Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

O objetivo geral deste procedimento é aprender sobre o empacotamento lentiviral. Um protocolo de cinco dias. No primeiro dia, 2 9 3, as células produtoras de TN são plaqueadas em uma densidade calculada.

No segundo dia, as células são transfectadas com a construção do vetor lenti de escolha contendo o gene de interesse e a mistura de plasmídeo de empacotamento viral. No quarto dia, o estado viral é colhido e concentrado pela adição da solução de precipitação do vírus PEG. As etapas finais do procedimento são colher o vírus concentrado PEG, alíquota do vírus e infectar as células com o vírus concentrado para titulação viral.

Em última análise, a PCR quantitativa de genes integrados de forma estável é usada para calcular o número de construções integradas estáveis. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como transfecção de plasma ou transdução retroviral, é que o protocolo otimizado de empacotamento de lentivírus do FBI produz vírus funcionalmente ativos de alto título, o que permite a entrega eficiente em quase todas as células de mamíferos, incluindo células difíceis de transfectar, como células-tronco e células primárias não divididas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não estão familiarizados com os pequenos detalhes do protocolo, que são essenciais para a produção bem-sucedida de vírus de alto título.

A demonstração visual deste método é útil, pois a densidade celular visualizada através de um microscópio durante a transfecção determina a eficiência do empacotamento viral, que determina o título viral final. Nos casos em que aplicável, a expressão do repórter fluorescente determina a eficiência da transfecção, o que tem um impacto significativo no título viral final. Além disso, a demonstração visual desse método é útil para os pesquisadores se familiarizarem com partes sutis, mas importantes, do protocolo, como as melhores práticas para manter a esterilidade durante todo o processo e como evitar a inclusão de detritos celulares no vírus colhido.

A embalagem lentiviral eficiente depende de três componentes. Primeiro, o vetor de expressão lentiviral deve conter alguns dos elementos necessários para o empacotamento do vírus e integração estável, bem como elementos para a expressão do gene de interesse. Grampo de cabelo curto, RNA, micro RNA ou uma fita de repórter.

Em segundo lugar, os plasmídeos de empacotamento lentiviral devem fornecer as proteínas essenciais para empacotar uma cópia de RNA da construção de expressão em partículas pseudovirais recombinantes e subsequente transcrição reversa e integração do vírus após a infecção. Em terceiro lugar, 2 9 3 células produtoras de TN devem ser seccionadas transitoriamente com os vetores de expressão e embalagem. Essas células produzem partículas pseudovirais de altos títulos para serem colhidas dos meios de cultura.

Em última análise, a transdução bem-sucedida das células-alvo depende principalmente do número de partículas virais por célula para um determinado tipo de célula. Em outras palavras, a multiplicidade de infecções começa com o crescimento de 2 9 3 células TN. Em placas de cultura de células de 15 centímetros por 18 a 24 horas para obter 60 a 80%co fluência.

No momento da transfecção, cada placa produzirá aproximadamente 14 milhões de células para aumentar o rendimento do vírus. Mais de uma placa pode ser usada no dia seguinte, quando as 2 9 3 células TN são 60 a 80% confluentes, elas estão prontas para a transfecção. Para cada placa de células, adicione 1,6 mililitros de DMEM livre de soro a um tubo de falcão de 15 mililitros.

Em seguida, adicione 22,5 microgramas de ppac H one ou Ppac F1 e 4,5 microgramas de seu vetor lenti Construct ao DMEM e misture pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicione 55 microlitros de afeto puro no mesmo tubo e vórtice por 10 segundos, seguido por uma incubação em temperatura ambiente de 15 minutos. Após 15 minutos, adicione um tubo em cada placa de cultura.

Em seguida, gire suavemente a placa e incube as células por 48 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono após 48 horas. Se a construção do vetor lenti expressa um gene fluorescente como GFP, verifique as células ao microscópio, uma transfecção bem-sucedida produzirá 50 a mais de 90% de células fluorescentes verdes agora coletam o sobrenadante da cultura de células em um tubo cônico de 50 mililitros. O sobrenadante contém as partículas pseudovirais infecciosas.

Quaisquer células retiradas da placa não afetarão negativamente a produção de vírus. Para remover a centrífuga de detritos, o sobrenadante viral a 1500 G por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, sem perturbar o pellet, colete o sobrenadante viral certificando-se de deixar um tampão de cerca de 500 microlitros de sobrenadante e prossiga para a próxima etapa, que é concentrar as partículas virais 72 horas após a transfecção.

Uma segunda coleta opcional do supernat viral pode ser feita usando a mesma técnica após a coleta do estado viral. Concentrado pela adição de um volume de solução de precipitação do vírus do peg gelado a cada quatro volumes de sobrenadante em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Inverta a solução para misturá-la.

Nunca use um vórtice e armazene a solução sem agitação a quatro graus Celsius por até 96 horas. Após um mínimo de 12 horas de refrigeração, centrifugue a mistura a 1500 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, as partículas lentivirais precipitadas peggo aparecerão como um pellet bege ou branco no fundo do tubo.

Agora, remova todos os vestígios de fluido por aspiração cuidadosa sem perturbar as partículas lentivirais precipitadas no pellet. Alternativamente, remova a maior parte da supranatin e ressuspenda o pellet em supino restante. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo einor estéril de dois mililitros e centrifugue o tubo em uma microfuga fria por dois minutos.

A 14 000 RPM, pipetar o sobrenadante restante e ressuspender o sedimento de partículas lentivirais em tampão gelo, frio e estéril a um 10.º a um 100.º. O volume original pipeta cuidadosamente o pellet em solução sem criar bolhas, mantendo-o frio o tempo todo. Certifique-se de que o pellet esteja completamente ressuspenso.

Por fim, faça alíquotas de 15 a 25 microlitros de tinta, frascos criogênicos estéreis no gelo e armazene os frascos a 70 graus Celsius negativos. Uma execução de embalagem bem-sucedida renderá de 10 milhões a 1000 milhões de IFUs por mililitro para transdução de vírus em uma placa de placa de cultura de 24 poços, 50.000 células por poço e cultivá-las durante a noite em suas condições de cultura especificadas. As células devem estar entre 50 e 70% confluentes para transdução para fins de titulação.

HT 10 80 células podem ser usadas como uma linha celular de controle fácil de transduzir no dia seguinte aspirar os meios das células. Em seguida, combine o meio de cultura com uma solução concentrada de pato. Portanto, a concentração final de patos trans é um x, adicione meio mililitro do transduzido a cada poço com células-alvo na densidade correta de 50 a 70% de fluência de Co, adicione vírus a cada poço nas seguintes diluições, um a 100, um a 10 e diluição direta de um para um.

O vírus pode permanecer em contato com as células-alvo por até 72 horas sem alterar o meio. Após 72 horas, o provírus terá se integrado de forma estável ao genoma do hospedeiro e estará expressando o gene de interesse. Se a expressão do marcador fluorescente presente puder ser usada para estimar a eficiência de transdução com diferentes diluições virais, o número de unidades infecciosas pode ser quantificado pelo QPCR.

Uma vez que o título do vírus seja conhecido, calcule o volume apropriado de vírus para atingir a multiplicidade desejada de infecção para outras células-alvo. Medir o título e controlar o MOI garante consistência entre experimentos e diferentes preparações virais. O vírus agora está pronto para uso em experimentos adicionais.

A densidade inicial das células 2 9 3 TN foi crítica para o empacotamento viral bem-sucedido no dia da transfecção. Essas 2 9 3 células TN estavam entre 60 e 80% confluentes. 24 horas após uma transfecção bem-sucedida com um vetor lenti expressando GFP, verificou-se que pelo menos 90% das 2 9 3 células TN mostraram fluorescência verde.

72 horas após a transdução, a GFP continuou a se expressar nas células hospedeiras HT 10 80. Isso indica que a construção lentiviral integrada de forma estável ao genoma do hospedeiro, transduzindo as mesmas células hospedeiras em diluição de dez vezes, diminuiu proporcionalmente a expressão de GFP. Porque a relação entre o título viral e a expressão gênica mediada por lentivírus é diretamente proporcional.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita ao longo de cinco dias, aproximadamente uma a duas horas por dia, se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como empacotar partículas virais funcionalmente infecciosas de forma eficiente e segura e com células transduzidas com sucesso com o vírus. Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser perigoso e precauções como trabalhar em bosque de cultura de tecidos BSL.

O uso de jaleco e luvas deve sempre ser usado durante a realização deste procedimento.