Name: Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a visualizar a reação autoimune na pele de macacos Rhesus com dermatite herpetiforme usando imunofluorescência e microscopia confocal. Este método ajuda pesquisadores a estudar mecanismos autoimunes em modelos animais.

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Os autores gostariam de agradecer a Amanda Tardo, Dr. Mostafa Bouljihad, Stephanie Feely, Carol Coyne, Dr. Erin Ribka, Dr. Didier e Pete Dorothy Kuebler por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-DK076653 e 3R01-DK076653-02S1 para KS e da subvenção de funcionamento base do TNPRC RR000164.

1. Coleta de amostra de biópsia de pele <ol><li> Antes de procedimento de biópsia de pele, anestesiar animais por via intramuscular com 2,5 mg / kg de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepam mistura telazol (Fort Dodge Saúde Animal, Fort Dodge, IA). Monitorar os animais desde a administração do anestésico até decúbito e depois remover do seu gabinete. </li><li> Remover os pêlos da área de interesse da pele utilizando uma de Ouro Oster A5 Clipper Single Speed ​​Veterinária com uma lâmina de tamanho 40 (Oster Professional Products, McMinnville, TN) e preparar assepticamente com alternância matagal betadine e álcool. Garantir uma cortina fenestrado estéril sobre o local da biópsia selecionado. </li><li> Usando uma técnica asséptica, coloque um 4,0 milímetros Miltex Soco instrumento de biópsia cutânea (Miltex, York, PA) contra a pele enquanto gira o instrumento de 180 graus no sentido horário e anti-horário com leve pressão até que a biópsia transectos através das camadas dérmicas na ti subcutâneassue. Retirar a amostra da biópsia e agarrar a parte transeccionados da pele com uma pinça e livre do tecido subcutâneo. </li><li> Fechar o defeito da pele com fio de náilon 3-0 ligado a uma agulha 3 / 8 círculo de corte (Ethilon, Ethicon, Johnson &amp; Johnson Medical Limited, Berkshire, UK) em um padrão cruzado. Dar a todos os animais de cloridrato de buprenorfina 0,01 mg / kg (Hospira, Lake Forest, IL) por via intramuscular para analgesia pós-operatória. </li></ol> 2. Processamento das amostras <ol><li> Trabalhar com amostras de biópsia da pele de dermatite crônica e controles saudáveis ​​macacos rhesus. Obter 2-3 (4 mm de diâmetro) biópsia amostras de cada animal. </li><li> Fix primeira amostra em formol de zinco (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) por 24 horas, lave em água por 30 min, lave brevemente em etanol 70%, e coloque em ASP300 processador de tecido Leica (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS) onde o tecido é desidratado com graus ascendentes de 70%, 80%, 95% e 100% de etanol 48min cada (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), seguido por duas mudanças de xileno (Fisher). </li><li> Incorporar em media de parafina (Fisher) para armazenamento de longo prazo na temperatura ambiente. Coloque a-20oC por 20 min antes do corte. Prepare 6 seções M usando um micrótomo rotativo (HM325, Microm International, Waldorf, Alemanha). Seções lugar em slides cobrado (Fisher) e ar seco a 60 º C durante a noite. Mancha com hematoxilina e eosina (H &amp; E) método padrão (descritas abaixo). </li><li> Fix segunda amostra em paraformaldeído 2% (USB Corp, Cleveland, OH) por 30 min em temperatura ambiente, lavar três vezes em tampão fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), lugar em sacarose 30% (Fisher) para 4 horas, e incorporar em outubro média de congelamento (Sakura Finetek, Torrence, CA). Mantenha a-80oC por 20 min antes do corte. Prepare 15 seções M utilizando o criostato (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). </li></ol> 3. Coloração H &amp; E <ol><li> Deparaffinize incorporarseções ded por três mudanças de xilenos (Fisher) e hidratar através etanóis classificados: três alterações de 100%, duas mudanças de 95%, uma mudança de 80% e água destilada, 2 min cada um. </li><li> Mancha com hematoxilina (Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI) por um min e siga por uma lavagem rápida em água corrente. </li><li> Contracoloração com eosina (Sigma) por 6 min. </li><li> Desidratar os tecidos manchados por 95% e etanol absoluto, duas mudas de 2 min cada um e em seguida, desmarque em três mudanças de xilenos, 3 min cada. </li><li> Monte lamela usando Meio de Montagem Cytoseal (Richard Allan-Científica) sobre a H &amp; E-seções manchada do tecido. </li></ol> 4. Avaliação histopatológica Inspecionar H &amp; E-corados biópsia da pele sob um microscópio de luz usando a 4 - aumento 40x e microscópio Leica com um SPOT introspecção câmera digital (Digital Instruments Inc., Michigan, EUA). 5. Imunofluorescência staining <ol><li> Trabalhar com seções outubro-embedded da pele para a coloração de imunofluorescência. Antes da coloração, de molho por 20 min em PBS contendo 0,2% de peixes de pele de gelatina (FSG, Sigma) com 0,1% Triton X-100 (Sigma) para remover a outubro e de permeabilizar o tecido. </li><li> Depois de lavar os slides, incube com 10% de soro normal de cabra (NGS, Sigma), diluído em PBS-FSG por 1 hora, à temperatura ambiente, em uma câmara de corrediça umidificado. </li><li> Para visualizar a deposição de IgA e tTG2 anticorpos, incubar slides com anti-rhesus IgA e tTG2 anticorpos primários, diluídos em 10% NGS-PBS-FSG por 1 hora. </li><li> Lavar com X-100 PBS-FSG-Triton (Sigma) por 10 min, seguido por PBS-FSG por 10 min. </li><li> Incube com secundário, isotipo de anticorpos específicos marcados com fluorocromos Alexa Fluor 488 (verde), 568 (vermelho) ou 633 (azul) (Molecular Probes-Invitrogen) na diluição 1:1.000. Use o corante ToPro-3 para visualizar o DNA nuclear. Use os 10% NGS-PBS-FSG como diluente de anticorpo. </li><li> Use a solução anti-quenching (Sigma) para montar as seções de tecido manchado. </li></ol> 6. Confocal imagem Realizar imagens com uma Leica TCS SP2 microscópio de varredura confocal a laser Verdadeiro (Leica, Wetzlar, Alemanha) equipado com três lasers (seis linhas disponíveis para a excitação): um laser de argônio-krypton a 488 nm (verde), um laser de 568 nm krypton ( vermelho) e um laser de hélio-neon a 633 nm (azul), que se estendem do visível para o lado vermelho do espectro. Registro de contraste de interferência diferencial (DIC) de imagens para avaliação das organizações não-rotulados arquitetura do tecido. 7. Resultados representante Um exemplo de reconhecimento positivo da ETG por ambos tTG2 e IgA é mostrado na figura. 3A. Consistentes com a situação em pacientes humanos e devido à prevalência muito menor de DH-como a dermatite de CD-like sensibilidade ao glúten também em macacos rhesus, a maioria das amostras de biópsia da pele são esperados para show a reação positiva com anticorpos tTG2 mas sem a presença de IgA + + tTG2 dupla células positivas (Fig. 4). Nestes casos DH-independentes, incluindo os casos de dermatite de origem microbiana, vai revelar alguns single-células positivas + IgA espalhados sob o epitélio, mas não sobreposição espectral entre as tTG2 e IgA-rotulados marcadores (Figs. 3B e 4). Portanto, é importante manter a ordem dos procedimentos de teste sugerido, começando com o exame clínico (Fig. 1), seguido de avaliação histopatológica (Fig. 2) e apenas se não houver dermatite causador da doença, outros agentes mais comuns podem ser identificados, confocal exame de microscopia de biópsias de pele manchada para tTG2 e IgA é garantido. Avaliações clínicas e / ou histopatológico por si só não são suficientes para o diagnóstico positivo desta condição. Nos casos em duplo positivo (tTG2 + IgA +) células são identificadas em torno da área de papilas dérmicas, DH-como o diagnóstico de dermatite pode ser emitido. Em tais casos, retirada do glúten da dietae administração de dieta livre de glúten é recomendado para aliviar os sintomas da dermatite. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Região inguinal de EM96 macaco antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta durante 5 semanas. Reintrodução do glúten da dieta coincidiu com o reaparecimento de dermatite (C). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Coloração HE de EM96 biópsias de pele macaco coletados antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta por nove semanas. A: Epitélio é engrossado (7-15 camadas de células epiteliais), com uma grossa crosta superficial de células hyperkeratotic infiltradas com neutrofilos degenerando. Neutrófilos aparecem também no interior do epitélio e são misturados com números moderada de linfócitos, células plasmáticas e histiócitos em torno do anexos na derme superior. B: Alguns hyperkeratosis ainda está presente, espessura epitelial é normalizada (4-7 camadas) com infiltração mínima linfoplasmocitário na derme superior. C: pele abdominal normal a partir do FR56 macaco, sem infiltração linfoplasmocitário, está incluído para comparação. Ampliação de 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagens de microscopia confocal de EM96 biópsias de pele macaco coletados antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta por nove semanas. A: coloração IgA (verde), tTG2 (vermelho) e ToPro-3 marcador de DNA nuclear (azul). Co-localização de IgA e tTG2 aparece em amarelo ao redor da área de papilas dérmicas. B: amostra de pele tomada após 9 semanas de dieta sem glúten não mostra IgA dentro do epitélio, enquanto alguns IgA subepitelial ainda está presente (verde), tTG2 (vermelho) e ToPro-3 marcador de DNA nuclear (azul). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Tag animais </td><td> Sexo [M / F] </td><td> Idade [Anos] </td><td> Os sintomas clínicos </td><td> Plasma tTG2 anticorpos </td><td> Dieta [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1,3 </td><td> Saudável </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1,4 </td><td> Diarréia, saudável ocasional </td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5,4 </td><td> Diarréia crônica idiopática </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5,0 </td><td> Dermatite crônica </td><td> + / - (Limítrofe) </td><td> 1 e 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4,6 </td><td> Dermatite crônica </td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. TNPRC macacos rhesus utilizado para a coleta de biópsias de pele * A dieta 1 - regular macaco Chow (glúten contendo); Dieta 2 - dieta sem glúten

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nosso recém-criado modelo de primatas não-humanos da sensibilidade ao glúten foi recentemente utilizado para estudar as mudanças da permeabilidade intestinal desencadeada pelo glúten na dieta 5,6. Plasma tTG2 anticorpos, assim como intestinal tTG2 + + depósitos de IgA foram detectados em alguns macacos glúten-sensível. Desde que identificado recentemente incidentes raros de dermatite idiopática em colônia de macacos rhesus, onde nenhuma etiologia (infecciosas / metabólica) usual pôde ser estabelecida, o objet...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo / Código </td><td> Nota </td></tr><tr><td> IgA anti-humana-FITC * </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> F-5259 </td><td> 1:100 diluição de trabalho </td></tr><tr><td> Anti-Human tTG2 </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> MS-300-P1ABX </td><td> 1:100 diluição de trabalho </td></tr><tr><td> Anti-IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> A-21124 </td><td> 1:1.000 diluição de trabalho </td></tr><tr><td> ToPro-3 DNA *** sonda </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> T-3605 </td><td> 1:1.000 diluição de trabalho </td></tr><tr><td> Zinco formalina (Z-fix) </td><td> Anatech Ltd., Battle Creek, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Congelamento outubro Médio </td><td> Sakura Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal Montagem Médio </td><td> Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Quenching Solução </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (Sutura Nylon) </td><td> Ethicon, Johnson &amp; Johnson, Berkshire, Reino Unido </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Soco instrumento de biópsia cutânea </td><td> Miltex, York, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Oster A5 Ouro Clipper Vet Único de velocidade com uma lâmina de tamanho 40 </td><td> Oster Produtos, McMinnville, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Processor Tissue </td><td> Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> Micrótomo rotativo </td><td> Microm International, Waldorf, na Alemanha </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica, Wetzlar, Alemanha </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * Isotiocianato de fluoresceína ** Anticorpo secundário (Alexa Fluor 568-conjugados) usado após tTG2 anticorpo primário ** Dye

reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 anticorpos iga transglutaminase tecidular e em um caso raro de rhesus dermatite

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Transglutaminase tecidular 2 (tTG2) é uma enzima digestiva intestinal que deamidates já parcialmente digeridos da dieta do glúten peptídeos gliadina por exemplo. Em indivíduos geneticamente predispostos, tTG2 desencadeia respostas auto-imunes que se caracterizam pela produção de anticorpos e tTG2 sua deposição direta em 1,2 parede do intestino delgado. A presença de tais anticorpos constitui uma das características principais da doença celíaca (CD). Transglutaminase epidérmica (ETG) é outro membro da família transglutaminase, que também pode funcionar como auto-antígeno em uma pequena minoria de pacientes com DC. Nestes casos relativamente raros, ETG desencadeia uma reação auto-imune (erupção cutânea) clinicamente conhecida como dermatite herpetiforme (DH). Embora o mecanismo exato da patogênese da DH CD e não é bem compreendida, sabe-se que tTG2 e ETG epítopos antigênicos partes que podem ser reconhecidas por anticorpos de soro de pacientes de CD e DH 3,4. (Macaca mulatta) com dermatite (Tabela 1, fig. 1 e 2) foi usado para estudar os tecidos afetados. Em um animal (EM96) uma sobreposição espectral de IgA e tTG2 anticorpos (Fig. 3) foi demonstrada. A presença de duplo-positivos tTG2 + + células IgA foi focada na epiderme profunda, em torno da papila dérmica. Isto é consistente com lesões descritas em pacientes DH 3. Quando EM96 foi colocado em uma dieta livre de glúten, a dermatite, bem como tTG2 + IgA + depósitos desapareceu e já não eram detectáveis ​​(Figs. 1-3). Dermatite reapareceu no entanto, com base na re-introdução do glúten na dieta EM96 (não mostrado). Em macacos, incluindo animais com dermatite independentes, o tTG2 + + depósitos de IgA não foram detectadas. Dieta sem glúten-dependente remissão de dermatite em EM96 juntamente com presença de IgA + + tTG2 células em sua pele sugerem uma auto-imunes, como a DH-mecanismo para o desenvolvimento dessa condição. Este é o primeiro relatório de DH-como a dermatite em qualquer primata não-humano.

Dermatite herpetiforme (DH) é uma condição inflamatória crônica caracterizada por uma reação auto-imune entre IgA e transglutaminase epidérmica (ETG). DH se desenvolve em uma parcela muito pequena dos pacientes glúten-sensíveis e / ou doença celíaca. Os resultados deste estudo indicam que a DH também pode se desenvolver em um hospedeiro macaco rhesus com sintomas da dermatite idiopática.

Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite

A transglutaminase tecidual 2 (tTG2) é uma enzima digestiva intestinal que desamida glúten dietético já parcialmente digerido, por exemplo, peptídeos de gliadina. Em ...

Este artigo em vídeo demonstra um método para visualizar a reação autoimune na pele de Reeses Maccas sensíveis ao glúten com dermatite herpetiforme. Isso é conseguido primeiramente identificando animais com dermatite que não pode ser associada a outras causas mais comumente diagnosticadas, separando esses casos idiopáticos de controles saudáveis pareados por idade. Amostras de pele são obtidas da área afetada para avaliar a arquitetura tecidual, inflamação, bem como a presença de transglutaminase epidérmica.As amostras de autoanticorpos coletadas são fixadas em formol-zinco e hematoxilina a 2% em eosina ou HNE. Em seguida, realiza-se a coloração para avaliar a extensão da inflamação e da histopatologia, e a coloração por imunofluorescência é realizada para avaliar o depósito de autoanticorpos contra transglutaminase epidérmica na epiderme profunda. A dermatite herpetiforme é uma condição inflamatória crônica caracterizada por uma reação autoimune entre a IgA e a transglutaminase epidérmica. A DH se desenvolve em uma pequena parcela de pacientes celíacos sensíveis ao glúten. Os resultados deste estudo indicam que a DH também pode se desenvolver em uma pequena fração de macacos Resus sensíveis ao glúten.Nossos resultados corroboram a validade do modelo Resus Meac recentemente desenvolvido de sensibilidade ao glúten, conforme apresentado. Os resultados mostram que as manifestações clínicas dessa condição não estão restritas apenas ao intestino delgado. Um protocolo típico envolve um animal com dermatite idiopática e um controle saudável pareado por idade.Após anestesia apropriada e preparo do local utilizando técnica estéril, posicione um instrumento de biópsia dérmica com punção de 4,0 milímetros contra a pele do animal aplicando leve pressão. Gire o instrumento 180 graus no sentido horário e anti-horário até que a punção de biópsia atravesse as camadas dérmicas até o tecido subcutâneo. Repita para uma segunda biópsia utilizando pinça.Segure a porção da pele transectada e libere-a do tecido subcutâneo. Coloque a primeira amostra, que será processada para coloração com hematoxilina e eosina, em formol-zinco. Em seguida, coloque a segunda amostra, que será avaliada por microscopia de imunofluorescência, em paraformaldeído a 2%, utilizando uma agulha de corte de três oitavos de círculo com sutura de náilon três traço zero.Feche o defeito cutâneo em padrão cruzado. Repita este processo para obter duas a três amostras de biópsia de cada animal. Administre analgesia pós-operatória conforme descrito em detalhes no protocolo escrito para examinar a presença e localização de IGA e TTG.Inicie incubando as amostras que foram colocadas em formaldeído a 2% por quatro horas à temperatura ambiente para fixá-las após a fixação. Remova o paraformaldeído e lave com PBS por 30 a 60 minutos em uma plataforma agitadora. Repita duas vezes, totalizando três lavagens, depois remova o PBS e substitua por sacarose a 30% por pelo menos quatro horas e até duas semanas.Em seguida, coloque a amostra no meio de congelação OCT e submerja-a em um banho de butano metílico e gelo seco até que o OCT transparente fique branco opaco, indicando que congelou completamente. Em seguida, coloque os blocos a menos 80 graus Celsius por pelo menos 20 minutos. Isso garante que o tecido fique completamente congelado, permitindo que a lâmina o corte sem esmagá-lo.O tecido pode ser armazenado a longo prazo em OCT a menos 80 graus Celsius. Após o corte e a montagem das seções em lâminas, remova o OCT e permeabilize o tecido. Mergulhe as lâminas em um frasco Copeland contendo PBS com 0,2% de gelatina de pele de peixe e 0,1% de Triton X-100.Em seguida, coloque o frasco sobre um agitador durante 20 minutos; após esse período, lave as lâminas por 10 minutos em PBS com 0,2% de gelatina de pele de peixe, e então incube com 10% de soro de cabra normal diluído em PBS com 0,2% de gelatina de pele de peixe por 40 minutos à temperatura ambiente em uma câmara umidificada para lâminas. Incube as lâminas com os anticorpos primários anti resus IGA e TTG separadamente, cada um por uma hora. A seguir, segurando a lâmina pelas bordas, borrife suavemente com P-B-S-F-S-G Triton X 100 utilizando uma pipeta de transferência.Em seguida, coloque-o em um frasco Copeland contendo o mesmo tampão. Depois, coloque o frasco em um agitador durante 10 minutos. Repita a lavagem uma vez.Em seguida, realize uma lavagem com P-B-S-F-S-G por 10 minutos. Incube com anticorpos secundários marcados com Alexa floor, específicos para o isotipo, por 40 minutos após a incubação. Lave a lâmina como anteriormente.Em seguida, adicione a coloração de DNA nuclear ao meio de montagem antidessecante na diluição de 1:2000. Aplique uma gota do meio diretamente sobre cada lâmina. Em seguida, coloque uma lamínula sobre o tecido e selar com esmalte de unha.Coloque a lâmina no escuro e deixe secar. Para visualizar a coloração dupla de IGA e TTG, realize a imagem com um microscópio confocal a laser equipado com os lasers apropriados para os anticorpos secundários utilizados na avaliação do tecido não marcado registrado. Imagens de contraste de interferência diferencial, DIC.DIC é um canal dentro do microscópio que resolve o tecido em uma escala de cinza. Isso torna possível determinar melhor a arquitetura celular para realizar a coloração HNE. A amostra que foi colocada em formol-zinco é primeiro bloqueada em parafina e seccionada sobre lâminas.As lâminas são então incubadas a 60 graus Celsius durante a noite e colocadas em um coloridor automático, que cora as lâminas com HNE quando a coloração estiver concluída. Examine as seções coradas da biópsia em um microscópio óptico equipado com câmera digital usando aumento de Forex e 40 x. Registre três a quatro imagens para cada aumento. Amostras de biópsia de lesões cutâneas de Reuss Maca foram obtidas e coradas conforme descrito neste vídeo para estudar o efeito da retirada de glúten da dieta sobre a dermatite aqui.Região inguinal de um macaco é mostrada antes da retirada da dieta com glúten. Quando este animal foi colocado em uma dieta livre de glúten, a dermatite desapareceu e não pôde mais ser detectada, como pode ser visto aqui. A dermatite reapareceu após a reintrodução do glúten na dieta para avaliação da arquitetura tecidual.A coloração com H e E foi realizada antes da retirada do glúten. O epitélio estava espessado, com sete a 15 camadas de células epiteliais e uma crosta superficial espessa de células hiperqueratósicas infiltradas por neutrófilos em degeneração. Neutrófilos também apareceram no interior do epitélio e se misturaram com quantidades moderadas de linfócitos, plasmócitos e histiócitos ao redor das adnexos na derme superior após nove semanas da retirada do glúten da dieta.Alguma hiperqueratose e epitélio espessado ainda estavam presentes; no entanto, apenas com mínima infiltração linfoplasmocítica na derme superior para comparação. Aqui é mostrada pele abdominal normal, sem espessamento epitelial e sem infiltração linfoplasmocítica na derme superior. Imagens de microscopia confocal das mesmas biópsias de pele de macaco coletadas antes da retirada de glúten da dieta, mostram colocalização de IgA em verde e ttg dois em vermelho, aparecendo em amarelo ao redor da área das papilas dérmicas, indicando a presença de autoanticorpos contra transglutaminase epidérmica.O marcador de DNA nuclear to pro três é mostrado em azul após nove semanas de dieta livre de glúten. A IgA não foi mais observada dentro do epitélio, indicando a ausência de autoanticorpos contra a transglutaminase epidérmica, que seria mostrada em amarelo. Alguma IgA subepitelial, A mostrada em verde, ainda estava presente; o marcador de DNA nuclear to pro três é mostrado em azul em outras Maccas, incluindo um animal com dermatite idiopática não relacionada.Autoanticorpos não foram detectados. A coloração por IGA está em verde, ttg dois em vermelho e o marcador nuclear de DNA para três está em azul. As células positivas para ttg dois estão presentes no interior do epitélio.Algumas células positivas para IgA sob o epitélio. Embora não seja observada sobreposição espectral extensa entre os marcadores vermelho e verde, indicando ausência de autoanticorpos contra a transglutaminase epidérmica. Neste estudo, utilizamos microscopia confocal para visualizar a presença de autoanticorpos IgA contra a transglutaminase epidérmica.Ao tentar o procedimento, é importante lembrar que a maioria dos casos de dermatite não é causada por sensibilidade ao glúten. Portanto, outros métodos, incluindo detecção de anticorpos séricos anti-gliadina, anti-transglutaminase tecidual e avaliação clínica cuidadosa, precisam ser realizados previamente. Apesar disso, a prevalência da dermatite herpetiforme é menor do que a da enteropatia sensível ao glúten apresentada.Os resultados fornecem uma base para pesquisas futuras, assumindo que animais adicionais com esta condição sejam identificados.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

No modelo animal descrito no nosso trabalho, purificou anticorpos IgG contra uma extensão de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colagénio VII são injectados repetidamente em ratinhos que reproduzem o fenótipo empolar, bem como a histo-e imunopatológicas características de humano epidermólise bolhosa adquirida...

Granulócitos-dependente Blistering pele induzida por auto-anticorpos

Aqui nós descrevemos dois ensaios para medir a ativação do complemento induzida por anticorpos contra células vermelhas do sangue. A vantagem principal sobre os ensaios actuais é a sua natureza quantitativa e fácil de interpretar.

Métodos para a detecção quantitativa de anticorpos induzida pela ativação do complemento no Glóbulos Vermelhos

O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

Aqui, apresentamos os métodos para detectar autoanticorpos ilhota humana utilizando ensaios de eletroquimioluminescência (ECL). O protocolo, usado para prever o tipo 1 diabetes, pode ser expandido em cima para detectar autoanticorpos para outras doenças auto-imunes.

Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Este trabalho apresenta um protocolo para a detecção de imunoglobulina soro específico E com um sistema de cartucho-baseado da quimioluminescência microfluídicos e a avaliação de sua utilidade no diagnóstico de alergia.

Aplicação da tecnologia de Microfluidic Biochip para detectar soro alérgeno-específicas E de imunoglobulina (sIgE)

Apresentado aqui é um protocolo para a separação da epiderme da derme para avaliar a produção de mediadores inflamatórios. Após a inflamação, a epiderme da pata traseira de rato é separada da derme por termolysina a 4 °C.  A epiderme é então usada para análise de mRNA por RT-PCR e avaliação de proteínas por mancha ocidental e imunohistoquímica.

Separação de Epiderme de Rato e Derme com Termolise para Detectar mRNA inflamatório específico do local e proteína

Este protocolo usa peptídeos mistos G6PI para construir modelos de artrite reumatoide que estão mais próximos do da artrite reumatoide humana em células CD4+ T e citocinas. Células T assassinas naturais invariantes de alta pureza (principalmente iNKT2) com fenótipos e funções específicas foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro para imunoterapia adotiva.

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

Modelamos um ensaio de ECL multiplexado simples que combina 7 ensaios de autoanticorpos juntos. O ensaio é capaz de rastrear DM1 e várias outras doenças autoimunes, simultaneamente, incluindo doença celíaca, doença tireoidiana autoimune e síndrome poliglandular autoimune 1.

Um ensaio de eletroquimioluminescência de alto rendimento 7-plex rastreando simultaneamente diabetes tipo 1 e múltiplas doenças autoimunes

Este protocolo descreve um método simples para cultivar epiderme humana reconstituída tridimensional de forma reprodutível e robusta. Além disso, caracteriza a relação estrutura-função do modelo de barreira epidérmica. Também são apresentadas as respostas biológicas da epiderme humana reconstituída sobre estímulos proinflamatórios.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

As lesões cutâneas são características comuns e importantes em muitas doenças reumáticas, e a biópsia com análise patológica desempenha um papel crítico no diagnóstico. Este artigo fornece uma visão geral detalhada do procedimento padronizado de biópsia de pele e, usando o lúpus eritematoso discóide como exemplo, destaca o papel essencial da dermatopatologia no diagnóstico de doenças reumáticas.

Biópsia de pele para diagnóstico de lúpus eritematoso discóide

Aprenda a visualizar a reação autoimune na pele de macacos Rhesus com dermatite herpetiforme usando imunofluorescência e microscopia confocal. Este método ajuda pesquisadores a estudar mecanismos autoimunes em modelos animais.

Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite (Vídeo) | JoVE Journal

Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite

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