Name: Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprenda a identificar sorovares de Salmonella enterica usando PCR multiplex para detecção rápida de patógenos. Este método melhora a segurança alimentar e auxilia estudos epidemiológicos em microbiologia molecular.

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Este trabalho foi suportado pelo USDA Grants 1999-35212-8680, 2005-01378, e 2010-04288-01, Fundos USDA Formula eo Estado de Veterinária da Geórgia Grant Pesquisa Agrícola Medicina. O protocolo descrito no presente publicação foi elaborada para uso por alunos de graduação como parte de cursos de pesquisa dirigida: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L e 4960H Biol da Universidade da Geórgia e utilizados pelos alunos em vários projetos de pesquisa em epidemiologia molecular na Maurer laboratório. Queremos agradecer os muitos estudantes de graduação que realizaram pesquisas em laboratórios Maurer e Lee, e nosso chefe de departamento, John Glisson para apoiar os nossos esforços para integrar ensino de graduação com a pesquisa.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Comercialmente disponíveis os testes de PCR para a detecção de genes alvos Salmonella exclusivo para o gênero (ex. inva). No entanto, nem todos são iguais Salmonella em sua capacidade de causar doenças em seres humanos ou prevalência em populações animais. O reconhecimento precoce das diferenças antigênicas em Salmonella LPS O antígeno e flagellinH1 e antígenos H2 levou à diferenciação de Salmonella em mais de 2.500 sorotipos com base nessas diferenças antigênicas. Há 46 diferentes antígenos O e 86 distintas flagelina (H) antígenos identificados no gênero Salmonella. Salmonella pode possuir um (H1) ou dois diferentes (H1 e H2) flagellins. A combinação diferente de O, H1, H2 e conta antígenos para os sorovares Salmonella 2500 reconheceu hoje. A sorovar é atribuída com base na fórmula antigênica derivada da identificação do Ó individuais e antígenos H. A fórmula antigênica é escrito como O: H1: H2, e onde &quot;-&quot;, refere-se à ausência de H1 ou H2 flagelina e &quot;NT&quot; (não-tipáveis) para Salmonella negativo para o antígeno O-. Por exemplo, o sorovar Typhimurium é atribuído a um S. enterica isolar com a fórmula antigênica B: i: 1,2, enquanto Enteritidis é dado a um isolado com o D1 fórmula: g, m: -. Essa variação antigênica na população Salmonella é a manifestação exterior de diferenças no nível de nucleotídeos que podem, portanto, ser facilmente explorada por PCR. Nós identificamos as diferenças genéticas associadas com O alelos específicos e H para desenvolver um PCR para a identificação de S. allelotyping enterica sorotipos: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium (3). A atribuição correta e comunicação de Salmonella sorovar requer testes para todos os alelos associados com O: H1: fórmulas antigênicas H2 para Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), e Typhimurium (B: i: 1,2). Sem o conhecimento de O alelo ou antígeno, a conclusão do g H1, m alelo por si só não significa necessariamente identificar a Salmonella Enteritidis como isolar como outros sorovares de Salmonella: Agona, Califórnia, e Montevidéu, também possuem este mesmo alelo. Enquanto a PCR allelotyping foi originalmente concebido para detectar a tona mencionado sorovares de Salmonella, este teste pode identificar um adicional de 19 sorovares (Tabela 3). Nosso allelotyping PCR foi originalmente concebido para detectar alelos S e H. Na prática, tornou-se mais prático e de custo eficaz para identificar a O antígeno pelo teste de aglutinação, utilizando anti-soros específicos O-, ao invés de executar o allelotyping O PCR quando se trabalha com culturas de Salmonella isoladas. No entanto, nós recomendamos o uso do allelotyping O PCR se o seu laboratório utiliza esta PCR como uma tela (2) ou para a digitação Salmonella isolados submetidos em FTA cards (6), e incluem uma PCR Salmonella específicas com a primeira tela de amostras (4 ). Limitar os PCRs allelotyping apenas aquelas amostras que são identificados como Salmonella pela PCR ou testes bioquímicos / antigênica. O protocolo descrito neste artigo foi otimizado para uso com a tecnologia Idaho Rapidcycler, um termociclador de ar quente que permite que um de reduzir volumes de reação e as condições de reação corre em menos tempo do que muitos termocicladores bloco de aquecimento. Para adaptar este protocolo para uso com um termociclador bloco de aquecimento pode exigir otimização das condições de reação empiricamente através da redução / elevando a temperatura do recozimento; ajustar as concentrações de primer; ou ajustar MgCl 2 concentrações. Por exemplo, tivemos de adaptar o protocolo para a Pesquisa MJ PTC-200 termociclador como se segue. Trabalhando com a mesma reação volumes descritos na Tabela 1, o estoque de trabalho concentrationof o conjunto de primers i foi diluído a 2,5 mM, a temperatura de recozimento foi reduzida de 55 ° C a 45 ° C, tempos e incubação na desnaturação, anelamento e extensão passos foi alongado para 20 s para o i / g, m allelotyping PCR. Tendo os controles apropriados positivos e negativos são essenciais para o arranque inicial para cima e otimização para qualquer PCR, incluindo protocolos publicados. Recomendamos a aquisição de sorovares de Salmonella conhecidos, especificamente Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevidéu (C1: g, m, s: 1,2,7) e Typhimurium (B: i: 1,2), e um laboratório de Escherichia coli K12 tensão (DH5α, LE393, JM109, etc ) como controles positivos e negativos, respectivamente, para os testes de PCR allelotyping descrito neste artigo. Vários desses sorovares Salmonella servirá como controle positivo ou negativo, dependendo de qual alelo é testada. Certas precauções e diretrizes precisam ser seguidas durante a realização deste e de qualquer outro meio de diagnóstico PCR. Primeiro, a separação físicamodelo de preparação, PCR set-up, e eletroforese em gel é fundamental na prevenção da PCR possibilidade de reporte de contaminação e geração de relatórios errôneos de falso-positivos. Além disso, a inclusão de controles adequados é necessário em qualquer PCR de rotina como esses controles identificar problemas que possam surgir e ajudar na interpretação dos resultados (5). Mais importante ainda, a consistência é essencial, especialmente no que diz respeito às condições eletroforéticas para amplicon andestimation detecção (PCR produto) de tamanho amplicon. Para ilustrar este ponto, nós propositadamente suspenso eletroforese anteriormente que o previsto na Figura 1A. Os padrões de peso molecular (faixas 1 e 13) e controle positivo (pista 2) não são suficientemente separadas para estimar com precisão tamanhos ou observar a separação de fragmentos de DNA onde existem pequenas diferenças (~ 50 pb) em tamanhos. Separação adequada dos fragmentos de DNA, especialmente os padrões de peso molecular, é essencial como relatórios positivos é dependente da estimativa precisa do tamanho do amplicon e distinguindo &quot;verdadeiro positivo&quot; de não-específica amplicons que às vezes são observadas no cotidiano de qualquer PCR (5 ). Por exemplo, há um amplicon não-específicas na Figura 1B, pista 7 (~ 700 pb de tamanho). Eletroforese tinha sido interrompido cedo demais, quando a frente de corante foi somente no ponto a meio caminho do gel de agarose, haveria pouca diferenciação entre 500 pb e 700 pb fragmentos de DNA. Portanto, a amostra na pista 7 teria sido erroneamente reportados como positivos para ambos os alelos i e g, m. Finalmente, é preciso reconhecer as limitações associadas a qualquer teste. Vários dos allelotyping H1/H2 PCR não tem o poder discriminatório para discernir sutis diferenças genéticas na alelos pertencentes à H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 complexo antígeno; e, n, x / e , n, z15 complexo antígeno ea H1 complexo antígeno-G, que inclui a g, m alelo. Uma ou duas mudanças de aminoácidos para a conta de epítopos presentes em diferentes esses antígenos flagelar. Foi, portanto, difícil para nós, para projetar primers que poderiam explorar essas diferenças de base, por vezes único par na seqüência do gene da flagelina (3). Por exemplo, Salmonella sorovares Dublin (D1: g, p: -) e Berta (D1: f, g, t: -) são também PCR positivos com o nosso g, mallelotyping primers. Os primers H2 allelotyping não pode distinguir Typhimurium (B: i: 1,2) de Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) de Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), ou Remo (B: r: 1,7), ou Hadar (C2: z10: e, n, x) de Glostrup (C2: z10: e, n, z15). Enquanto a probabilidade de encontrar alguns desses sorovares: Lagos, Bradford, Winneba, Remo ou Glustrup é remota, é uma possibilidade e requer o fornecimento de aviso sobre a limitação dos testes ou outro teste confirmatório. Em conclusão, este sorotipagem baseados em PCR identifica rapidamente S. enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg e Typhimurium, e O, H1, H2 e alelos associados com 19 sorotipos adicionais. Este ensaio é uma resposta rápida, alternativa de baixo custo para abordagem microbiológica tradicional para Salmonella sorotipagem.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do material </th><th> Tipo </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentário </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga </td><td> 1,5 ml de capacidade </td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> 200 prova </td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Grau Biologia Molecular </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparáveis; PCR apenas) </td></tr><tr><td> 10 x PCR Buffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td> (Buffer vem com BSA, Ficoll e tartrazina) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Pipetas capilares </td><td> 10 mL de volume </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rápida Cycler </td><td></td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EEO baixa; Grau Biologia Molecular </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> 50 X tampão TAE ou TBE 5X </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Brometo de etídio </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Horizontal, câmara submersível de eletroforese em gel com o molde de gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Fonte de alimentação </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc Sistema </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Materiais

uma pcr allelotyping para identificar salmonella enterica sorovares enteritidis, hadar, heidelberg, e typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Comercial atual testes PCR para identificação de genes-alvo Salmonella exclusivo para este gênero. No entanto, existem duas espécies, seis subespécies, e mais de 2.500 sorotipos de Salmonella diferentes, e nem todos são iguais em sua importância para a saúde pública. Por exemplo, encontrar S. enterica subespécie IIIa Arizona em uma fazenda camada tabela de ovos é insignificante comparado com o isolamento de S. enterica subespécie I serovar Enteritidis, a principal causa de salmonelose relacionados ao consumo de ovos de mesa. Sorovares são identificados com base nas diferenças antigênicas de lipopolissacarídeo (LPS) (antígeno O) e flagelina (H1 e H2 antígenos). Essas diferenças antigênicas são a aparência externa da diversidade de genes e alelos do gene associado a este fenótipo. Nós desenvolvemos um allelotyping, multiplex PCR que as chaves sobre as diferenças genéticas entre os quatro grandes S. sorovares enterica subespécie I encontrados em aves domésticas e associados com doenças humanas significativas em os EUA. Os pares de primers de PCR foram direcionados para os principais genes ou seqüências únicas para um sorotipo Salmonella específicas e destinadas a produzir um amplicon com tamanho específico para o gene ou alelo. Salmonella sorovar é atribuída a um isolado com base na combinação dos resultados dos testes de PCR para LPS específicas e alelos do gene flagelina. Os PCRs multiplex descritos neste artigo são específicos para a detecção de S. enterica subespécie I sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Aqui demonstramos como usar o PCRs multiplex para identificar serovar Salmonella para uma isolar.

Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) correspondente ao alelo alvo.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Os testes de PCR comerciais atuais para a identificação de Salmonella visam genes exclusivos deste gênero. No entanto, existem duas espécies, seis subespécies e mais de ...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar alelos específicos de antígenos de salmonela. Isso é alcançado por meio do direcionamento da PCR para identificar diferenças de sequência específicas associadas a esses alelos. O molde da amostra é adicionado a uma mistura de reação de PCR contendo iniciadores específicos para alelos e a tipagem dos alelos OH um e H dois.As PCR são realizadas no termociclador. Em seguida, as amostras de PCR são separadas por tamanho utilizando eletroforese em gel para determinar o tamanho do amplicon, caso esteja presente em cada amostra ou isolado. O tamanho do amplicon é então comparado ao tamanho esperado para cada conjunto de iniciadores utilizado, obtendo-se resultados de PCR que mostram a identificação de antígenos específicos de salmonela.Os alelos por PCR têm a designação de sorovar atribuída com base nos resultados dos ensaios multiplex PCR para OH um e H dois. A principal vantagem do protocolo descrito neste vídeo em relação ao SYP é que é mais rápido, mais fácil de interpretar e menos caro. Este método pode ajudar a responder algumas questões fundamentais na área da epidemiologia, como determinar a distribuição e a persistência de VARs de Salmonella dentro ou entre granjas avícolas ou leiteiras.A implicação desta técnica estende-se ao diagnóstico rápido de salmonelose atribuída à *Salmonella*, sorovares, *arius* ou *urian*. A demonstração visual deste método é fundamental para compreender como utilizá-lo para tipificar a *Salmonella* até o nível de sorovar. A demonstração deste procedimento será realizada por Adriana Pedroso e Yin Chang, cientistas pesquisadoras nos Laboratórios Lee Mauer da Universidade da Geórgia, para preparar o molde de DNA de células inteiras para a reação subsequente de PCR.Primeiro, inocular um mililitro de caldo LB com salmonela. Isolar a partir de uma única colônia. Incubar o cultivo sob agitação a 200 a 250 rotações por minuto e uma temperatura de incubação de 37 graus Celsius.No dia seguinte, transfira o cultivo de um mililitro para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e centrifugue a suspensão por cerca de dois minutos a 4.500 ×g para obter o pellet celular; em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de etanol a 100%. Incube as células suspensas em etanol à temperatura ambiente por 10 minutos e, então, centrifugue as células como antes. Ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de água destilada estéril. Por fim, dilua a suspensão celular.Um em 20 com água destilada e armazene a menos 20 graus Celsius por até um mês até estar pronto para realizar a preparação da PCR. A dispensação da mistura de reação de PCR deve ser realizada em uma sala fisicamente separada e, de preferência, em uma estação de trabalho dedicada para PCR equipada com luz UV. Primeiro, descontamine a superfície de trabalho com luz UV e limpando com álcool a 10%. Em seguida, utilizando uma pipeta designada exclusivamente para trabalhos de PCR e equipada com ponteiras de barreira.Prepare um estoque mestre de *primers* diluindo primeiro os *primers* até cinco vezes 10 à menos quatro molar com água destilada. Em seguida, dilua o estoque na proporção de um para 20 com água destilada para obter a concentração de trabalho de 25 micromolar. Retire os reagentes de PCR e o molde celular completo do congelador e descongele em gelo.Deixe a tac DNA polimerase no congelador até o momento em que for necessária. Combine os reagentes da PCR de acordo com a tabela um do protocolo escrito. Em seguida, pipete nove microlitros da reação de PCR.Adicione às cavidades de uma placa estéril de microtitulação de poliestireno com fundo redondo de 96 cavidades. Comece no topo da primeira coluna e desça pela coluna, depois passe para o topo da próxima coluna; adicione um microlitro de água destilada à primeira cavidade para servir como controle negativo. Em seguida, distribua 0,5 microlitro dos modelos de controle positivo à mistura de PCR na segunda cavidade e um microlitro de e coli K 12 DH cinco alpha na terceira.Adicione um microlitro do molde da terceira amostra às poças restantes para a PCR de H um I e gyp Salmonella entera, CVaR, TYM e Enteritis, que servirão como controles positivos para os alelos i e GM, respectivamente. Salmonella CVaR, heidelberg e haar são os controles positivos que serão utilizados na segunda PCR de tipagem do alelo H um para detecção dos alelos r e z 10, respectivamente. Em seguida, coloque capilares de vidro com capacidade de 10 microlitros nos suportes designados para a tecnologia Idaho.Uma vez fixado o ciclador rápido no suporte, carregue cada capilar de vidro com a mistura de reação de PCR tocando os capilares no fundo dos poços. Incline o suporte para permitir que o líquido desça pelo tubo e deixe um espaço entre as extremidades e a mistura de PCR. Antes de selar termicamente os tubos de vidro com um maçarico de butano, fechando ambas as extremidades dos capilares, coloque os tubos capilares e o suporte no ciclador rápido da Idaho Technology e utilize os programas do termociclador descritos na tabela um do protocolo escrito para os diferentes tipos de PCR ELO.Após a conclusão do programa do termociclador, prossiga para a etapa de eletroforese em gel de 15 por 10 centímetros, com um gel de agarose de grau biologia molecular a 1,5% contendo brometo de etídio, conforme procedimentos padrão. Uma vez que o gel tenha solidificado, transfira-o para uma câmara horizontal submersível para eletroforese contendo tampão de eletroforese TAE 1×, pré-misturado com 200 microlitros de 0,25 miligramas por mililitro.Marcadores de peso molecular de DNA com carga de 40 microlitros de corante de carga de DNA seis vezes, adicionam 4,8 microlitros do marcador de peso molecular de DNA pré-misturado aos poços central do primeiro e do último. Em seguida, retire uma capilar de vidro contendo uma reação de amostra de PCR do suporte e risque ambas as extremidades da capilar com um cortador de vidro. Depois, posicione o polegar e o indicador de ambas as mãos em ambos os lados da capilar marcada pelo cortador de vidro e quebre a capilar. Coloque o dispensador de capilares na extremidade oposta à mistura da reação de PCR e gire lentamente o êmbolo no sentido horário até que o líquido atinja a parte mais inferior do tubo.Coloque o capilar no poço a ser carregado e gire lentamente o êmbolo no sentido horário para dispensar a amostra pesada na matriz. Tenha cuidado para não perfurar o poço com o capilar ou introduzir uma bolha de ar no poço, continuando a girar o êmbolo após toda a solução ter saído do capilar. Após o carregamento de todas as amostras e padrões, ajuste a voltagem constante da fonte de alimentação para 90 volts.Após a conclusão da eletroforese, transfira o gel para um transiluminador UV para visualizar os fragmentos de DNA e os padrões de peso molecular, capturando imagens em um sistema gel dock XR. Por fim, coloque os suportes de capilar em solução de hipoclorito a 10% por 15 a 30 minutos. Enxágue três vezes com água destilada e devolva-os à sala de preparo de PCR para secagem ao ar.Este primeiro gel corado com brometo de etídio mostra os resultados de uma PCR multiplex para o alelo O associado à Salmonella enterica var. enteritis, Hadda Heidelberg. Antifa. As linhas um e 13 contêm uma escada de DNA de 100 pares de bases.A segunda via contém os controles de PCR multiplex para os alelos O B, C um, C dois, D um e E. As demais vias, da três à 12, contêm isolados de salmonela. Uma designação de alelo é atribuída ao isolado de salmonela com base no amplicon correspondente ao tamanho do controle de PCR e conforme previsto para os conjuntos primers de alelos usados da esquerda para a direita. Esses tamanhos de amplicon são os seguintes: D 1 620 pares de bases, C dois 400 pares de bases, E 1 280 pares de bases, C 1 340 pares de bases e B 560 pares de bases.Este gel corado com brometo de irídio mostra os resultados de uma PCR multiplex do alelo H um para identificar o gel FLA nos alelos eye e gm. O gel foi carregado na mesma ordem apresentada anteriormente. Novamente, um alelo H um é atribuído a cada isolado com base na presença de um amplicão correspondente em tamanho ao controle da PCR e conforme previsto para os quatro conjuntos de iniciadores do alelo H um utilizados da esquerda para a direita.Os tamanhos dos amplicons são GM 310 pares de bases e I 510 pares de bases. Este gel corado com brometo de etídio mostra os resultados de uma PCR multiplex de alelo H um para identificar os alelos gellin r e z 10. Novamente, o gel foi carregado da mesma maneira mostrada anteriormente, e um alelo H um é atribuído a cada isolado com base na presença de um amplicon cujo tamanho corresponde ao controle da PCR; conforme previsto para os quatro conjuntos de iniciadores de alelo H um utilizados, os tamanhos dos amplicons são R 170 pares de bases e Z dez 360 pares de bases. Uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, lembre-se de separar fisicamente o preparo do molde, a montagem da PCR e a eletroforese em gel, de modo a minimizar o potencial de contaminação por carryover da PCR.

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Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um teste isotémico de amplificação de ácido nucleico (iNAAT) que tem atraído amplo interesse no campo de detecção de patógenos. Aqui, apresentamos um protocolo salmonella LAMP validado em vários laboratórios como um método rápido, confiável e robusto para a triagem de Salmonella em alimentos animais e confirmando salmonela presuntiva do isolamento cultural.

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

Este artigo apresenta uma série de métodos consecutivos para a expressão e purificação de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp este protocolo um sistema rápido para purificar o complexo proteico em um dia. Os métodos cobertos são mutagênese direcionada ao local, expressão proteica em Escherichia coli,cromatografia de afinidade, cromatografia de filtração de gel e cristalização.

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

A viabilidade de estratégias de sequenciamento do genoma completo (WGS) usando instrumentos de bancada simplificou a interrogação do genoma de cada micróbio de relevância para a saúde pública em um ambiente de laboratório. Uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para WGS bacteriano é descrita e um pipeline de bioinformática para análise também é apresentado.

Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

Aprenda a identificar sorovares de Salmonella enterica usando PCR multiplex para detecção rápida de patógenos. Este método melhora a segurança alimentar e auxilia estudos epidemiológicos em microbiologia molecular.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

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