Microscopia fluorescente sem lente em um Chip

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma plataforma de microscopia fluorescente sem lente no chip para imagens de objetos fluorescentes em um campo de visão ultra amplo. Para conseguir isso, um filtro de absorção fino e uma placa frontal de fibra óptica são colocados suavemente no topo de uma matriz de sensores optoelétricos, ou musgo CCDC, e então um chip microfluídico é posicionado no topo da placa frontal. Em seguida, um prisma é montado com o microchip através do uso de óleo de correspondência de índice.

A citação fluorescente é obtida através da faceta lateral de um prisma romboide e a iluminação holográfica é feita através da faceta superior do mesmo prisma. Em última análise, imagens microscópicas de alta resolução podem ser obtidas a partir das imagens fluorescentes adquiridas, decodificando as imagens brutas por meio de algoritmos digitais. Se necessário, os objetos fluorescentes decodificados podem ser contados automaticamente usando uma interface desenvolvida sob medida.

Na lente do chip. A imagem em geral visa substituir os microscópios ópticos volumosos baseados em lentes por designs mais simples e compactos. Essa plataforma de tecnologia emergente tem o potencial de eliminar a necessidade de componentes de apelo volumosos e caros por meio da ajuda de novas teorias e algoritmos de reconstrução digital.

A lista de lentes na plataforma de imagem no chip compreende vários componentes ópticos, incluindo um conjunto de sensores digitais, uma fonte de iluminação incoerente, um prisma, um filtro de absorção e uma placa frontal de fibra óptica ou um cone de fibra óptica. Nesta plataforma, diferentes tipos de matrizes de sensores podem ser usados para detecção do sinal fluorescente de microobjetos alvo. Para os fins deste vídeo, será usado um dispositivo de carga acoplada, uma fonte de luz incoerente, como um diodo emissor de luz simples, é usada para excitação de fluorescência.

Dois métodos diferentes de filtragem de excitação são usados em paralelo para criar o fundo de campo escuro necessário, conforme mostrado neste diagrama. Primeiro, um prisma de vidro ou um hemisfério de vidro é usado para criar reflexão interna total ou TIR na superfície inferior do chip microfluídico que hospeda as amostras de interesse. Paralelamente, um filtro de absorção barato é usado para remover as luzes de excitação espalhadas semanalmente que não obedecem ao processo TIR.

Após a rejeição bem-sucedida da excitação usando esses dois mecanismos, apenas a emissão fluorescente das amostras é adquirida no plano do detector. Apesar de uma abertura numérica de detecção tão grande, os pontos fluorescentes brutos no conjunto de sensores tornam-se bastante amplos para projetar e controlar melhor a propagação espacial desse sinal fluorescente. Uma placa frontal de fibra óptica será colocada entre o objeto e os planos do sensor como alternativa a uma placa frontal normal.

Uma placa frontal de fibra óptica cônica, que tem uma densidade significativamente maior de cabos de fibra óptica em sua faceta superior em comparação com a inferior, pode ser usada para imagens de alta resolução por meio de ampliação. Os chips microfluídicos usados nesta plataforma são fabricados usando paredes de poli dimetil Sloane colocadas em lâminas de vidro para criar os microcanais necessários para a aquisição de imagens no chip para iniciar a montagem da plataforma de imagem no chip sem terra. Primeiro, remova a lamínula do conjunto de sensores optoeletrônicos usando uma caneta de vácuo, coloque suavemente um filtro de absorção fino na parte superior da área ativa do detector.

Posicione uma placa frontal de fibra óptica em cima deste filtro de absorção. Em seguida, coloque o chip microfluídico fabricado diretamente no topo da matriz de fibra óptica. Em seguida, um prisma de vidro é montado acima do chip microfluídico usa o índice de correspondência de óleo, de modo que o índice de refração da interface seja combinado com o índice de refração do vidro.

Conecte as fontes de luz aos cabos de fibra óptica através do uso de conectores FC. Um dos aspectos mais difíceis desse procedimento é o alinhamento dos componentes. Alinhe cuidadosamente as distâncias entre os componentes, a posição e o ângulo da iluminação.

Finalmente, mova a fibra de iluminação lateral para mais perto do prisma e ajuste seu ângulo para garantir que a reflexão interna total ocorra na interface de ar de vidro correspondente aos chips microfluídicos. O substrato inferior, várias células ou modelos de pequenos animais podem ser visualizados usando esta plataforma on-chip, mas os glóbulos brancos serão fotografados para os fins desta demonstração. Para rotular os glóbulos brancos com um corante fluorescente, primeiro misture cerca de 100 microlitros de sangue total com cerca de um mililitro de tampão ascendente de glóbulos vermelhos, incube por cerca de três minutos em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugue a solução de sangue de mentiras.

Depois de remover a camada superior usando uma micropipeta, ressuspenda a camada de pellets em solução salina tamponada com fosfato para rotular o ácido nucléico das células com corante fluorescente, adicione SYTO 16 à suspensão de resus e, em seguida, incube a amostra por cerca de 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após 30 minutos, centrifugue a amostra rotulada. Remova o supinato para diminuir o ruído de fundo devido à emissão fluorescente de corantes não ligados.

Reese dobrou a camada de glóbulos brancos em cerca de cinco mililitros de PBS. A amostra agora está pronta para ser carregada no chip microfluídico para imagens fluorescentes sem lentes no chip. Antes de obter imagens dos glóbulos brancos, a plataforma de imagem deve ser calibrada usando microesferas fluorescentes.

Prepare a amostra diluída de microesferas usando água deionizada e solução de esferas brutas. Usando uma seringa de agulha afiada. Injete esta amostra inicial no chip microfluídico do lado das paredes do PDMS.

Depois de montar os componentes para obter imagens fluorescentes no chip, adquira imagens brutas de esferas fluorescentes usando a interface de visualização de laboratório desenvolvida sob medida por meio de um computador. Certifique-se de verificar se há pelo menos 20 imagens de contas fluorescentes isoladas em todo o campo de view. Salve os dados de calibração, que serão usados posteriormente para calibrar e extrair a função de propagação de pontos da plataforma de microscopia menos fluorescente da lente.

Remova o chip microfluídico contendo a amostra de esferas fluorescentes e separe o prisma deste chip. Injete a amostra de glóbulos brancos previamente preparada em outro chip microfluídico não utilizado do lado das paredes do PDMS. A montar os componentes mais uma vez com as mesmas condições experimentais, especialmente no que diz respeito às distâncias e potência de excitação.

Adquira as imagens brutas dos glóbulos brancos usando a visualização de laboratório personalizada com os mesmos parâmetros de software usados para as microesferas fluorescentes. Os dados de calibração e as imagens brutas de glóbulos brancos são então usados para criar imagens de alta resolução no MATLAB por meio de processamento digital. Os resultados representativos da imagem fluorescente no chip de lente de campo amplo de uma mistura contendo partículas fluorescentes verdes de quatro mícrons e 10 mícrons são mostrados aqui para fins de comparação, 10 x microscópio.

Imagens objetivas também são fornecidas, que concordam bem com as imagens menos fluorescentes mostradas. Em seguida, um resultado de lente de campo amplo, menos imagens fluorescentes de uma mistura contendo partículas fluorescentes verdes de 10 mícrons e vermelhas de 10 mícrons. As imagens menos fluorescentes da lente fornecem uma correspondência decente com 10 imagens objetivas do microscópio das mesmas amostras.

Esta figura fornece uma comparação de desempenho da deconvolução de Lucy Richardson e amostragem compressiva com base em algoritmos de decodificação para imagens de vários pares de esferas de 10 mícrons. A linha superior ilustra as imagens fluorescentes menos brutas da lente, nas quais as imagens inseridas mostram as comparações do microscópio das mesmas partículas que são necessárias usando uma lente objetiva de 10 x. A linha do meio demonstra os resultados da decodificação compressiva, enquanto a linha inferior ilustra os resultados da deconvolução de Lucy Richardson DDCS e DLR referem-se às distâncias centro a centro e imagens de microscópio, imagens de lentes decodificadas CS e imagens sem lentes complicadas LR, respectivamente.

Em seguida, o processamento digital da lente, imagens brutas menos fluorescentes é ilustrado. Um algoritmo baseado em amostragem compressiva é usado para obter uma resolução espacial inferior a quatro mícrons, resolvendo pares de contas de dois mícrons de diâmetro. As inserções mostram comparações objetivas de microscópio de 40 x, que concordam muito bem com as imagens fluorescentes decodificadas.

Aqui D refere-se às distâncias centro a centro em imagens de microscópio. Enquanto o DCS se refere às distâncias centro a centro na lente decodificada CS, menos imagens fluorescentes. Esta figura mostra os resultados da imagem sem lente de glóbulos brancos marcados com fluorescência.

As imagens livres de lentes brutas são rapidamente decodificadas usando um decodificador baseado em CS, que concorda muito bem com uma imagem de microscópio convencional da mesma amostra que é adquirida com uma lente objetiva de 10x. Além da imagem, se necessário, os objetos fluorescentes decodificados também podem ser contados automaticamente usando uma interface desenvolvida sob medida para aplicações de citometria no chip Ilustrado aqui está uma interface de contagem de objetos fluorescentes automatizada e projetada sob medida no matlab. Acabamos de demonstrar o procedimento para microscopia fluorescente sem terra de células marcadas e microbatimentos em um campo de visão de oito centímetros quadrados.

Essa plataforma de imagem de navio comparada com o decodificador de compressão rápida atrás. Será bastante variável para citometria de alto rendimento, análise micro rara e aplicações de pesquisa de células reais.