Name: Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a rastrear deformações morfogenéticas em embriões de galinha usando marcadores fluorescentes e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar dinâmicas teciduais em tempo real em duas e três dimensões.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01 e R01 GM075200 HL083393 (LAT). Reconhecemos o apoio de bolsas para BAF do NIH T90 DA022871 e do Instituto de Radiologia Mallinckrodt, e para VDV da concessão 09PRE2060795 da Associação Americana do Coração.

1. Preparação Geral Experimental <ol><li> Prepare o meio de cultura de tecidos na capela de fluxo laminar. <ol><li> Dilua Medium Modified Dulbecco Águia (DMEM) (1 garrafa de 4,5 g L com / L de glicose, bicarbonato de sódio, e L-glutamina). Adicionar 10 mL de penicilina / estreptomicina / neomicina antibióticos. </li><li> Remova 100 mL de DMEM com uma pipeta de transferência estéril e substituir por 100 ml de soro pinto. </li><li> Alíquota a garota DMEM/10% de soro / antibióticos de 1% em 15 mL estéreis frascos cônicos e congelar. </li></ol></li><li> Prepare tampão fosfato salino (PBS), suplementado com cálcio e magnésio. Misturar 100 mL PBS 10X, 900 mL de água deionizada, e 1 mL de uma solução de cálcio e magnésio concentrado (100 mg / mL CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml MgCl 2 • 6H 2 O). </li><li> Incubar os ovos em uma orientação longitudinal para o estágio desejado, conforme definido pelo Hamburger e Hamilton 1 (ie 23-25 ​​horas para HH estágio 5, ou 42-48 Horas para estágios HH 11-12). </li><li> Remover embriões do ovo usando o método transportadora filtro de papel. <ol><li> Rachar o fundo do ovo ao lado da placa de Petri A150 mm. Separar a casca do fundo e esvaziar o conteúdo do ovo no prato. </li><li> Remova a mais espessa, viscosa do albúmen do ovo com a pinça romba. </li><li> Cortar círculos de Whatman # 2 papel de filtro 2-3 cm. de diâmetro. Usando um único furo furos, soco no meio do papel de filtro. Coloque um dos anéis de papel de filtro sobre a gema de uma forma que mantém o embrião visível através do furo central no ringue. </li><li> Corte em torno do diâmetro externo do papel de filtro com microtesoura. Remova o papel da gema com uma pinça fina. </li><li> Lave o embrião em PBS para remover partículas gema aderente. (HH5 embriões pode precisar de molho enquanto 15-20 minutos para remover gema residual). Remova o conjunto do papel de filtro do banho e colocá-lo lado ventral em um35 placa de cultura mm. Coloque um anel de papel filtro no topo segundo o primeiro, imprensando o embrião entre os anéis. Colocar um anel de metal do lado de fora do sanduíche de papel de filtro (≈ 1,5-2 cm de diâmetro) para proteger o embrião. </li><li> Submergir o embrião em meio de cultura. Verificar a morfologia adequada e estágio embrionário com um microscópio de campo claro. </li></ol></li><li> Use um extrator da pipeta para preparar agulhas de ponta fina de vidro (1,5 mm de diâmetro interno) (Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota FL) para dissecção do tecido subseqüentes e rotulagem. </li></ol> 2. DII Rotulagem de HH Stage 5 embriões utilizando partículas de ferro magnético <ol><li> Adicione algumas gotas de DII saturada em álcool a uma pequena quantidade de pó de ferro (ferro reduzido, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) em temperatura ambiente e deixe secar. (Isso geralmente faz com que as partículas de bolo juntos uma vez que o álcool tenha evaporado.) Use a ponta de uma micropipeta puxado para quebrar as partículas de ferro agregada,transferi-los para um tubo de microcentrífuga, e lave-os várias vezes e cubra com água deionizada. </li><li> Para identificar as células ectodérmicas em um estágio HH 5 embrião, coloque o embrião colhida (ou seja, o conjunto inteiro de papel filtro) lado dorsal em uma placa de cultura 35 milímetros coberto com uma camada generosa de meios de cultura e colocar o prato sob um microscópio de dissecação. Use uma agulha de vidro para remover a membrana vitelina e expor as células ectodérmicas. (Tome cuidado para não furar embrião.) </li><li> Desenhar uma coluna de partículas de ferro rotulada (em água deionizada) em uma pipeta Pasteur. Usando o microscópio de dissecação submergir, a ponta da pipeta sob a superfície de líquidos ea posição um pouco acima do embrião. Rolando a pipeta lentamente para trás e para frente entre as pontas dos dedos, empurram as partículas para fora do pipiette e polvilhe-os através do embrião. </li><li> Uma vez que o embrião é coberta com partículas, cuidadosamente colocá-lo em uma incubadora de 37 ° C por aproximadamente 10 minutos. Tome embrião fora da incubadora umd usar um forte ímã para remover as partículas. </li><li> Use um microscópio de fluorescência com câmera de vídeo conectada e apropriado configurações de filtro para adquirir tanto de campo claro e imagens fluorescentes do embrião, como mostrado na Figura 2A, B. </li><li> Observe a densidade de etiqueta. Se uma distribuição mais densa é desejado, use partículas adicionais (como descrito acima) para rotular o embrião novamente e estender o tempo de incubação em conformidade. Se os rótulos são muito denso, adicione uma pequena quantidade de partículas de ferro não marcado para o tubo de microcentrífuga cheio de partículas já etiquetados e misturar o conteúdo do tubo. Repita o processo de etiquetagem com um novo embrião e, novamente, nota densidade rótulo. </li></ol> 3. Rotulagem de poliestireno Microesfera de Tomografia de Coerência Óptica (OCT) Imaging da HH11-12 embriões <ol><li> Prepare uma solução de preto 10 mM diâmetro microesferas (Polysciences Inc., Warrington, PA) em PBS numa placa de Petri 35 mm. (Beads deve ser grande o suficiente para gerar contraste para outubroimagem, mas pequena o suficiente de modo que o tamanho do grânulo é da ordem de células individuais. Valores específicos variam de acordo com a resolução do seu sistema de outubro e os tecidos em estudo). Uma gota da solução-mãe (2,6% de sólidos de látex) por mL de PBS é geralmente suficiente. Puxe esta solução para uma seringa 10cc usando uma agulha de calibre 22. Vortex da solução por 30 segundos para assegurar uma distribuição uniforme do grânulo. </li><li> Bevel as pontas de suas agulhas de vidro puxado através de um disco rígido do computador 2. Diâmetro da ponta deve ser grande o suficiente para que contas podem caber através da abertura, mas, ao mesmo tempo, tão pequeno quanto possível para minimizar ferindo o tecido durante a injeção. </li><li> Preencher uma agulha de vidro chanfrado com a solução de talão utilizando a seringa. Levemente o filme micropipeta para garantir que a solução atingiu a ponta. </li><li> Usando um micromanipulador, coloque a agulha de vidro no mesmo campo de visão como o embrião. Contas devem estar fluindo para fora da ponta da pipeta. <ol><li> Se não beads sair da micropipeta, pode haver uma obstrução. Neste caso, repita os passos de 3,2-3,4 com uma agulha de vidro novo. </li><li> Se contas muitas nuvens o seu campo de visão, a sua ponteira pode ser muito grande. Repita os passos 3,2-3,4 com uma pipeta nova e um novo embrião. </li></ol></li><li> Inserir a ponta da pipeta para o lúmen do tubo cérebro. Cuidado para não furar o chão ventral do tecido. Você verá um inchaço transitório do tecido como contas de e fluido entrar no lúmen. Isso indica uma intubação bem sucedida, agora, remover rapidamente a agulha de vidro. </li><li> Verificar uma densidade suficiente talão na luz interna do tubo cérebro usando um microscópio de campo claro. Deixe as contas para resolver 20 - 30 minutos antes de proceder à Sect. 4. </li></ol> 4. Aquisição de Dados * Os seguintes métodos são adequados para a técnica de fluorescência de rotulagem descritos acima. No entanto, com a técnica de rotulagem microesfera, contas pode desalojar na transferência de amostrasentre incubadoras de empresas e sistemas de imagem. Neste caso o melhor é avançar para o passo 4.2 (o que evita a amostra movimento / agitação completamente). Em ambos os métodos, os embriões são cultivados ao mesmo tempo submerso em meio de cultura líquido. Se o embrião não é completamente submerso (como é o caso de algumas técnicas de cultura de tecido convencional), a geometria do tecido é grandemente alterada pela anormalmente cargas de superfície de alta tensão e distribuições tensão vai deixar de capturar com precisão morfogênese 3-D normal 3, 4. Além disso, submergindo o tecido impede o contraste brilhante observada na interface líquido-gás durante outubro de imagens de obscurecer a morfologia embrionária e as coordenadas do marcador. <ol><li> Cultura de embriões (geral) <ol><li> Depois de adquirir o seu primeiras imagens (de campo claro, fluorescência, ou outubro), colocar até sete pratos 35 milímetros de cultura (com embriões) em uma placa de Petri 150 mm e coloque o conjunto inteiro em um saco plástico pequeno. Adicione algumas gotas de água deionizada para a bolsa de umidificaçãoe encher o saco com um 95% O 2 / 5% CO 2 da mistura. Coloque os embriões na incubadora a 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, Carolina do Norte) para o tempo desejado até a próxima imagem timepoint. Usando este método, experimentos podem ser realizados em embriões múltiplos no mesmo dia. </li></ol></li><li> Time-lapse cultura (automatizado) <ol><li> Coloque seu embriões rotulados em um prato T Delta (35 mm de diâmetro externo, 23 mm de abertura central, com parede lateral cônico, 0,17 milímetro de espessura de vidro; Bioptechs, Butler, PA), contendo 1,2 mL de meio de cultura. </li><li> Cubra o prato com uma tampa de vidro mantida a 37 ° C usando um controlador Bioptechs Delta Dish T4 Cultura (para evitar a condensação). Superfuse o embrião com um 95% O 2 / 5% CO 2 fornecido mistura de gás de um dispositivo de fluxo Mini-Bomba Variável (Fisher Scientific). Antes de atingir o embrião, o calor e umidificar o gás por borbulhamento através de água deionizada em um quente (&lt;100 ° C) chapa quente. Um esquema deste s experimentalet-up é mostrado na Figura 1. </li><li> Configurar o software para adquirir automaticamente imagens em intervalos de tempo especificados pelo usuário. Para o nosso microscópio de fluorescência, usamos Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), e para o nosso sistema de outubro, usamos varreu fonte Thorlabs software (Newton, NJ). Como esse método é atualmente apenas capaz de lidar com uma experiência de lapso de tempo em um tempo, muitas vezes é melhor para permitir que estes tipos de culturas para executar durante a noite. Pode-se contornar essa limitação através da instalação de um palco automatizado traduzíveis compatível com o hardware eo software do sistema de imagens 5. </li></ol></li></ol> 5. Resultados representativos: Etiquetas são rastreadas automaticamente (usando Volocity, PerkinElmer) ou manualmente (usando o plugin manual Rastreamento em ImageJ, NIH) em cada experimento. Na técnica de fluorescência, usamos o gridfit rotina Matlab para caber superfícies 2D através das coordenadas do marcador, o que permite cepas superfície morfogenética a ser calculada 6, 7. Equações padronizadas são usadas para transformar esses valores em um sistema de coordenadas relevantes embrionárias. Alternativamente, na técnica de outubro, as superfícies são geradas a partir de volumes imagem segmentada (obtido via software padrão, como Matlab ou Caret 8) e as tensões podem ser calculadas na direção de curvatura máximo ou mínimo da amostra 9. Usamos a nossa técnica de partículas de ferro para rotular e controlar o movimento de células ectodérmicas durante a formação da cabeça vezes no embrião de galinha cedo. Como mostrado na Figura 2A, células fluorescente etiquetado foram distribuídos em todo o embrião inteiro. Campo claro e imagens fluorescentes do embrião foram capturados em diferentes intervalos durante a cultura ovo ex. Os movimentos dos rótulos rastreados (Fig. 2B, C) foram então usados ​​para calcular as distribuições morfogenética evoluindo tensão durante a formação da cabeça dobra (Fig. 2D-F). t "&gt; Da mesma forma, a nossa técnica de microesferas de poliestireno foi utilizada para rastrear os movimentos dos tecidos na fronteira meados de rombencéfalo do cérebro pinto cedo. Conforme mostrado na Figura 3 BD, movimentos talão foram monitorados por 6 horas e tensões que caracterizam a deformação dos tecidos na longitudinal e direções circunferenciais foram calculados a partir das coordenadas do marcador. Note que este método é capaz de lidar nitidamente 3-D deformações como contas tendem a se ater a todos os lados do lúmen interno do cérebro (Fig. 3A). <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemático de set-up para o lapso de tempo de cultura de tecidos. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Quantificar 2-D deformações do tecido no embrião de galinha cedo rastreados usando marcadores fluorescentes. (A) imagem brilhante Merged campo / fluorescente de HH embrião estágio 5 após a remoção de partículas de ferro. DII-labeled células ectodérmicas (vermelho) são distribuídos em todo o embrião inteiro. (B, C) O movimento de células marcadas foi monitorado usando ImageJ. Deslocamentos rótulo foram calculados em coordenadas embrião (X, Y). Note-se que A e B são a mesma imagem. (DF) parcelas Contour de evoluir distribuições deformação longitudinal durante a formação da cabeça desistir. Cepas longitudinal de Lagrange foram calculados em relação ao HH estágio 5 (ie, A e B) depois (D) 75 min, (E) 120 min, e (F) 165 min de incubação. Essas cepas caracterizar a variação do comprimento dos elementos da linha originalmente orientada ao longo do eixo Y (no embrião estágio 5). Mais detalhes sobre o uso do rótulo rastreado coordenadas para calcular cepas morfogenéticos podem ser encontrados em Filas et al (2007). 6 e Varner et al. (2010) 7. Note-se que C e F são a mesma imagem. Barra de escala = 500 mm. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Quantificação de tecido 3-D deformations no cérebro pinto cedo. (A) de poliestireno microesferas que aderem à (seta preta) dorsal e ventral (seta branca) os lados do tubo do cérebro são facilmente discerníveis a partir de tecidos circundantes em vista transversal cruz section.Ventral de reconstruções outubro mostram locais micro perto do limite rombencéfalo mid- em (B) H12 e depois (C) 6 h de incubação (M: mesencéfalo, H: rombencéfalo). Vários grupos de contas são apresentadas para realçar a deformação total do tecido. (D) Longitudinal (E zz) e circunferencial (E θθ) cepas de Lagrange foram calculados a partir dessas deformações. Positivos e negativos longitudinal cepas circunferencial na fronteira meados de rombencéfalo refletem um crescimento axial e encurtamento circunferencial da região durante a cultura. Mais detalhes sobre o cálculo de tensões morfogenéticos para superfícies complexas durante a morfogênese pode ser encontrado em Filas et al. (2008) 9. Barra de escala = 200 mM.

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+the+effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li>
<li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+fiber+formation%3A+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li>
<li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li>
<li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+head+fold+formation%3A+investigating+tissue-level+forces+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li>
<li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Inform.+Assoc%22%5BJournal%5D)">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li>
<li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li>
<li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li>
<li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+tectonics%3A+morphogenetic+strain+rates%2C+cell+shape+change+and+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Duas técnicas de rotulagem de tecido são apresentados para a cultura ex ovo de embriões de galinha cedo. O primeiro usa corantes fluorescentes lipofílico entregues via partículas de ferro magnético para simultaneamente rótulo centenas de células. No entanto, este método não é compatível com tomografia de coerência óptica, como corantes fluorescentes mostram geralmente pouco contraste dos tecidos adjacentes utilizando 10 de outubro. Por isso, vamos mostrar uma técnica alternativa utilizando o poliesti...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM - glicose alta </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina / Neomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td> Chicken Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline Dulbecco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1408 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Whatman # 2 Papel Filtro </td><td> Whatman </td><td> 1002 090 </td><td> 90 milímetros de diâmetro </td></tr><tr><td> Micropipetas de vidro </td><td> Precision mundoInstrumentos (WPI) </td><td> TW150-6 </td><td> Diâmetro interno 1,5 milímetros </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-282 </td><td></td></tr><tr><td> Redução de ferro </td><td> Mallinckrodt Baker Inc. </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10 M Diâmetro Microesferas (preto) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td> Delta T Dish (para a cultura do lapso de tempo) </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td> 0,17 milímetros de espessura, preto </td></tr><tr><td> Delta Controlador Dish T4 Cultura </td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Bomba Dispositivo de Fluxo Variável </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rastreamento deformações tissue morfogenéticas no embrião de galinha precoce

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo 

Embrionárias epitélios sofrem deformações complexos (por exemplo, dobrar, torcer, dobrar, e alongamento) para formar os órgãos primitivo do embrião em estágio inicial. Rastreamento de marcadores fiduciais na superfície dessas folhas celular é um método bem estabelecido para estimar quantidades morfogenéticos, tais como crescimento, cisalhamento contração, e. No entanto, nem todas as técnicas de rotulagem de superfície são facilmente adaptáveis ​​às modalidades de imagem convencional e possui diferentes vantagens e limitações. Aqui, descrevemos dois métodos de rotulagem e ilustrar a utilidade de cada técnica. No primeiro método, centenas de etiquetas fluorescentes são aplicadas simultaneamente para o embrião usando partículas de ferro magnético. Esses rótulos são então usadas para quantidade deformações 2-D durante a morfogênese do tecido. No segundo método, poliestireno microesferas são usadas como agentes de contraste em não-invasivo tomografia de coerência óptica de imagem (OCT) para acompanhar as deformações do tecido 3-D. Estas técnicas têm sido bem sucedidasly implementados em nosso laboratório para estudo The mecanismos físicos de dobra a cabeça no início, o coração, eo desenvolvimento do cérebro, e deve ser adaptável a uma ampla gama de processos morfogenéticos.

Este artigo descreve a rotulagem de superfície e<em&gt; Ex ovo</em&gt; Cultura de tecidos no embrião de galinha cedo. Técnicas passíveis de lapso de tempo de campo claro, fluorescência e tomografia de coerência óptica de imagem são apresentados. Etiquetas de rastreamento de superfície com resolução espaço-temporal permite alta quantidades cinemáticas, como cepas morfogenética (deformações), a ser calculado de duas e três dimensões.

Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

Os epitélios embrionários passam por deformações complexas (ex.: curvatura, torção, dobramento e alongamento) para formar os órgãos primitivos do embrião inicial. ...

O objetivo geral das técnicas apresentadas aqui é rotular e cultivar tecidos embrionários para medir a deformação morfogenética durante o desenvolvimento inicial. Para o cultivo do embrião de galinha em estágio inicial, comece removendo o embrião do ovo utilizando o método do suporte de papel filtro. Dependendo da aplicação experimental, marque o embrião extraído com corantes lipofílicos fluorescentes administrados por meio de partículas magnéticas de ferro ou com microesferas de poliestireno. Em seguida, acompanhe os marcadores durante o cultivo utilizando microscopia de fluorescência ou imagem de tomografia de coerência óptica.Os mapas de deformação morfogenética resultantes da imagem indicam regiões de alongamento, encurtamento e cisalhamento tecidual em duas e três dimensões. Olá, meu nome é Ben Philis e sou aluno de pós-graduação no laboratório do Dr. Larry Tabor, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Washington em St. Louis. Antes de iniciar esse tipo de experimento, é importante considerar as técnicas relevantes de cultura de tecidos no seu sistema modelo, as modalidades de imagem às quais você pode ter acesso e também o tipo de dado que deseja obter com seus experimentos.Por exemplo, você está interessado em analisar deformações teciduais em duas ou três dimensões? Abordamos algumas dessas questões aqui hoje, mostrando duas técnicas complementares de marcação no embrião inicial de galinha. Olá, meu nome é Victor Varner, e trabalho no laboratório do Dr. Larry Tabor na Universidade de Washington em St. Louis.Em ambas essas técnicas, marcamos rapidamente e simultaneamente centenas de células no embrião inicial de galinha. O rastreamento do movimento dessas marcas permite-nos não apenas determinar os tecidos nos quais essas células acabam por se estabelecer, mas também quantificar as deformações em nível tecidual que moldam o embrião inicial. Primeiro, incubar os ovos em orientação longitudinal até o estágio desejado, conforme definido por Hamburger e Hamilton.Quebre a base do ovo na borda de uma placa de Petri de 150 milímetros. Separe a casca pela base, despeje o conteúdo do ovo na placa e, com pinça romba, remova o albúmen mais espesso e viscoso da gema. Agora, faça furos através do centro de um papel-filtro circular.Coloque um dos anéis de papel-filtro sobre a gema de modo que o embrião fique visível através do orifício central do anel. Recorte ao redor do perímetro externo do anel de papel-filtro com tesoura microcirúrgica. Em seguida, remova o papel com o embrião aderido da gema usando pinça fina e mergulhe suavemente o embrião em um banho de PBS. Para remover partículas aderentes de gema, transfira o conjunto de papel-filtro para uma placa de cultura de 35 milímetros.Colocando-o com o lado ventral voltado para cima, transfira o embrião com um segundo anel de papel filtro. Fixe-o com um anel metálico e imerja o embrião no meio de cultura. Se o embrião não estiver completamente submerso, a geometria do tecido e a morfogênese subsequente podem ser grandemente alteradas por cargas anormalmente altas de tensão superficial.Durante o cultivo, utilizando um microscópio de campo claro, verifique a morfologia adequada e o estágio embrionário. Primeiro, pegue uma pequena quantidade de pó de ferro e adicione algumas gotas de corante saturado e álcool, secando ao ar com a ponta de uma micropipeta puxada. Desagregue as partículas de ferro aglomeradas e transfira-as para um tubo de microcentrífuga.Após várias lavagens com água ionizada, posicione o embrião colhido com a face dorsal voltada para cima em uma placa de cultura de 35 milímetros coberta com uma camada generosa de meio de cultura. Sob um microscópio estereoscópico, utilize a agulha de vidro para remover a membrana vilinosa e expor as células ectodérmicas. Agora, aspire uma coluna de partículas de ferro marcadas para dentro de uma pipeta de vidro.Usando o microscópio estereoscópico, submerja a pipeta para posicioná-la logo acima do embrião. Gire a pipeta lentamente para frente e para trás entre as pontas dos dedos para espalhar partículas sobre o embrião. Após uma incubação de 10 minutos a 37 graus Celsius, remova as partículas utilizando um ímã forte.Se necessário, prenda o ímã a um par de pinças magnéticas finas e use as pinças magnetizadas para remover cuidadosamente quaisquer partículas residuais de ferro. Prossiga para obter imagens de campo claro e fluorescentes do embrião. Com uma agulha de calibre 22.Puxe uma solução de microesferas pretas com diâmetro de 10 micrômetros em PBS para dentro de uma seringa de 10 cc. Em seguida, biselar as pontas das agulhas de vidro puxadas utilizando um disco rígido de computador e preencha com a solução de microesferas. Bata levemente na micropipeta para que a solução alcance a ponta, utilizando um micromanipulador.Coloque a agulha de vidro no mesmo campo de visão que o embrião. Confirme o fluxo de microesferas para fora da ponta da pipeta. Agora insira a ponta da pipeta na luz do tubo neural.Tendo cuidado para não perfurar o assoalho ventral do tecido. Observe o inchaço transitório do tecido à medida que as microesferas e o fluido entram na luz. Em seguida, remova rapidamente a agulha de vidro.Por fim, verifique uma densidade suficiente de microesferas no lúmen interno do tubo neural. Utilizando um microscópio de campo claro, deixe as microesferas sedimentarem por 20 a 30 minutos antes de adquirir imagens de campo claro ou um conjunto de dados de tomografia por coerência óptica. Após adquirir as primeiras imagens, coloque até 7 placas de cultura de 35 milímetros com as amostras em uma placa de Petri de 150 milímetros e posicione todo o conjunto em um saco plástico pequeno.Adicione gotas de água desionizada ao saco para umidificação e, em seguida, preencha o saco com uma mistura de 95%oxigênio e 5%dioxidodecarbono. Coloque os embriões em uma incubadora a 37 graus Celsius até o próximo ponto de aquisição de imagens; posicione os embriões identificados em um recipiente delta T contendo 1,2 mililitros de meio de cultura e cubra o recipiente com uma tampa de vidro mantida a 37 graus Celsius. Suprifuse o embrião com uma mistura gasosa de 95%O₂ 5%CO₂ fornecida por um dispositivo de fluxo variável com bomba miniatura. Agora, configure o software para adquirir automaticamente imagens nos intervalos de tempo desejados.Ao longo do experimento, as marcas podem ser rastreadas automaticamente ou manualmente, e mapas de deformação morfogenética podem ser calculados com base nas coordenadas dos marcadores. Aqui, a técnica com partículas de ferro foi utilizada para marcar e rastrear o movimento de células eletrodermais durante a formação do dobramento cefálico. No embrião de galinha jovem, células marcadas com fluorescência estavam distribuídas por todo o embrião.Imagens em campo claro e fluorescentes do embrião foram capturadas em diferentes intervalos durante o cultivo ex ovo. Para monitorar os movimentos das marcas do trato. Dados cumulativos permitem o cálculo das distribuições de deformação morfogenética em evolução durante a formação do dobramento cefálico.Da mesma forma, a técnica com microesferas de poliestireno foi utilizada para rastrear movimentos teciduais na região do limite entre o metencéfalo e o mielencéfalo no cérebro inicial de embrião de galinha. Observe que este método é capaz de lidar com deformações nitidamente tridimensionais, pois as microesferas tendem a aderir a todos os lados do lúmen interno do cérebro. Após o rastreamento do movimento das microesferas por seis horas, as coordenadas dos marcadores permitem o cálculo das deformações, caracterizando a deformação tecidual nas direções longitudinal e circunferencial.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de alguns dos passos experimentais necessários para implementar seu próprio cultivo de tecidos e marcação. As técnicas de protocolo apresentadas aqui são particularmente vantajosas porque são minimamente invasivas aos tecidos nativos e também envolvem baixo custo e materiais facilmente disponíveis. Esses experimentos são particularmente úteis para estudos sobre a mecânica do desenvolvimento embrionário.Desde que os campos de deformação calculados usando o movimento rastreado de células marcadas possam ser utilizados tanto para testar quanto para construir modelos físicos da morfogênese.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve uma técnica de transplante de tecido que foi projetado para testar a sinalização e padronização das propriedades ectoderma de superfície cefálica durante o desenvolvimento craniofacial.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

Visualizar e acessar o embrião de galinha durante o desenvolvimento pode ser um desafio. Desenvolvemos um método ex ovo que é simples, econômico e pode ser facilmente usado em sala de aula ou ambiente de pesquisa. Este método fornece acesso ao embrião em estágios finais do desenvolvimento embrionário (HH 40).

Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Ao enxertar grânulos embebidos em fatores de crescimento ou inibidores específicos de vias de sinalização em embriões em desenvolvimento, é possível testar diretamente seus efeitos in vivo. Neste protocolo, grânulos são enxertados no broto do membro para determinar os efeitos dessas moléculas na expressão gênica e na transdução de sinal.

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Protocolos que usam barreiras impermeáveis para bloquear eventos de indução entre os tecidos do eixo e flanco do corpo principal no embrião de galinha necessários para a formação do membro são descritos. Grânulos embebidos em sinais indutivos candidatos são usados para superar o efeito da colocação da barreira e a análise da expressão gênica confirma isso.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Aqui, apresentamos um protocolo introduzindo um conjunto de novas experiências de ex-ovo e abordagens de modelagem física para estudar a mecânica da morfogênese durante a torção de cérebro embrionário precoce garota.

Os papéis de forças físicas no início Chick embrionárias morfogênese de sondagem

Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Este artigo descreve uma técnica de transplante tecidual que foi projetada para testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal durante o desenvolvimento craniofacial.

Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial

Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.

Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular

O ensaio de contas encharcada envolve a entrega direcionada de reagente de teste em qualquer ponto de desenvolvimento para estudar a regulação da diferenciação celular e morfogênese. Um protocolo detalhado, aplicável a qualquer modelo animal experimental, para preparar três tipos diferentes de contas encharcadas e implantá-las no interdigit de um embrião de frango é apresentado.

Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas

Aqui, descrevemos protocolos para três tipos de culturas de explantes de pele embrionária aviária que podem ser usados para examinar interações teciduais, filme de lapso de tempo de imagem 4D (3D mais tempo), perturbação global ou local da função molecular e caracterização de biologia de sistemas.

Usando explantes de pele aviária para estudar padrões de tecidos e organogênese

Este protocolo foi desenvolvido para monitorar longitudinalmente as propriedades mecânicas do tecido da placa neural durante a neurulação embrionária de pintinhos. Baseia-se na integração de um microscópio Brillouin e um sistema de incubação no estágio, permitindo imagens mecânicas ao vivo do tecido da placa neural em embriões de pintinhos cultivados ex ovo .

Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Aprenda a rastrear deformações morfogenéticas em embriões de galinha usando marcadores fluorescentes e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar dinâmicas teciduais em tempo real em duas e três dimensões.

Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

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