Name: Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a empacotar vetores lentivirais para entrega de genes em células mamíferas usando partículas pseudotipadas VSV-G. Este protocolo de cinco dias produz vírus de alto título para transdução eficiente.

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Nós gostaríamos de agradecer a equipe e cientistas SBI para o seu apoio no desenvolvimento e testes destes protocolos.

1. Transfecção de células 293TN com plasmídeos de empacotamento e a construção de expressão <ol><li> Semente 7,0-8,0 x 10 6 293TN células por placa de cultura de 15 centímetros 2 em 20 ml de meio de cultura contendo meio DMEM suplementado com 4 mM L-glutamina, 4,5 g de glicose / l, e soro fetal de bovino (10%) sem antibióticos. Crescer durante 18-24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2, de modo que a densidade celular alcança 60-80% de confluência no momento da transfecção. Em alguns casos, pode ser necessário para placas de semente várias das células para se obter um título suficientemente elevado para a transdução de células alvo. </li><li> Para cada placa de células, adicionar 1,6 ml de DMEM isento de soro para um tubo de 2 ml autoclavado Eppendorff. Adicionar 45 mg pPACKH1 ou pPACKF1 e 4,5 ul de seu lentivector construir o DMEM e misture pipetando para cima e para baixo. </li><li> Adicionar 55 ul de PureFection no mesmo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar a DMEM-PureFection Plasmid-mistura em temperatura ambiente fou 15 min. </li><li> Adicione o DMEM-PureFection Plasmid-mistura para a placa de cultura de tecido, gota a gota e agite cuidadosamente para dispersar uniformemente em todo o prato. Retornar o prato para a incubadora e crescer a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Não há necessidade de alterar o suporte após a transfecção. Se a sua construção lentivector expressa um gene que codifica uma proteína fluorescente como GFP, verificar as suas células sob um microscópio de 12-24 horas após a transfecção. Deverá ser capaz de ver&gt; células 90% GFP-positiva, indicando que a transfecção foi bem sucedida. </li><li> Recolher o sobrenadante da cultura celular após 48 e 72 horas em um tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante da cultura celular agora contém partículas infecciosas pseudoviral. (Seguir as orientações recomendadas para trabalhar com NBS-2 classe de segurança.) Centrifugar a 1.500 xg durante 15 min à temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante viral para um novo tubo, assegurando para não perturbar o sedimento. </li><li> Células 293TN que têm sido utilizados para a embalagem viral devem ser eliminados de um recipiente de risco biológico e não são para ser utilizado para outras rondas de embalagem viral. </li></ol> 2. Concentração do sobrenadante viral <ol><li> Adicionar 1 volume de frio (4 ° C) de PEG-se da solução de precipitação de vírus a cada 4 volumes de sobrenadante de partícula contendo lentiviral. Precipitação de partículas lentivirais de grandes volumes pode ser conseguido com Corning 250 ml tubos de centrífuga de polipropileno. Misturar a solução por vezes invertendo os vários tubos, mas não vórtice da mistura. </li><li> A solução no frigorífico a 4 ° C durante pelo menos 12 horas (até 4 dias é aceitável). Não agitar ou girar os tubos durante a etapa de refrigeração. </li><li> Centrifugar a mistura / PEG-se o sobrenadante a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Após centrifugação, as partículas lentivirais aparecerá como um bege ou pelete branco no fundo do tubo. Despeje a supernatant. </li><li> Remova todos os vestígios de fluidos por aspiração, tomando cuidado para não perturbar as partículas precipitadas lentivirais no sedimento. Vestígios de residual de PEG-vai diluir o vírus (reduzindo assim a titulação), mas não vai afectar a integridade das células alvo desde PEG-é inerte e não tóxico. </li><li> Ressuspender e combinar as partículas lentivirais em 1/100 do volume original usando frio (4 ° C), fosfato estéril ou solução salina tamponada com DMEM contendo 25 mM de tampão HEPES. </li><li> Alíquota em frascos estéreis criogénicos e armazenar a -70 ° C até estar pronto para utilização. </li></ol> 3. A titulação viral e Transdução de células-alvo <ol><li> Sugerimos titulação das partículas de lentivirais antes transduzir células alvo de interesse e calculando a multiplicidade apropriado de infecção (MOI) para as células-alvo para a consistência entre experiências. Para titulação viral, recomendamos o uso de células HT1080 como uma linha de controle fácil de infectar positivo. Plfacilidade notar que o protocolo de titulação envolve transduzir células HT1080 com uma pequena alíquota das partículas lentivirais tiver embalados. Uma vez que o título é conhecido, as células-alvo de interesse também podem ser transduzidas com as partículas produzidas lentivirais. Um protocolo de titulação recomendo pode ser encontrado em: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Placa de 50.000 células-alvo de interesse por poço numa placa de 24 poços em meios de cultura de células. Utilize os meios de comunicação que as células são normalmente cultivadas dentro crescer as células durante a noite em suas condições de cultura especificadas. Células deve ser entre 50 a 70% confluentes no dia da transdução. </li><li> No dia da transdução, aspirar os meios de comunicação das células. Combinar meio de cultura com TransDux a uma concentração final de 1 x (por exemplo, 2,5 TransDux uL a 500 uL de meio de cultura). Em seguida, transferir o TransDux-cemistura médio ll cultura a cada poço. </li><li> Pipetar o volume apropriado de vírus que corresponde ao óptimo MOI para as células-alvo em cada poço. Se o MOI óptima é desconhecida, é recomendável tentar uma gama de MOIs diferentes (tal como um MOI de 1, 2 e 5, para fácil de infectar as células de cultura de tecidos, e uma MOI de 1, 10 e 20 para mais difícil -infectar as células primárias). Se a concentração das partículas lentivirais não é conhecido (tal como determinado através de um protocolo de titulação do vírus), diferentes volumes de vírus pode ser tentado, tal como 1, 2 e 5 ul de vírus. O vírus pode permanecer em contacto com as células-alvo por até 72 horas. </li><li> Outras experiências com a células transduzidas de interesse-alvo pode ser iniciado 72 horas após a transdução, uma vez que o construto viral tem integrado no genoma da célula hospedeira. Alterar a médio e passagem a células alvo de interesse de acordo com suas necessidades específicas. </li></ol> 4. Os resultados representativos <pclass transfec de c> A densidade de partida das células 293TN é crítica para a embalagem viral bem sucedida. Células 293TN deve estar entre 60 -80% confluentes no dia da transfecção (Figura 2). Se as células 293TN são menos do que 60% confluentes, permitir-lhes a crescer durante mais algumas horas antes de se tentar a transfecção. Se as células são 293TN&gt; confluente a 80%, eles devem ser replated antes da transfecção. Se usando um GFP lentivector expressando, pelo menos 90% das células 293TN deve fluorescência verde 24 horas após a transfecção, indicando uma transfecção bem sucedida (Figura 3). Se menos de 90% das células são GFP-positiva, não se prosseguir para o passo seguinte, porque isso indica que a transfecção não foi bem sucedida, e os títulos virais será baixa. Em vez disso, placas novas células 293TN e começar de novo, certificando-se que as células 293TN estão na densidade celular adequada antes da transfecção. Células 293TN podem retirar as placas de cultura de tecidos de 48-72 horas após a transfecção. Isso não afeta negativamente a produção de partículas lentivirais. Titulação com células HT1080 Os títulos virais pode ser calculada usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida de acordo com as instruções do fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir a integração virai da sequência WPRE a partir do vector lentiviral em células HT1080 e compara esta com uma curva padrão, com base numa sequência de referência genómico para medir com precisão unidades infecciosas por ml (Figura 4). Transdução de células alvo Se o uso de partículas lentivirais que expressam um marcador GFP constitutivamente activa, células GFP positivas devem começam a aparecer dentro de 12-24 horas de transdução, se a reacção de transdução está a funcionar. Expressão GFP deve continuar após a construção lentiviral estavelmente integra-se tele hospedar genoma da célula. Se transdução com MOIs diferentes, a fluorescência da GFP deve coincidir com a aproximadamente MOI, em que MOI baixas mostram fluorescência menos GFP e MOIs superiores mostram aumento GFP de fluorescência (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 1"> Figura 1. Visão geral do protocolo de produção viral. Os plasmídeos de empacotamento lentivector e PPACK são misturados e co-transfectados em células 293TN. Depois de 48 -72 horas, o sobrenadante viral é recolhido, e partículas virais são precipitadas com PEG-lo. Após titulação das partículas de lentivirais, eles podem ser usados ​​para transduzir células-alvo de interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 2. Imagem de contraste de fase das células 293TN. Densit celulary deverá estar entre 60-80% confluentes no dia da transfecção. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 3"> Figura 3. Imagem fluorescente de células GFP positivas 293TN 24 horas após a transfecção com Purefection, pPACKH1, e uma codificação de GFP lentivector construto. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 4"> Figura 4. Resultados qPCR WPRE e curva padrão obtida usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida para calcular MOI e titulação correspondente de embalados partículas virais. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 5"> Figura 5. Imagens fluorescentes das células HT1080 transduzidas com quantidades crescentes de lentivírus. As imagens são de 72 horas pós-transdução. </pclass>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNA+Viruses.+A+Practical+Approach%22">RNA Viruses. A Practical Approach</a>. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).</li>
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<li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfer%2C+integration%2C+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li>
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</ol>

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Esta embalagem viral e transdução de protocolo de células-alvo foi otimizado para uso com reagentes virais SBI da embalagem. A substituição de outros reagentes podem afectar o resultado do protocolo. Este protocolo só foi optimizado para a produção de lentiviral e pode não ser adequado para produzir outros tipos de vírus ou pseudoviruses. Embalagem viral de sucesso é dependente de vários passos-chave. As células 293TN expressar o antigénio T de SV40 grande, o que é absolutamente necessário para a secreção das partículas lentivirais para o sobrenadante da cultura celular. A densidade a qual as células são 293TN no momento da transfecção é especialmente importante para que o reagente PureFection para transferir o suficientemente lentivector e plasmídeos de embalagem para as células. Adicionando-se a mistura PureFection à placa de cultura de tecido de uma maneira gota a gota, seguido por agitação completamente a placa é importante para a dispersão dos plasmídeos de empacotamentoe lentivector construir longo de todas as células. A falta de apropriadamente distribuir os vectores podem resultar em partículas insuficientes lentivirais sendo produzidos. A reacção de embalagem viral pode ser dimensionada para cima para a produção de vírus de título elevado, com base na área de superfície das placas de cultura de tecidos. Pode-se escolher a placa pratos de tecido de cultura de várias células 293TN por construção que tem de ser embalado. Concentração dos sobrenadantes virais é especialmente útil na criação de alta título de vírus. Sobrenadante viral a partir de placas múltiplas de células podem ser combinadas e concentradas para utilização em experiências in vivo, ou para as células que são difíceis de transduzir. Titulação das partículas produzidas lentivirais é importante para o cálculo preciso uma MOI para usar para a transdução de células alvo. Conhecendo o MOI que foi usado na transdução de uma dada permite solução de problemas no caso em que a transdução não é bem sucedido. Por exemplo, usando uma MOI que édemasiado baixa pode resultar em células alvo que expressam muito poucos o constructo de interesse. Usando uma MOI que é demasiado elevado, no entanto, pode resultar em células alvo que mostram sinais de stress. O objectivo é usar uma MOI que maximiza a expressão do construto de interesse, preservando a saúde das células. Embora recomendamos um protocolo de titulação qPCR baseado que mede cópias integradas do construto lentiviral em células HT1080, as abordagens titulação outros podem também ser utilizados, tais como ELISA p24 ou estimativa da percentagem de células positivas para GFP. Transdução de sucesso das células-alvo também depende vários fatores importantes. TransDux é um reagente de infecção único que permite eficiências de transdução elevados, mas que não é tóxico para as células. TransDux pode ser usado em vez de polibreno, que é frequentemente tóxicos para as células-alvo. A inclusão de TransDux na transdução das células alvo ajuda a neutralizar cargas sobre as partículas virais e permite que o vírus na células. Uma vez que TransDux não é tóxico para as células, pode-se permitir que as partículas lentivirais a permanecer em contacto com as células durante até 72 horas (o tempo em que as construções virais foram integrados no genoma da célula hospedeira), aumentando assim a probabilidade de o partículas virais de entrar na célula. Para algumas células de difícil transduzir, transduções pode ser repetido em dias sucessivos para aumentar a eficiência de transdução. Por exemplo, transduzir as células no dia 1, permitir que as células para descansar no dia 2 e, em seguida transduzir as células novamente no dia 3. É importante que esperar 72 horas após a transdução última antes da selecção início, experiências adicionais ou caracterização das células alvo. Embalagem viral eficiente é também dependente do tamanho do construto lentiviral, entre a 5 &#39;e as regiões LTR 3&#39;. Esta secção do construto lentiviral deve ser de aproximadamente 9 kb ou menos, o que corresponde ao tamanho do genoma do HIV nativo. Superior a 9 de maio de kbtítulo vinque o das partículas produzidas pseudoviral. A nova tecnologia, tais como vectores piggyBac transposão, permitir a integração, fiável estável de transgenes até 100 kb, através de uma transfecção único. Esta abordagem pode ser utilizada para construções que excedem o limite de tamanho para lentivirais, nos casos em que é possível transfectar células alvo, e proporciona a vantagem adicional de não necessitar de um passo de embalagem viral 9,10. As partículas pseudoviral produzidos utilizando este protocolo são infecciosas em que eles podem infectar os tipos de células mais de mamíferos. Os produtos utilizados neste protocolo, no entanto, são de terceira geração Biosafe em que eles produzem não-replicativa e auto-inativadoras pseudoviruses. Portanto, uma vez em células alvo transduzidas ou animais, as células alvo ou animais não são infecciosas ou contagiosas. A substituição de outros plasmídeos lentivector que não são de terceira geração Biosafe é possível, embora não recomendado a partir de um biossegurançaperspectiva. O protocolo de produção viral e subseqüente de transdução de células alvo deve ser realizada sob o Nível de Biossegurança 2, de acordo com as diretrizes do NIH 11, e os pesquisadores devem sempre usar um jaleco e luvas ao manusear as partículas virais. Utilizadas células produtoras 293TN, tubos de partículas virais, e pipetas descartáveis ​​devem ser eliminados em um recipiente adequado de risco biológico. Pipetas de vidro reutilizáveis ​​e devem ser descontaminados com água sanitária e autoclave para diminuir a exposição do pessoal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Meio DMEM glucose elevada </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> Células 293TN </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> Para o HIV baseados lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> Para FIV baseados lentivectors </td></tr><tr><td> Qualquer vetor shRNA </td><td> SBI </td><td> Vário </td><td> cDNA, Plasmideo, microRNA, repórteres de transcrição </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-lo </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kit titulação global ultra-rápido </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Não descrito neste protocolo, mas necessário para título as partículas virais </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

embalagem hiv-fiv ou à base de construções de expressão e lentivector transdução de partículas pseudotyped vsv-g virais

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Tal como com vectores plasmídicos padrão, é possível para transfectar lentivectors em forma de plasmídeo em células com baixo a médio eficiência para obter a expressão transiente de efectores. Construções de embalagem lentivirais expressão em partículas pseudoviral, contudo, permite-se a transdução de 100%, mesmo com difícil de transfectar células, tais como caule, primário, e as células diferenciadas. Além disso, a entrega lentiviral não produz as respostas celulares específicas tipicamente associados com transfecções químicos, tais como a morte celular resultante da toxicidade do reagente de transfecção 1, 2. Quando transduzida em células alvo, o construto lentiviral integra no DNA genómico e fornece a expressão estável do pequeno hairpin RNA (shRNA), microRNA, ADNc ou gene repórter 3, 4. As células alvo de forma estável que expressam a molécula efectora pode ser isolado usando um marcador seleccionável contido no vector de expressão, tais como construir puromicina ou GFP. Depois pspartículas eudoviral infectar as células-alvo, eles não podem replicar dentro das células alvo, porque os genes virais estruturais estão ausentes e as repetições terminais longas (LTR) são concebidos para ser auto-inactivação após transdução 5, 6. Existem três componentes principais que são necessárias para a embalagem lentiviral eficiente 1, 5, 6, 7. <ol><li> O vector de expressão que contém lentiviral alguns dos elementos genéticos necessários para a embalagem, a integração estável do expressão viral construir no ADN genómico, e expressão do efectora ou repórter. </li><li> Os plasmídeos de empacotamento lentivirais que fornecem as proteínas essenciais para a transcrição e embalagem de uma cópia de RNA da construção de expressão em partículas recombinantes pseudoviral. Este protocolo utiliza a plasmídeos PPACK (SBI) que codificam para gag, pol e rev a partir do genoma do HIV ou FIV e Virus da Estomatite Vesicular g de proteína (VSV-G) para a proteína de revestimento virai. </li><li> 293TN produzir<html> células r (derivado de células HEK293) que expressam o antigénio T de SV40 grande, o que é necessário para a produção de título elevado lentiviral e um gene de resistência à neomicina, útil para reselecting as células para a manutenção. </li></ol> Uma visão geral do protocolo de produção virai pode ser visto na Figura 1. Produção virai começa por co-transfecção de células produtoras 293TN com o vector de expressão lentiviral e os plasmídeos de empacotamento. As partículas virais são secretados na mídia. Depois de 48-72 horas os meios de cultura de células é colhida. Detritos celulares é removido dos meios de cultura de células, e as partículas virais são precipitadas por centrifugação com PEG-lo para a concentração. Produzidos partículas lentivirais são então titulado e pode ser usado para transduzir células alvo. Detalhes da titulação viral não estão incluídos neste protocolo, mas pode ser encontrado em: ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Este protocolo foi optimizado usando os produtos específicos indicados. Outros reagentes podem ser substituídos, mas os mesmos resultados não pode ser garantida.

Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

Assim como ocorre com os vetores plasmídicos padrão, é possível transfectar lentivetores em forma de plasmídeo em células com eficiência baixa a média para obter a expressão transitória...

O objetivo geral deste procedimento é aprender sobre o empacotamento de lentivírus. Um protocolo de cinco dias. No primeiro dia, as células produtoras 293TN são semeadas em uma densidade calculada.No segundo dia, as células são transfectadas com o construto do vetor lenti de escolha, contendo o gene de interesse, e com a mistura de plasmídeos de empacotamento viral. No quarto dia, o sobrenadante viral é coletado e concentrado pela adição da solução de precipitação viral com PEG. Os passos finais do procedimento consistem em colher o vírus concentrado com PEG, alíquotar o vírus e infectar células com o vírus concentrado para titulação viral.Por fim, a PCR quantitativa de genes estavelmente integrados é utilizada para calcular o número de construtos integrados de forma estável. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como transfeção plasmidial ou transdução retroviral, é que o protocolo otimizado de empacotamento de lentivírus do FBI produz vírus funcionalmente ativos com alto título, o que permite uma entrega eficiente em quase qualquer célula de mamífero, incluindo células difíceis de transfectar, como células-tronco e células primárias não divididas. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque não estão familiarizados com os pequenos detalhes do protocolo, que são essenciais para a produção bem-sucedida de vírus com alto título.A demonstração visual deste método é útil, pois a densidade celular visualizada ao microscópio durante a transfeção determina a eficiência do empacotamento viral, o que por sua vez determina o título viral final. Em casos nos quais a expressão de um repórter fluorescente aplicável determina a eficiência da transfeção, isso tem um impacto significativo no título viral final. Além disso, a demonstração visual deste método auxilia os pesquisadores a se familiarizarem com partes sutis, porém importantes, do protocolo, como as melhores práticas para manter a esterilidade durante todo o processo e como evitar incluir detritos celulares no vírus colhido.O empacotamento eficiente de lentivírus depende de três componentes. Primeiro, o vetor de expressão lentiviral deve conter alguns dos elementos necessários para o empacotamento do vírus e integração estável, bem como elementos para a expressão do gene de interesse, como um cabelo curto, RNA, microRNA ou um cassete repórter.Em segundo lugar, os plasmídeos de empacotamento lentiviral devem fornecer as proteínas essenciais para o empacotamento de uma cópia de RNA do construto de expressão em partículas virais pseudotípicas recombinantes e para a transcrição reversa subsequente e integração viral após infecção. Em terceiro lugar, as células produtoras 293TN devem ser cotransfectadas temporariamente com os vetores de expressão e de empacotamento. Essas células produzem partículas virais pseudotípicas em altos títulos, que podem ser coletadas do meio de cultura.No fim das contas, a transdução bem-sucedida das células-alvo depende principalmente do número de partículas virais por célula para um determinado tipo celular. Em outras palavras, a multiplicidade de infecção começa cultivando células 293TN em placas de cultura celular de 15 centímetros por 18 a 24 horas para obter uma confluência de 60 a 80%.No momento da transfeção, cada placa renderá aproximadamente 14 milhões de células para aumentar o rendimento do vírus. Mais de uma placa pode ser usada no dia seguinte, quando as células 2 9 3 TN estiverem com 60 a 80% de confluência, estando prontas para transfeção. Para cada placa de células, adicione 1,6 mililitros de DMEM sem soro a um tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, adicione 22,5 microgramas de ppac H um ou Ppac F1 e 4,5 microgramas do seu vetor lenti Construto ao DMEM e misture pipetando para cima e para baixo. A seguir, adicione 55 microlitros de pure affection ao mesmo tubo e vortexie por 10 segundos, seguido por uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente. Após 15 minutos, adicione um tubo a cada placa de cultura.Adicione gota a gota e gire suavemente a placa, depois incube as células por 48 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono após 48 horas. Se o vetor lentiviral expressar um gene fluorescente como GFP, examine as células ao microscópio; uma transfeção bem-sucedida resultará em 50 a mais de 90% das células verdes fluorescentes. Agora, colete o sobrenadante do cultivo celular em um tubo cônico de 50 mililitros. O sobrenadante contém as partículas pseudovirais infecciosas.Quaisquer células destacadas da placa não afetarão negativamente a produção do vírus. Para remover os detritos, centrifugue o sobrenatante viral a 1500 G durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, sem perturbar o pellet, colete o sobrenatante viral, certificando-se de deixar um volume tampão de cerca de 500 microlitros de sobrenatante, e prossiga para a próxima etapa, que consiste em concentrar as partículas virais 72 horas após a transfeção.Uma segunda coleta opcional do sobrenatante viral pode ser realizada usando a mesma técnica após a coleta do estado viral. Concentre adicionando um volume de solução de precipitação de vírus com PEG gelado a cada quatro volumes de sobrenatante em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Inverta a solução para misturá-la.Nunca utilize um v&oacute;rtex e, em seguida, armazene a solu&ccedil;&atilde;o sem agita&ccedil;&atilde;o a quatro graus Celsius por at&eacute; 96 horas. Ap&oacute;s um m&iacute;nimo de 12 horas de refrigera&ccedil;&atilde;o, centrifugue a mistura a 1500 &times;g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Ap&oacute;s a centrifuga&ccedil;&atilde;o, as part&iacute;culas lentivirais precipitadas com peggo aparecer&atilde;o como um precipitado bege ou branco no fundo do tubo.Agora, remova todos os vestígios de fluido por aspiração cuidadosa, sem perturbar as partículas lentivirais precipitadas no pellet. Alternativamente, remova a maior parte do sobrenadante e ressuspenda o pellet no sobrenadante remanescente. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo eppendorf estéril de dois mililitros e centrifugue o tubo em uma microcentrífuga fria por dois minutos.A 14.000 RPM, pipete o sobrenatante remanescente e re-suspenda o pellet de partículas lentivirais em gelo, em tampão estéril e frio, em um volume entre um décimo e um centésimo do volume original. Pipete cuidadosamente o pellet para a solução sem formar bolhas, mantendo-o sempre frio. Certifique-se de que o pellet foi completamente re-suspenso.Por fim, faça alíquotas de 15 a 25 microlitros da tinta em frascos criogênicos estéreis sobre gelo e armazene os frascos a menos 70 graus Celsius. Um ensaio de embalagem bem-sucedido produzirá de 10 milhões a 1000 milhões de UI por mililitro para transdução viral em uma placa de cultura de 24 poços, com 50.000 células por poço, e cultive-as durante a noite nas condições de cultura especificadas. As células devem apresentar confluência entre 50 a 70% para a transdução com fins de titulação.Células HT 10 80 podem ser usadas como uma linhagem celular controle de fácil transdução; no dia seguinte, aspire o meio das células. Em seguida, combine o meio de cultura com a solução concentrada de transdução. Assim, a concentração final de transdução é de um x; adicione meio mililitro da solução transduzida a cada poço com células-alvo na densidade correta de 50 a 70% de confluência. Adicione o vírus a cada poço nas seguintes diluições: um para 100, um para 10 e diluição direta um para um.O vírus pode permanecer em contato com as células-alvo por até 72 horas sem trocar o meio. Após 72 horas, o próvirus terá integrado de forma estável ao genoma do hospedeiro e estará expressando o gene de interesse. Se houver expressão de marcador fluorescente, ela poderá ser utilizada para estimar a eficiência de transdução com diferentes diluições do vírus; em seguida, o número de unidades infecciosas pode ser quantificado por QPCR.Uma vez conhecido o título viral, calcule o volume apropriado de vírus para atingir a multiplicidade de infecção desejada para outras células-alvo. A medição do título e o controle da MOI garantem a consistência entre experimentos e diferentes preparações virais. O vírus está agora pronto para ser utilizado em experimentos adicionais.A densidade inicial das células 2 9 3 TN foi crítica para o empacotamento viral bem-sucedido no dia da transfeção. Essas células 2 9 3 TN estavam entre 60 e 80% confluentes. Vinte e quatro horas após uma transfeção bem-sucedida com um vetor lentiviral que expressa GFP, verificou-se que pelo menos 90% das células 2 9 3 TN exibiam fluorescência verde.72 horas após a transdução, a GFP continuou a ser expressa nas células hospedeiras HT 10 80. Isso indica que o construto lentiviral integrou-se de forma estável ao genoma do hospedeiro, e a transdução das mesmas células hospedeiras em uma diluição dez vezes menor reduziu proporcionalmente a expressão de GFP. Porque a relação entre título viral e expressão gênica mediada por lentivírus é diretamente proporcional.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada ao longo de cinco dias, com cerca de uma a duas horas por dia, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como embalar partículas virais infecciosas funcionalmente de maneira eficiente e segura, além de transduzir células com o vírus com sucesso. Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser perigoso e de que precauções, como trabalhar em uma capela de cultura de tecidos BSL 2, devem ser tomadas.Usar jaleco e luvas deve sempre ser adotado ao realizar este procedimento.

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

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Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

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