Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

O objetivo deste procedimento é observar as mudanças dinâmicas no citoesqueleto de actina em células endoteliais vivas. Primeiro, transfecte células endoteliais de veia umbilical humana com um plasmídeo de actina beta GFP e cultive até a confluência sobre lamínulas. Em seguida, posicione as lamínulas em uma câmara de imagem de células vivas com uma platina aquecida e infusão de solução fisiológica com albúmina.

O passo final é a aquisição de dados de uma área selecionada de células por meio da captura de imagens com lapso de tempo antes e após o tratamento com um agente farmacológico. A análise do gráfico de chime com software de imagem, como o Image J, pode fornecer informações sobre protrusões locais de lamelipódios, tais como distância, tempo e velocidade das protrusões, bem como o movimento de fibras ao longo do tempo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imagem de imunofluorescência, é que a microscopia de células vivas permite incorporar a natureza dinâmica do citoesqueleto atinico em estudos dos mecanismos que determinam a permeabilidade endotelial.

Enquanto células coradas fixadas representam instantâneos no tempo e fornecem pouca informação sobre a dinâmica da ação e do citoesqueleto antes e após o tratamento com um mediador inflamatório em uma cabine de segurança biológica. Esterilize lamínulas com etanol 70% por dois minutos e, em seguida, seque ao ar. Coloque cada lamínula em uma placa de cultura de 10 centímetros e adicione 300 microlitros de solução morna de gelatina ao centro, sem tocar nas bordas da lamínula. Após cinco minutos, aspire o líquido.

Agora, colha uma cultura confluente de células endoteliais de veia umbilical humana ou VE com tripsina 0,25% EDTA. Conte as células e recupere-as por centrifugação. Aspire o máximo possível do meio SUP natum para uma reação de transfeção com o kit de efetor nuclear VE.

Re-suspenda os pellets celulares na solução básica de efetor nuclear e adicione de 0,2 a dois microgramas do plasmídeo do vetor GFP beta actina. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para um qve de efetor nuclear. Bata levemente no vete tampado algumas vezes para garantir que não haja bolhas entre o fundo do Q vet e a amostra de transfeção.

Coloque o Q VET no dispositivo nuclear efetor dois e execute o programa A 0 3 4 usando uma pipeta de transferência do kit nuclear efetor para transferir um volume aquecido de 500 microlitros de meio EGM dois MV para o qve. Em seguida, transfira a mistura de volta para o tubo microfuga e incube por 15 minutos. Misture suavemente a suspensão de VE transfectada uma vez e plaque 300 microlitros da suspensão sobre uma lamínula revestida com gelatina sem tocar nas bordas.

Em seguida, incubar por uma a quatro horas. Examinar as células transfectadas para confirmar a adesão à lamínula. Em seguida, adicionar 10 mililitros de meio E GM dois MV à placa e continuar a incubar para expressão de GFP.

Primeiro, adicione um meio de solução salina fisiológica com albumina ou uma PSS ao sistema de fluxo por gravidade e conecte ao aquecedor em linha. Ajuste agora o regulador de fluxo para obter um fluxo de aproximadamente 40 mililitros por hora. Em seguida, interrompa o fluxo fechando a torneira de passagem com um aplicador de algodão.

Aplicar graxa de vácuo na borda externa da parte inferior do banho de diamante. Agora, retire uma cultura transfectada do incubador. Levante cuidadosamente a lamínula usando pinças.

Em seguida, utilizando um lenço de papel Kim, absorva o excesso de meio EGM dois MV na lâmina inferior, posicionando a face celular voltada para cima. Coloque o banho de diamante sobre a lamínula para formar uma câmara. Coloque rapidamente a câmara no aquecedor do estágio.

Ajuste as braçadeiras sobre a câmara e pipete aproximadamente um mililitro do meio EGM dois MV da placa para dentro da câmara. Agora, conecte a mangueira de vácuo ao seu suporte no lado esquerdo da câmara e a linha de PSS A do aquecedor em linha ao canal no lado direito da câmara. Em seguida, ligue o vácuo e abra a linha de PSS A para permitir a perfusão do banho sobre as células transfectadas.

Além disso, ligue o aquecedor embutido a 37 graus Celsius. Em seguida, coloque a sonda do termistor para a platina aquecida na solução, na borda, e ligue o aquecedor da platina a 37 graus Celsius. Para remover qualquer resíduo de meio EGM two MV e acúmulo, limpe cuidadosamente a face inferior da lamínula usando um lenço Kim embebido em etanol 70%, seguido por um lenço Kim seco. Equilibre as células HU transfectadas por 30 minutos.

Trave o foco. Concentre-se na área selecionada das células cultivadas para estudo. Ajuste o tempo de exposição da câmera entre 0,5 e dois segundos, dependendo da intensidade do sinal de GFP Act nas células.

Defina também os intervalos e os tempos de duração do experimento. Agora, com as luzes do ambiente desligadas, capture uma única imagem para avaliar as configurações. Capture a série de imagens em lapso de tempo, monitorando-as conforme forem necessárias.

Em um protocolo típico, obtenha imagens de linha de base por 20 a 30 minutos antes de adicionar um agente de teste, seguidos por 0,5 a quatro horas de aquisição adicional de imagens. Por fim, conforme detalhado no texto acompanhante, avalie a distância de protrusão dos lámelipódios, a persistência e a velocidade por meio da análise de gráficos CH. Em um experimento típico, a actina GFP é expressa em mais de 50% das VE transfectadas de maneira aleatória.

Essas imagens adquiridas uma vez por minuto capturaram a actina GFP em todo o citoplasma, bem como em estruturas filamentares e em protrusões locais de lamelipódios ao longo da borda celular. A persistência da distância e a velocidade das protrusões celulares são quantificadas a partir de conjuntos de imagens com lapso de tempo. Utilizando a análise de gráfico chm, primeiramente, uma linha de um único pixel é traçada aproximadamente perpendicular à borda da célula.

Essa região é extraída de cada imagem do conjunto de imagens de lapso de tempo para gerar um mosaico da região ao longo do tempo ou um gráfico cronológico, no qual, de uma perspectiva da esquerda para a direita, as protrusões são representadas como movimentos ascendentes na borda da célula. Quando uma linha é sobreposta à borda de uma dessas protrusões, os dados dos pixels associados a essa linha podem ser coletados para quantificar a dinâmica da protrusão. O número total de protrusões em um gráfico chm pode ser usado para estimar a frequência de protrusão.

Esta análise retrata os movimentos das fibras de estresse formadas próximo à periferia celular e que se deslocam em direção ao centro da célula, onde eventualmente se desmontam. No gráfico chio, as fibras de estresse aparecem como linhas contínuas na área citoplasmática, muitas vezes se movendo para baixo e para a direita em direção ao centro celular. Quando as fibras são difíceis de visualizar no gráfico chio original, o filtro de máscara de realce aprimora as linhas da imagem, e as linhas desenhadas sobre as fibras de estresse facilitam a coleta de dados dos pixels usando a função de medição. Alternativamente, linhas traçadas do início ao fim da fibra de estresse identificada permitem obter dados médios de pixels ao longo da duração em que a fibra foi observada.

Esta apresentação demonstrou como analisar dados provenientes do conjunto de imagens com lapso de tempo por meio de análise gráfica com softwares como o Image J. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a dinâmica do citoesqueleto de actina em resposta a mediadores inflamatórios utilizando a imagem de células endoteliais transfectadas em tempo real.