CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Olá, meu nome é Richard Lin e sou pesquisador aqui no grupo do professor TI Mercy na Divisão de Ciências e Tecnologia da Saúde do MIT de Harvard. O projeto em que estou trabalhando é quantificar e capturar quatro linfócitos T positivos para CD e C3 positivos. No sangue do paciente deve ser usado em ambientes com recursos limitados.

Então, bem na minha frente, aqui temos um dispositivo de micropreenchimento composto de PDMS, que é Polymethyl Sloane. O dispositivo, o canal em si, a alta é de 50 micrômetros de altura e o volume total no dispositivo é de 10 microlitros. Portanto, este é um dispositivo extremamente preciso que vamos usar para capturar linfócitos T auxiliares.

Basicamente, a referência de diagnóstico para pacientes com HIV. Portanto, a superfície do dispositivo microfluídico já foi preparada com proteína e quatro anticorpos positivos para CD na seringa. No momento, temos apenas o tampão biológico PBS em pH de 7,4 e agora vamos fluir isso para o canal para liberar o anticorpo extra CD quatro positivo.

Nesta fase, a taxa não precisa ser controlada porque estamos apenas tentando liberar as coisas extras e realmente não importa qual é a nossa taxa. É aqui que estarão as entradas do dispositivo e essas serão as saídas para a nossa, à minha esquerda e à sua direita aqui. Então, agora vou lavar a solução de anticorpos extra e se você puder notar na saída que o fluido está saindo, você sabe que é uma quantidade muito pequena, mas se você olhar de perto, poderá ver que o fluido de ar sai do canal através da tubulação.

Então, agora que eliminamos a solução extra de anticorpos, podemos nos preparar para fluir injetando o sangue. Então, agora vou desconectar a tubulação da entrada. Então agora vamos abrir uma nova seringa para o sangue, sangue humano, sangue total.

Portanto, não é uma amostra de paciente, é uma amostra saudável, uma amostra de sujeito saudável enquanto nos preparamos para injetar o sangue no dispositivo microfluídico. Então, vamos colocar a seringa na bomba da seringa. Agora vamos ligar e você pode ver as taxas de fluxo da seringa e definimos para cinco microlitros por minuto.

E agora vamos basicamente nos preparar para injetar no sangue. Vamos colocar o bombeador de seringa verticalmente porque, como sabemos, as células sanguíneas produzem sedimentos e nós queremos que as células fluam para o canal. Então, em vez disso, tenha o sedimento celular no fundo, que fica bem perto de nossa tubulação.

Então agora tudo está configurado pronto para ir. O volume do meu dispositivo é de 10 microlitros por 10 microlitros. E o volume que queremos fluir para a parede do canal também é de 10 microlitros.

Então eu posso dizer se eu fluo sangue suficiente apenas olhando para a cor do canal, se está todo vermelho todo cheio, então sei que fluo em 10 microlitros e devo parar o pára-choque da seringa. Então agora eu vou pressionar um botão Iniciar e ele vai começar às vezes, às vezes demora um pouco antes que o sangue realmente entre em um canal. E isso se deve muito à pressão.

Por exemplo, quando colocamos a seringa lá, às vezes retiramos ou injetamos o fluido de acordo para ajustar o sangue no tubo. Então pode ser alguma coisa, pode demorar um pouco, mas uma vez que começa a bombear para um canal, a vazão é definida em ly por minuto, que é o que queremos. Então, podemos ser um pouco pacientes aqui e esperar, às vezes você tem que esperar dois minutos, três minutos antes que o sangue comece a canalizar.

Na verdade, você pode ver agora que o sangue está começando a entrar no canal. Então você pode dizer agora que o dispositivo está quase completamente cheio. Ok, então agora vamos mudar o tubo de volta para PBS para liberar o sangue que está no canal.

E para isso repetiremos o que já fizemos para remover a tubulação. Como ainda precisamos controlar a taxa de fluxo do PBS, ainda precisamos do bombeador de seringa. No entanto, como não estamos mais fluindo sangue, não precisamos deixar o bombeador de seringa na posição vertical porque não há células no PBS.

Então, agora estamos prontos e agora vamos eliminar o sangue do dispositivo e vou pressionar o botão afiado novamente aqui. Então, como você pode ver, o dispositivo está começando a limpar. As bordas ainda estão um pouco de sangue, mas estão desaparecendo lentamente.

Então, uma vez que todo o sangue tenha acabado, aumentaremos a taxa de cinco microlitros por minuto para 20 microlitros por minuto. E a razão para essa mudança é porque no sangue existem na verdade dois tipos de células que têm antígenos C quatro positivos. Um é o que estávamos procurando, os linfócitos T auxiliares.

O outro é o que chamamos de monócitos. Queremos ter certeza de que nosso dispositivo captura especificamente apenas os linfócitos T auxiliares, em vez dos linfócitos T auxiliares e dos monócitos. E o método que fazemos isso é aumentar a taxa de fluxo porque sabemos que os monócitos são maiores em tamanho do que as células T auxiliares.

Assim, ao aumentar as taxas de fluxo, os monócitos maiores sofrerão mais pressão para deixar a superfície do que as quatro células T auxiliares positivas. Então agora é em cerca de 20 minutos. Então, na minha mão agora é, é uma solução.

É chamado de solução de licenciamento de fax. O objetivo disso é ligar glóbulos vermelhos. Portanto, onde quer que os glóbulos vermelhos permaneçam no canal, essa solução o encontrará.

Isso é diluído 10, 10 vezes a partir da solução estoque. Então, agora o que vamos fazer é parar o bombeador da seringa, remover a tubulação e basicamente substituir a solução pela desta seringa. Então agora estou parando a máquina, removendo o tubo, tirando isso, pegando com esta seringa, substituindo-o por um novo.

Ok, agora que tenho tudo configurado, vamos diminuir a taxa de volta para cinco microlitros por minuto. Então, clicaremos na taxa de 20, diminuiremos para cinco e agora fluiremos na solução de licença de fax por 20 minutos. E agora vamos pressionar iniciar.

Então, na nossa frente agora está uma imagem óptica do dispositivo tirada com ampliação de 10x. Então você pode contar todos esses pontos brancos aqui nós mesmos. Então, como podemos ter certeza de que essas células são as que estamos procurando?

Então, usamos algumas colorações diferentes para garantir que a primeira coloração que usamos seja o que chamamos de dpi, toda ela, ela cora em manchas de DPI no núcleo. Então, basicamente, qualquer célula com núcleo, como os glóbulos brancos com todas as manchas, enquanto, digamos, os glóbulos vermelhos que não têm núcleo, não seriam corados e você pode dizer que está em toda a imagem. Eles são todos esses pontos azuis e cada um com azul.

é uma célula. Então, agora o próximo passo é verificar se as células têm o que chamamos de antígeno C quatro positivo. Isso é extremamente importante porque todo o propósito do nosso dispositivo é capturar C quatro células positivas.

Então, a seguir, o anticorpo fluorescente que usamos, é claro, é específico para C quatro. E vá para o próximo slide. Então, nesta foto, as células ficam muito mais escuras porque o anticorpo fluorescente que usamos geralmente é para fatos.

Portanto, a diluição é muito maior. Mas se você olhar bem de perto, ainda pode dizer que ainda há pontos espalhados ao redor dessa visão de campo. Eles são bastante escuros.

Mas, após um exame mais detalhado, podemos dizer que essas células estão em DC para positivo, o que é bom porque é exatamente isso que queremos. E o próximo teste é, como mencionei antes, existem dois tipos diferentes de células C quatro positivas. Um são os que queremos as células T auxiliares e o outro são o que chamamos de monócitos.

Então, novamente, precisamos de outro anticorpo fluorescente para diferenciar entre as duas células. Portanto, sabemos que nos linfócitos T auxiliares eles têm o que chamamos de três antígenos positivos para CD. Enquanto para os monócitos não.

Portanto, o próximo anticorpo que usamos é o CD três específico, que veremos nesta foto. Então, novamente, você pode dizer que seus pontos se espalham ao redor do dispositivo, eles, os pontos parecem maiores porque às vezes algumas células brilham mais, outras não. Quero dizer isso, muitas coisas dependem do acaso neste caso, mas na maioria dos casos, esses pontos em pontos vermelhos brilhantes são todos células.

Então, nós apenas, novamente, o que queremos porque, primeiro, certifique-se de que nossas células sejam CD quatro positivas e CD três positivas. Então, neste caso, você pode dizer a, muitas de nossas células estão em d CD três positivos, o que é bom. Isso nos dá especificidade em nossa captura.

O grande dos, pode ser lixo, mas muitas vezes o que acontece é que às vezes uma célula simplesmente reúne mais CD três flushes, CD três em si mesma. Então, nesta foto, esse é um dos dados que coletamos para esse dispositivo de microfluido e é basicamente um profissional de captura de células. Então, no anterior, você sabe, slides, outros enfeites, você pode dizer que havia muitas, você sabe, fotos com células nelas.

Mas o que eles realmente acumulam? Bem, eles se acumulam em um perfil de captura de célula, caso em que podemos plotar no eixo X temos a distância da entrada e no eixo Y temos o disco da célula de captura. E você pode dizer que em todo o dispositivo, você sabe, sua densidade inicialmente é extremamente alta e depois diminui lentamente, que é o que nós, esperaríamos porque estamos capturando as células C quatro positivas e três po, C3 positivas da corrente sanguínea e elas diminuirão a concentração dessas células na amostra de sangue.

E é basicamente assim que nossos dados geralmente são apresentados.