Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar alelos específicos de antígenos de salmonela. Isso é alcançado por meio do direcionamento da PCR para identificar diferenças de sequência específicas associadas a esses alelos. O molde da amostra é adicionado a uma mistura de reação de PCR contendo iniciadores específicos para alelos e a tipagem dos alelos OH um e H dois.

As PCR são realizadas no termociclador. Em seguida, as amostras de PCR são separadas por tamanho utilizando eletroforese em gel para determinar o tamanho do amplicon, caso esteja presente em cada amostra ou isolado. O tamanho do amplicon é então comparado ao tamanho esperado para cada conjunto de iniciadores utilizado, obtendo-se resultados de PCR que mostram a identificação de antígenos específicos de salmonela.

Os alelos por PCR têm a designação de sorovar atribuída com base nos resultados dos ensaios multiplex PCR para OH um e H dois. A principal vantagem do protocolo descrito neste vídeo em relação ao SYP é que é mais rápido, mais fácil de interpretar e menos caro. Este método pode ajudar a responder algumas questões fundamentais na área da epidemiologia, como determinar a distribuição e a persistência de VARs de Salmonella dentro ou entre granjas avícolas ou leiteiras.

A implicação desta técnica estende-se ao diagnóstico rápido de salmonelose atribuída à *Salmonella*, sorovares, *arius* ou *urian*. A demonstração visual deste método é fundamental para compreender como utilizá-lo para tipificar a *Salmonella* até o nível de sorovar. A demonstração deste procedimento será realizada por Adriana Pedroso e Yin Chang, cientistas pesquisadoras nos Laboratórios Lee Mauer da Universidade da Geórgia, para preparar o molde de DNA de células inteiras para a reação subsequente de PCR.

Primeiro, inocular um mililitro de caldo LB com salmonela. Isolar a partir de uma única colônia. Incubar o cultivo sob agitação a 200 a 250 rotações por minuto e uma temperatura de incubação de 37 graus Celsius.

No dia seguinte, transfira o cultivo de um mililitro para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e centrifugue a suspensão por cerca de dois minutos a 4.500 ×g para obter o pellet celular; em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de etanol a 100%. Incube as células suspensas em etanol à temperatura ambiente por 10 minutos e, então, centrifugue as células como antes. Ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de água destilada estéril. Por fim, dilua a suspensão celular.

Um em 20 com água destilada e armazene a menos 20 graus Celsius por até um mês até estar pronto para realizar a preparação da PCR. A dispensação da mistura de reação de PCR deve ser realizada em uma sala fisicamente separada e, de preferência, em uma estação de trabalho dedicada para PCR equipada com luz UV. Primeiro, descontamine a superfície de trabalho com luz UV e limpando com álcool a 10%. Em seguida, utilizando uma pipeta designada exclusivamente para trabalhos de PCR e equipada com ponteiras de barreira.

Prepare um estoque mestre de *primers* diluindo primeiro os *primers* até cinco vezes 10 à menos quatro molar com água destilada. Em seguida, dilua o estoque na proporção de um para 20 com água destilada para obter a concentração de trabalho de 25 micromolar. Retire os reagentes de PCR e o molde celular completo do congelador e descongele em gelo.

Deixe a tac DNA polimerase no congelador até o momento em que for necessária. Combine os reagentes da PCR de acordo com a tabela um do protocolo escrito. Em seguida, pipete nove microlitros da reação de PCR.

Adicione às cavidades de uma placa estéril de microtitulação de poliestireno com fundo redondo de 96 cavidades. Comece no topo da primeira coluna e desça pela coluna, depois passe para o topo da próxima coluna; adicione um microlitro de água destilada à primeira cavidade para servir como controle negativo. Em seguida, distribua 0,5 microlitro dos modelos de controle positivo à mistura de PCR na segunda cavidade e um microlitro de e coli K 12 DH cinco alpha na terceira.

Adicione um microlitro do molde da terceira amostra às poças restantes para a PCR de H um I e gyp Salmonella entera, CVaR, TYM e Enteritis, que servirão como controles positivos para os alelos i e GM, respectivamente. Salmonella CVaR, heidelberg e haar são os controles positivos que serão utilizados na segunda PCR de tipagem do alelo H um para detecção dos alelos r e z 10, respectivamente. Em seguida, coloque capilares de vidro com capacidade de 10 microlitros nos suportes designados para a tecnologia Idaho.

Uma vez fixado o ciclador rápido no suporte, carregue cada capilar de vidro com a mistura de reação de PCR tocando os capilares no fundo dos poços. Incline o suporte para permitir que o líquido desça pelo tubo e deixe um espaço entre as extremidades e a mistura de PCR. Antes de selar termicamente os tubos de vidro com um maçarico de butano, fechando ambas as extremidades dos capilares, coloque os tubos capilares e o suporte no ciclador rápido da Idaho Technology e utilize os programas do termociclador descritos na tabela um do protocolo escrito para os diferentes tipos de PCR ELO.

Após a conclusão do programa do termociclador, prossiga para a etapa de eletroforese em gel de 15 por 10 centímetros, com um gel de agarose de grau biologia molecular a 1,5% contendo brometo de etídio, conforme procedimentos padrão. Uma vez que o gel tenha solidificado, transfira-o para uma câmara horizontal submersível para eletroforese contendo tampão de eletroforese TAE 1×, pré-misturado com 200 microlitros de 0,25 miligramas por mililitro.

Marcadores de peso molecular de DNA com carga de 40 microlitros de corante de carga de DNA seis vezes, adicionam 4,8 microlitros do marcador de peso molecular de DNA pré-misturado aos poços central do primeiro e do último. Em seguida, retire uma capilar de vidro contendo uma reação de amostra de PCR do suporte e risque ambas as extremidades da capilar com um cortador de vidro. Depois, posicione o polegar e o indicador de ambas as mãos em ambos os lados da capilar marcada pelo cortador de vidro e quebre a capilar. Coloque o dispensador de capilares na extremidade oposta à mistura da reação de PCR e gire lentamente o êmbolo no sentido horário até que o líquido atinja a parte mais inferior do tubo.

Coloque o capilar no poço a ser carregado e gire lentamente o êmbolo no sentido horário para dispensar a amostra pesada na matriz. Tenha cuidado para não perfurar o poço com o capilar ou introduzir uma bolha de ar no poço, continuando a girar o êmbolo após toda a solução ter saído do capilar. Após o carregamento de todas as amostras e padrões, ajuste a voltagem constante da fonte de alimentação para 90 volts.

Após a conclusão da eletroforese, transfira o gel para um transiluminador UV para visualizar os fragmentos de DNA e os padrões de peso molecular, capturando imagens em um sistema gel dock XR. Por fim, coloque os suportes de capilar em solução de hipoclorito a 10% por 15 a 30 minutos. Enxágue três vezes com água destilada e devolva-os à sala de preparo de PCR para secagem ao ar.

Este primeiro gel corado com brometo de etídio mostra os resultados de uma PCR multiplex para o alelo O associado à Salmonella enterica var. enteritis, Hadda Heidelberg. Antifa. As linhas um e 13 contêm uma escada de DNA de 100 pares de bases.

A segunda via contém os controles de PCR multiplex para os alelos O B, C um, C dois, D um e E. As demais vias, da três à 12, contêm isolados de salmonela. Uma designação de alelo é atribuída ao isolado de salmonela com base no amplicon correspondente ao tamanho do controle de PCR e conforme previsto para os conjuntos primers de alelos usados da esquerda para a direita. Esses tamanhos de amplicon são os seguintes: D 1 620 pares de bases, C dois 400 pares de bases, E 1 280 pares de bases, C 1 340 pares de bases e B 560 pares de bases.

Este gel corado com brometo de irídio mostra os resultados de uma PCR multiplex do alelo H um para identificar o gel FLA nos alelos eye e gm. O gel foi carregado na mesma ordem apresentada anteriormente. Novamente, um alelo H um é atribuído a cada isolado com base na presença de um amplicão correspondente em tamanho ao controle da PCR e conforme previsto para os quatro conjuntos de iniciadores do alelo H um utilizados da esquerda para a direita.

Os tamanhos dos amplicons são GM 310 pares de bases e I 510 pares de bases. Este gel corado com brometo de etídio mostra os resultados de uma PCR multiplex de alelo H um para identificar os alelos gellin r e z 10. Novamente, o gel foi carregado da mesma maneira mostrada anteriormente, e um alelo H um é atribuído a cada isolado com base na presença de um amplicon cujo tamanho corresponde ao controle da PCR; conforme previsto para os quatro conjuntos de iniciadores de alelo H um utilizados, os tamanhos dos amplicons são R 170 pares de bases e Z dez 360 pares de bases. Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser realizada em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, lembre-se de separar fisicamente o preparo do molde, a montagem da PCR e a eletroforese em gel, de modo a minimizar o potencial de contaminação por carryover da PCR.