Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

O objetivo geral das técnicas apresentadas aqui é rotular e cultivar tecidos embrionários para medir a deformação morfogenética durante o desenvolvimento inicial. Para o cultivo do embrião de galinha em estágio inicial, comece removendo o embrião do ovo utilizando o método do suporte de papel filtro. Dependendo da aplicação experimental, marque o embrião extraído com corantes lipofílicos fluorescentes administrados por meio de partículas magnéticas de ferro ou com microesferas de poliestireno. Em seguida, acompanhe os marcadores durante o cultivo utilizando microscopia de fluorescência ou imagem de tomografia de coerência óptica.

Os mapas de deformação morfogenética resultantes da imagem indicam regiões de alongamento, encurtamento e cisalhamento tecidual em duas e três dimensões. Olá, meu nome é Ben Philis e sou aluno de pós-graduação no laboratório do Dr. Larry Tabor, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Washington em St. Louis. Antes de iniciar esse tipo de experimento, é importante considerar as técnicas relevantes de cultura de tecidos no seu sistema modelo, as modalidades de imagem às quais você pode ter acesso e também o tipo de dado que deseja obter com seus experimentos.

Por exemplo, você está interessado em analisar deformações teciduais em duas ou três dimensões? Abordamos algumas dessas questões aqui hoje, mostrando duas técnicas complementares de marcação no embrião inicial de galinha. Olá, meu nome é Victor Varner, e trabalho no laboratório do Dr. Larry Tabor na Universidade de Washington em St. Louis.

Em ambas essas técnicas, marcamos rapidamente e simultaneamente centenas de células no embrião inicial de galinha. O rastreamento do movimento dessas marcas permite-nos não apenas determinar os tecidos nos quais essas células acabam por se estabelecer, mas também quantificar as deformações em nível tecidual que moldam o embrião inicial. Primeiro, incubar os ovos em orientação longitudinal até o estágio desejado, conforme definido por Hamburger e Hamilton.

Quebre a base do ovo na borda de uma placa de Petri de 150 milímetros. Separe a casca pela base, despeje o conteúdo do ovo na placa e, com pinça romba, remova o albúmen mais espesso e viscoso da gema. Agora, faça furos através do centro de um papel-filtro circular.

Coloque um dos anéis de papel-filtro sobre a gema de modo que o embrião fique visível através do orifício central do anel. Recorte ao redor do perímetro externo do anel de papel-filtro com tesoura microcirúrgica. Em seguida, remova o papel com o embrião aderido da gema usando pinça fina e mergulhe suavemente o embrião em um banho de PBS. Para remover partículas aderentes de gema, transfira o conjunto de papel-filtro para uma placa de cultura de 35 milímetros.

Colocando-o com o lado ventral voltado para cima, transfira o embrião com um segundo anel de papel filtro. Fixe-o com um anel metálico e imerja o embrião no meio de cultura. Se o embrião não estiver completamente submerso, a geometria do tecido e a morfogênese subsequente podem ser grandemente alteradas por cargas anormalmente altas de tensão superficial.

Durante o cultivo, utilizando um microscópio de campo claro, verifique a morfologia adequada e o estágio embrionário. Primeiro, pegue uma pequena quantidade de pó de ferro e adicione algumas gotas de corante saturado e álcool, secando ao ar com a ponta de uma micropipeta puxada. Desagregue as partículas de ferro aglomeradas e transfira-as para um tubo de microcentrífuga.

Após várias lavagens com água ionizada, posicione o embrião colhido com a face dorsal voltada para cima em uma placa de cultura de 35 milímetros coberta com uma camada generosa de meio de cultura. Sob um microscópio estereoscópico, utilize a agulha de vidro para remover a membrana vilinosa e expor as células ectodérmicas. Agora, aspire uma coluna de partículas de ferro marcadas para dentro de uma pipeta de vidro.

Usando o microscópio estereoscópico, submerja a pipeta para posicioná-la logo acima do embrião. Gire a pipeta lentamente para frente e para trás entre as pontas dos dedos para espalhar partículas sobre o embrião. Após uma incubação de 10 minutos a 37 graus Celsius, remova as partículas utilizando um ímã forte.

Se necessário, prenda o ímã a um par de pinças magnéticas finas e use as pinças magnetizadas para remover cuidadosamente quaisquer partículas residuais de ferro. Prossiga para obter imagens de campo claro e fluorescentes do embrião. Com uma agulha de calibre 22.

Puxe uma solução de microesferas pretas com diâmetro de 10 micrômetros em PBS para dentro de uma seringa de 10 cc. Em seguida, biselar as pontas das agulhas de vidro puxadas utilizando um disco rígido de computador e preencha com a solução de microesferas. Bata levemente na micropipeta para que a solução alcance a ponta, utilizando um micromanipulador.

Coloque a agulha de vidro no mesmo campo de visão que o embrião. Confirme o fluxo de microesferas para fora da ponta da pipeta. Agora insira a ponta da pipeta na luz do tubo neural.

Tendo cuidado para não perfurar o assoalho ventral do tecido. Observe o inchaço transitório do tecido à medida que as microesferas e o fluido entram na luz. Em seguida, remova rapidamente a agulha de vidro.

Por fim, verifique uma densidade suficiente de microesferas no lúmen interno do tubo neural. Utilizando um microscópio de campo claro, deixe as microesferas sedimentarem por 20 a 30 minutos antes de adquirir imagens de campo claro ou um conjunto de dados de tomografia por coerência óptica. Após adquirir as primeiras imagens, coloque até 7 placas de cultura de 35 milímetros com as amostras em uma placa de Petri de 150 milímetros e posicione todo o conjunto em um saco plástico pequeno.

Adicione gotas de água desionizada ao saco para umidificação e, em seguida, preencha o saco com uma mistura de 95%oxigênio e 5%dioxidodecarbono. Coloque os embriões em uma incubadora a 37 graus Celsius até o próximo ponto de aquisição de imagens; posicione os embriões identificados em um recipiente delta T contendo 1,2 mililitros de meio de cultura e cubra o recipiente com uma tampa de vidro mantida a 37 graus Celsius. Suprifuse o embrião com uma mistura gasosa de 95%O₂ 5%CO₂ fornecida por um dispositivo de fluxo variável com bomba miniatura. Agora, configure o software para adquirir automaticamente imagens nos intervalos de tempo desejados.

Ao longo do experimento, as marcas podem ser rastreadas automaticamente ou manualmente, e mapas de deformação morfogenética podem ser calculados com base nas coordenadas dos marcadores. Aqui, a técnica com partículas de ferro foi utilizada para marcar e rastrear o movimento de células eletrodermais durante a formação do dobramento cefálico. No embrião de galinha jovem, células marcadas com fluorescência estavam distribuídas por todo o embrião.

Imagens em campo claro e fluorescentes do embrião foram capturadas em diferentes intervalos durante o cultivo ex ovo. Para monitorar os movimentos das marcas do trato. Dados cumulativos permitem o cálculo das distribuições de deformação morfogenética em evolução durante a formação do dobramento cefálico.

Da mesma forma, a técnica com microesferas de poliestireno foi utilizada para rastrear movimentos teciduais na região do limite entre o metencéfalo e o mielencéfalo no cérebro inicial de embrião de galinha. Observe que este método é capaz de lidar com deformações nitidamente tridimensionais, pois as microesferas tendem a aderir a todos os lados do lúmen interno do cérebro. Após o rastreamento do movimento das microesferas por seis horas, as coordenadas dos marcadores permitem o cálculo das deformações, caracterizando a deformação tecidual nas direções longitudinal e circunferencial.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de alguns dos passos experimentais necessários para implementar seu próprio cultivo de tecidos e marcação. As técnicas de protocolo apresentadas aqui são particularmente vantajosas porque são minimamente invasivas aos tecidos nativos e também envolvem baixo custo e materiais facilmente disponíveis. Esses experimentos são particularmente úteis para estudos sobre a mecânica do desenvolvimento embrionário.

Desde que os campos de deformação calculados usando o movimento rastreado de células marcadas possam ser utilizados tanto para testar quanto para construir modelos físicos da morfogênese.