza em uma placa de cultura de 35 milímetros coberta com uma camada generosa de meio de cultura. Sob um microscópio de dissecação, use a agulha de vidro para remover a membrana da vilina e expor as células eletrodérmicas. Agora desenhe uma coluna de partículas de ferro marcadas em uma pipeta peor.

Usando o microscópio de dissecação, mergulhe a pipeta para posicionar logo acima do embrião. Role a pipeta lentamente para frente e para trás entre as pontas dos dedos para espalhar partículas pelo embrião. Após uma incubação de 10 minutos a 37 graus Celsius, remova as partículas usando um ímã forte.

Se necessário, prenda o ímã a um par magnético de pinças finas e use a pinça magnetizada para remover cuidadosamente quaisquer partículas residuais de ferro. Prossiga para adquirir imagens de campo claro e fluorescentes do embrião. Com uma agulha de calibre 22.

Puxe uma solução de microesferas pretas de 10 micrômetros de diâmetro em PBS em uma seringa de 10 cc. Em seguida, chanfre as pontas das agulhas de vidro puxadas usando um disco rígido de computador e preencha com uma solução de contas. Agite levemente a micropipeta para que a solução alcance a ponta usando um micromanipulador.

Coloque a agulha de vidro no mesmo campo de visão que o embrião. Confirme o fluxo de grânulos para fora da ponta da pipeta. Agora insira a ponta da pipeta no lúmen do tubo cerebral.

Tomando cuidado para não perfurar o assoalho ventral do tecido. Monitore o inchaço transitório do tecido à medida que grânulos e fluido entram no lúmen. Em seguida, remova rapidamente a agulha de vidro.

Finalmente, verifique uma densidade de grânulos suficiente no lúmen interno do tubo cerebral. Usando um microscópio de campo claro, deixe as esferas assentarem por 20 a 30 minutos antes de adquirir imagens de campo claro ou um conjunto de dados de tomografia de coerência óptica. Depois de adquirir as primeiras imagens, coloque até 7 placas de cultura de 35 milímetros de amostras em uma placa de Petri de 150 milímetros e coloque todo o conjunto em um pequeno saco plástico.

Adicione gotas de água deionizada ao saco para umidificação e, em seguida, encha o saco com uma mistura de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Coloque os embriões em uma incubadora de 37 graus Celsius até o próximo ponto de tempo de imagem, coloque os embriões marcados em um prato delta T contendo 1,2 mililitros de meio de cultura e cubra o prato com uma tampa de vidro mantida a 37 graus Celsius Super funda o embrião com uma mistura de gás 95% O2 5% CO2 fornecida por um dispositivo de fluxo variável de mini bomba. Agora configure o software para adquirir automaticamente imagens que desejam intervalos de tempo.

Ao longo do experimento, os rótulos podem ser rastreados automática ou manualmente, e os mapas de cepas morfogenéticas podem ser calculados para coordenadas de marcadores. Aqui, a técnica de partículas de ferro foi usada para rotular e rastrear o movimento das células eletrodérmicas durante a formação da dobra da cabeça. No embrião de pintinho inicial, as células marcadas com fluorescência foram distribuídas por todo o embrião.

Imagens de campo claro e fluorescentes do embrião foram capturadas em diferentes intervalos durante o cultivo ex ovo. Para monitorar os movimentos dos rótulos do trato. Os dados cumulativos permitem o cálculo das distribuições de cepas morfogenéticas em evolução durante a formação da dobra da cabeça.

Da mesma forma, a técnica de microesferas de poliestireno foi usada para rastrear os movimentos dos tecidos no limite do cérebro posterior médio do cérebro inicial do pintinho. Observe que este método é capaz de lidar com deformações 3D distintas, pois as contas tendem a grudar em todos os lados do lúmen interno do cérebro. Após rastrear os movimentos do cordão por seis horas, as coordenadas dos marcadores permitem o cálculo das deformações, caracterizando a deformação do tecido nas direções longitudinal e circunferencial.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de algumas das etapas experimentais necessárias para implementar sua própria cultura de tecidos e rotulagem. As técnicas de protocolo apresentadas aqui são particularmente vantajosas, pois são minimamente invasivas para os tecidos nativos e também envolvem materiais de baixo custo e prontamente disponíveis. Esses experimentos são particularmente úteis para estudos sobre a mecânica do desenvolvimento embrionário.

Uma vez que os campos de deformação calculados usando o movimento rastreado de células marcadas podem ser usados para testar e construir modelos físicos de morfogênese.