Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

Este vídeo demonstra um procedimento para gerar culturas tridimensionais que permitem que progênitores semelhantes aos pancreáticos se diferenciem em colônias expressantes de insulina. Primeiro, células diferenciadas derivadas de uma linhagem de células-tronco embrionárias murinas com inserção de EGFP em três loci neurogen são dissociadas e separadas com base na expressão de EGFP para enriquecer a população de progênitores semelhantes a células endócrinas. As células únicas classificadas positivas para EGFP são semeadas em um meio semissólido contendo matrigel e fatores de crescimento.

Isso limita o movimento de células progenitoras individuais, ao mesmo tempo que permite sua sobrevivência, proliferação e diferenciação in vitro. Em seguida, o número de colônias resultantes com morfologia distinta é contado e pontuado ao microscópio para calcular a frequência de progenitores formadores de colônias em uma determinada população classificada. A análise de colônias individuais por PCR em tempo real e microscopia de imunofluorescência revela expressão de insulina em colônias derivadas de células positivas para ngn três, mas não em colônias derivadas de células negativas para NGN três.

A principal vantagem do uso desta técnica em comparação com técnicas existentes, como esferoides pancreáticos em cultura de suspensão, é que ela permite examinar simultaneamente uma maior quantidade de células quanto à sua capacidade intrínseca de formar colônias progenitoras. Este método pode ajudar a responder perguntas sobre a biologia das células-tronco e progenitoras pancreáticas, como quais marcadores as células progenitoras expressam e quais fatores intrínsecos ou extrínsecos são importantes para a manutenção da autorrenovação e diferenciação dessas células. As implicações desta técnica podem estender-se à terapia do diabetes tipo 1, pois, se as células progenitoras pancreáticas puderem ser identificadas e diferenciadas em células semelhantes a beta, essas células poderão ser usadas para substituir as células beta danificadas em pacientes com diabetes tipo 1 em estágio terminal.

Ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o estudo da colônia, formando células progenitoras do pâncreas pós-natal e adulto, medula óssea, fígado e baço. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois dissociar as células em uma suspensão de células isoladas e manipular o matrigel e a metilcelulose durante a preparação para a dispensação pode ser difícil. Tive pela primeira vez a ideia para este método quando percebi que não havia um ensaio clonogênico capaz de abordar a relação de linhagem entre células progenitoras e seus descendentes diferenciados do pâncreas.

Esse tipo de ensaio de colônia tem sido fundamental para o estudo de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras no passado. Reconheço a necessidade de um ensaio desse tipo para o estudo da biologia das células-tronco pancreáticas. A demonstração visual deste método é essencial porque o componente semissólido do meio é, por natureza, viscoso, e os passos de preparação e distribuição são difíceis de aprender.

Os procedimentos serão demonstrados pelo mestrandos Michael Winkler, a técnica Nancy e o Dr. Lang Jing, pesquisador pós-doutorando de um laboratório, para gerar meio condicionado para o ensaio de colônia que será realizado posteriormente. Células ES neurais são diferenciadas em células semelhantes às pancreáticas in vitro. Inicie este procedimento examinando corpos embrionários com seis dias de idade sob um microscópio óptico.

Pelo menos 30 a 40% deles devem ter diâmetros de pelo menos 150 mícrons. O corpo embrionário maior deve conter manchas escuras que indiquem diferenciação aumentada. Transfira 80 a 100 corpos embrionários para cada poço de uma placa de adesão de seis poços e, em seguida, agite suavemente a placa para reunir os corpos embrionários no centro dos poços, aumentando os contatos célula a célula.

Esses contatos resultam em um melhor desenvolvimento de células semelhantes às pancreáticas a partir de corpos embrionários. Coloque cuidadosamente as placas de volta no incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na cultura. Um 13.

Substitua o meio por meio de cultura de adesão fresco contendo nicotinamida em quatro e fator recombinante humano ativo em beta B para induzir a diferenciação de células endócrinas. Em seguida, retorne as culturas ao incubador em cultura. No dia 16, colete o meio e filtre-o através de uma membrana de poliéter sulfônico de 0,2 mícron para se livrar de qualquer debris celular.

A partir deste ponto, o meio coletado será denominado meio condicionado; alíquota o meio condicionado em tubos cónicos de polipropileno de 15 mililitros e armazene-os a menos 80 graus Celsius até pouco antes do uso. Neurogênina 3 é um fator de transcrição expresso por precursores endócrinos pancreáticos durante o desenvolvimento. Precursores endócrinos que expressam neurogênina 3 diferenciam-se, por fim, em células alfa, beta, delta, épsilon e em células que expressam polipeptídeo pancreático. Para facilitar a identificação das células que expressam NGN3, um alelo do locus NGN3 foi substituído pelo gene repórter EGFP em uma linhagem de células-tronco embrionárias murinas knock-in. A linhagem celular resultante foi denominada NGN3-EGFP para obtenção de células diferenciadas positivas para NGN3-EGFP e negativas para NGN3-EGFP.

As células são inicialmente destacadas das placas de cultura com tripsina no dia 16 para produzir uma suspensão de células isoladas. Os agregados celulares são incubados com colagenase B e DNAse I e passados por uma malha de 40 ou 70 mícrons. Em seguida, o DPI é adicionado e as células são separadas em um classificador celular para distinguir dispersão para frente versus dispersão lateral, que indicam respectivamente o tamanho e a granularidade celular, e são representadas graficamente.

Em seguida, é definido um gate para eliminar detritos não celulares. O DPI é utilizado para discriminar células mortas, que serão coradas positivamente. Quando excitado entre 405 e 413 nanômetros e a emissão detectada com um filtro de 454/40, o perfil do pulso de dispersão lateral revela dupletos, os quais devem ser eliminados antes de passar pelo gate do sorteador de células ativado por fluorescência, no canal de EGFP FL1 versus autofluorescência.

Usando células do dia 16 de uma linhagem celular parental controle, como a TL mostrada no painel esquerdo, observa-se a fluorescência real e, assim, a população de células positivas para NGN três EEG FP pode ser visualizada conforme visto no painel direito. O portão de seleção para células positivas para NGN três EGFP é intencionalmente movido para a direita, conforme indicado aqui pela seta, a fim de limitar a contaminação por células NGN três EEG FP negativas durante a seleção. Uma vez estabelecidos os portões, as células positivas para NGN três EEG FP e as células negativas para NGN três EGFP são separadas e armazenadas sob gelo até o uso, em preparação para semeadura.

Coloque o gel de matriz na geladeira a quatro graus Celsius na noite anterior ao experimento. No dia do experimento, coloque os seguintes reagentes ou soluções em gelo: D-M-E-M-F 12, metilcelulose, meio condicionado, FCS, nicotinamida, XTEND em quatro, VEGF A e inativo humano recombinante em beta B. Coloque uma caixa estéril de ponteiras de pipeta de 200 microlitros a menos 20 graus Celsius pelo menos meia hora antes do uso. Em preparação para semear as células separadas, os componentes do meio semissólido devem primeiro ser adicionados a um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Primeiro, use uma agulha de calibre 16 e meio para aspirar uma pequena quantidade da solução de metilcelulose 3,3% para dentro de uma seringa.

Em seguida, empurre imediatamente a solução para expelir o ar. Isso preencherá o espaço morto na seringa com a solução e facilitará a medição correta do volume da solução semissólida. Depois, evitando a formação de bolhas de ar, aspire e transfira o volume pretendido da solução de metilcelulose para um tubo de cinco mililitros.

Adicione o meio condicionado FCS nicotinamida que estende quatro ativos em beta B, VEGF A e D-M-E-M-F 12. Em seguida, use ponteiras frias para adicionar o matrigel. Por fim, adicione a quantidade desejada de células classificadas ao tubo de cinco mililitros.

Sempre adicione as células por último para evitar a estimulação prematura das células. Em seguida, tampe firmemente o tubo e agite os tubos vigorosa e completamente à mão. Como a agitação gera bolhas de ar, coloque os tubos no gelo por cinco minutos ou até que as pequenas bolhas de ar subam à superfície.

Usando uma seringa de um mililitro com uma agulha de 18 e meia polegadas, aspire uma pequena quantidade da mistura celular de meio semissólido e imediatamente elimine o ar da seringa. Em seguida, dispense lentamente 500 microlitros da mistura celular semissólida diretamente no centro de cada poço de uma placa de 24 poços com baixa adesão. Cada amostra deve ser semada em quádruplo, utilizando apenas as quatro colunas internas, as mais centrais, da placa de 24 poços disposta horizontalmente, para o cultivo.

Preencha as cavidades restantes com água estéril para auxiliar na umidificação da cultura contida na placa. Imediatamente após a semeadura, observe as células em um microscópio óptico.

Células individuais são distribuídas aleatoriamente e uniformemente pelos poços. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no ar por oito a 12 dias. Após a incubação de oito a 12 dias, observe novamente as células ao microscópio.

Este é um bom exemplo de matrigel distribuído uniformemente na cultura. Aqui há um exemplo de distribuição desigual do matri gel, resultando no framework Apache. As colônias não crescem onde o matri gel está ausente.

Este é um exemplo do fundo do poço onde não foi adicionado matri gel à mistura de meio semissólido. Para contar as colônias resultantes, fixe uma grade sob a placa. Em seguida, utilizando uma lente objetiva de 10 vezes, observe e conte as colônias; devido à natureza tridimensional do meio, as colônias aparecerão em diferentes planos focais.

Assim, um ajuste do foco para cada colônia pode ser necessário durante a observação por microscopia óptica; aqui são apresentadas imagens fotomicrográficas representativas de colônias que expressam insulina em cultura semissólida após oito a 12 dias. As colônias indicadas pelas setas estão distribuídas aleatoriamente e aparecem como pequenos aglomerados escuros, não refletores à luz, com diâmetro aproximado de 60 a 100 micrômetros. A análise subsequente por microfluídica e R-T-P-C-R de colônias individualmente selecionadas manualmente revelou expressão de insulina dois e glucagon, consistente com nosso relato anterior. Esses resultados demonstram a capacidade de células individuais NGN três EGFP positivas de se diferenciarem em colônias contendo simultaneamente dois hormônios de ilhotas, assemelhando-se a células endócrinas primitivas do tipo primeira onda. A expressão proteica de eptídeo, um marcador para produção de insulina de novo, foi confirmada por meio de coloração fluorescente em montagem total.

Em resumo, quando o ensaio de unidades formadoras de colônias que expressam insulina é realizado conforme ilustrado neste relatório, o número de progenitores individuais que têm a capacidade de formar colônias pode ser facilmente determinado, como demonstrado aqui e em nosso relatório anterior. Unidades formadoras de colônias que expressam insulina podem ser enriquecidas por meio de separação com células NGN3 EGFP positivas, mas não com células NGN3 EGFP negativas derivadas de células-tronco embrionárias de rato in vitro. Após dominar esta técnica, ela pode ser realizada em uma a três horas. Após a separação, ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de dissociar completamente as células em uma suspensão de células isoladas e manter todos os componentes do cultivo em gelo para evitar a solidificação do Matrigel, além de adicionar as células aos tubos por último, para evitar a estimulação prematura das células. Após este procedimento, outros métodos, como a manipulação de célula única, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se uma única célula é suficiente para iniciar a formação de colônias após seu desenvolvimento.

Essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores na área da biologia de células-tronco e progenitoras pancreáticas. Ela permite explorar a capacidade de autorrenovação e a capacidade de diferenciação em células semelhantes a beta. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio quantitativo de colônia para progenitores formadores de colônias que expressam insulina.