Name: Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a observar dinâmicas do citoesqueleto de actina em células endoteliais vivas usando GFP-actina e imagem em tempo real. Este método permite analisar protrusões de lamelipódios e movimentos de fibras de actina em resposta a agentes farmacológicos.

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O plasmídeo GFP-β-actina foi generosamente fornecidos pelo Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Departamento de Patologia, e foi amplificado no laboratório do Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Departamento de Farmacologia. Este trabalho foi financiado por concessões do National Institutes of Health (P20 RR-018766) e da American Heart Association (05835386N).

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A imagem de GFP-actina em células endoteliais ao vivo permite uma análise detalhada da dinâmica do citoesqueleto de actina em resposta a estímulos inflamatórios. Este método também pode ser útil para construir em cima descobertas anteriores que mostram remodelação do citoesqueleto em resposta às forças físicas, como tensão de cisalhamento 11. Além disso, este método permite uma avaliação detalhada da contribuição da dinâmica do citoesqueleto de actina para diversas atividades das células endoteliais, incluindo a migração, mitose, formação de junções intercelulares e maturação juncional, e manutenção da função de barreira. Nos dados apresentados, o comportamento do citoesqueleto de actina endotelial pode ser observado antes e após o tratamento com trombina. Lamellipodia locais, todos ao longo das bordas das células endoteliais foram observados formando e regredindo ao longo do tempo em monocamadas de células tanto nonconfluent e confluente. Tratamento com trombina brevemente interrompido forma lamellipodiação e volume de negócios. Trombina também causou as células a contrair-se ligeiramente, de acordo com relatos anteriores de que a trombina causas actina formação das fibras de estresse e desenvolvimento crescente tensão centrípeta nas células endoteliais 12-14. No entanto, a partir de estudos de células vivas de imagens como esta, a origem das fibras de estresse pode agora ser determinada. Em HUVEC, a maioria das fibras de estresse originam na periferia celular e assemelham-se fibras de arco transversal na migração de células 8, 9. Outro ponto forte deste método sobre o uso de células fixas é que o número de fibras de stress podem ser quantificados em células individuais antes e após o tratamento de trombina, eliminando o viés de seleção entre os grupos experimentais. Com este protocolo nós avaliamos movimento dinâmico da borda de células e fibras de stress de actina. Para entender a dinâmica de monômero de actina em células endoteliais, as técnicas mais avançadas, como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) ou fluorescência speckle microscópia (FSM) pode ser aplicado 15, 16. Além disso, como células endoteliais microvasculares pode representar um modelo melhor da função de barreira microvascular, otimização de protocolos de transfecção de efetivamente expressar GFP-actina em células endoteliais microvasculares representa uma direção futura lógica. Em resumo, a imagem latente de viver células endoteliais expressando GFP-actina representa uma ferramenta poderosa para determinar como o citoesqueleto de actina da célula endotelial responde a vários tipos de estímulos. Estudos utilizando fortemente confluentes monocamadas endotelial irá ajudar a determinar as funções de estruturas dinâmicas, tais como actina-ricos lamellipodia e fibras arco transversal estresse em função de barreira endotelial. Além disso, imagens de células vivas de células endoteliais expressando GFP-actina ou proteínas de fusão outras que permitem a visualização de outras estruturas subcelulares irá fornecer informações detalhadas espaço-temporal necessária para entender a sinalização e os mecanismos estruturais que determine integridade da barreira.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer stock 5x </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. Tampão MOPS </td></tr><tr><td> Químico </td><td>Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Solução Sal albumina Physiological (APSS) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Ringer estoque (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> Tampão Mops </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sal de sódio </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumina Bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Ajustar o pH para 7,4 a 37 ° C, seguida de filtração estéril em frascos autoclavados e armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. Saline 0,9% </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Solução Gelatina </td></tr><tr><td> Gelatina de pele suína </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> Saline 0,9% </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Aquecer a solução a 37 ° C para dissolver a gelatina suficientemente. Enquanto ainda quente filtro, estéril em frascos autoclavados e armazenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table>

estudo do citoesqueleto de actina em live células endoteliais expressando gfp-actina

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

O endotélio microvascular desempenha um papel importante como uma barreira seletiva permeável a fluidos e solutos. As junções adesivas entre as células endoteliais regulam a permeabilidade do endotélio, e muitos estudos têm indicado a importante contribuição do citoesqueleto de actina para determinar a integridade juncional 1-5. Um cinto de actina cortical é pensado para ser importante para a manutenção das junções estável 1, 2, 4, 5. Em contraste, as fibras de estresse actina são pensados ​​para gerar tensão centrípeta no interior das células endoteliais que enfraquece junções 2-5. Grande parte desta teoria foi baseada em estudos em que as células endoteliais são tratados com mediadores inflamatórios conhecidos por aumentar a permeabilidade endotelial e fixação das células e rotulagem F-actina para observação microscópica. No entanto, estes estudos fornecem uma compreensão muito limitada do papel do citoesqueleto de actina porque as imagens de células fixos proporcionam snapshots apenas emtempo com nenhuma informação sobre a dinâmica das estruturas de actina 5. Live-célula de imagem permite a incorporação da natureza dinâmica do citoesqueleto de actina nos estudos dos mecanismos de determinação integridade da barreira endotelial. Uma grande vantagem deste método é que o impacto de vários estímulos inflamatórios em estruturas de actina em células endoteliais pode ser avaliada no mesmo conjunto de células vivas, antes e após o tratamento, a remoção viés potencial que podem ocorrer quando se observa os espécimes fixos. Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) são transfectadas com GFP-β-actina plasmídeo e cresceu para confluência em lamínulas. Lapso de tempo imagens de GFP-actina em HUVEC confluentes são capturados antes e após a adição de mediadores inflamatórios que provocam mudanças dependentes do tempo na integridade da barreira endotelial. Estes estudos permitem a observação visual da seqüência fluida de mudanças no citoesqueleto de actina, que contribuem para endotéliol rompimento da barreira e restauração. Nossos resultados mostram consistentemente local, rico em actina lamellipodia formação e volume de negócios nas células endoteliais. A formação e movimento das fibras de actina estresse também pode ser observado. Uma análise da frequência de formação e volume de negócios do lamellipodia local, antes e após o tratamento com estímulos inflamatórios podem ser documentadas por meio de análises quimógrafo. Estes estudos fornecem informações importantes sobre a natureza dinâmica do citoesqueleto de actina em células endoteliais, que pode ser usado para descobrir previamente não identificados mecanismos moleculares importantes para a manutenção da integridade da barreira endotelial.

Imagens microscópicas de vida das células endoteliais expressando GFP-actina permite a caracterização de mudanças dinâmicas em estruturas do citoesqueleto. Ao contrário das técnicas que utilizam amostras fixadas, este método fornece uma avaliação detalhada das mudanças temporais no citoesqueleto de actina nas mesmas celas antes, durante e depois de vários estímulos físicos, farmacológicos, ou inflamatórias.

Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

O endotélio microvascular desempenha um papel importante como uma barreira seletivamente permeável a fluidos e solutos. As junções adesivas entre endoteliais...

O objetivo deste procedimento é observar as mudanças dinâmicas no citoesqueleto de actina em células endoteliais vivas. Primeiro, transfete células endoteliais de veia umbilical humana com um plasmídeo de actina beta GFP e cultive-as até atingirem confluência em lamínulas. Em seguida, posicione as lamínulas em uma câmara de imagem de células vivas com uma platina aquecida e infusão de solução fisiológica com albumina.O passo final é a aquisição de dados de uma área selecionada de células por meio da captura de imagens em intervalos de tempo antes e após o tratamento com um agente farmacológico. A análise do gráfico de Chime com software de imagem, como o Image J, pode fornecer informações sobre protrusões locais de lâminas podiais, tais como distância, tempo e velocidade das protrusões, bem como o movimento das fibras de actina ao longo do tempo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imagem de imunofluorescência, é que a microscopia de células vivas permite incorporar a natureza dinâmica do citoesqueleto de actina em estudos dos mecanismos que determinam a permeabilidade endotelial.Enquanto as células coradas fixadas representam instantâneos no tempo e fornecem pouca informação sobre a dinâmica do ato e do citoesqueleto antes e depois do tratamento com um mediador inflamatório em uma cabine de segurança biológica. Esterilize lamínulas com etanol 70% por dois minutos e, em seguida, deixe secar ao ar. Coloque cada lamínula em uma placa de cultura de 10 centímetros e adicione 300 microlitros de solução morna de gelatina ao centro, sem tocar nas bordas da lamínula. Após cinco minutos, aspire o líquido.Agora, colete uma cultura confluente de células endoteliais de veia umbilical humana ou VE com tripsina 0,25% EDTA. Conte as células e recupere-as por centrifugação. Aspire cuidadosamente o máximo possível do meio SUP natum para uma reação de transfeção com o kit de efetor nuclear VE.Re-suspenda os pellets celulares na solução básica de efetor nuclear e adicione de 0,2 a dois microgramas do plasmídeo do vetor GFP beta actina. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para um cubeta de efetor nuclear. Bata levemente na cubeta tampada algumas vezes para garantir que não haja bolhas entre o fundo da cubeta e a amostra de transfeção.Coloque o Q VET no dispositivo efetor nuclear dois e execute o programa A 0 3 4 utilizando uma pipeta de transferência do kit efetor nuclear para transferir um quarto aquecido de 500 microlitros de meio EGM dois MV para o qve. Em seguida, transfira a mistura de volta para o tubo microfuga e incube por 15 minutos. Misture suavemente a suspensão VE transfectada uma vez e plaque 300 microlitros da suspensão sobre um lamínula revestido com gelatina, sem tocar nas bordas.Em seguida, incubar por uma a quatro horas. Examinar as células transfectadas para confirmar a adesão à lamínula. Então, adicionar 10 mililitros de meio E GM dois MV à placa e continuar a incubar para expressão de GFP.Primeiro, adicione um meio de solução salina fisiológica com albumina ou um PSS ao sistema de fluxo por gravidade e conecte ao aquecedor em linha. Ajuste agora o regulador de fluxo para obter um fluxo de aproximadamente 40 mililitros por hora. Em seguida, interrompa o fluxo fechando a torneira com um aplicador de algodão.Aplicar graxa de vácuo na borda externa da parte inferior do banho de diamante. Agora, retire uma cultura transfectada do incubador. Levante cuidadosamente a lamínula usando pinça.Em seguida, utilizando um lenço de papel Kim, absorva o meio EGM dois MV em excesso na lâmina inferior, posicionando a face celular voltada para cima. Coloque o banho de diamante sobre a lamínula para formar uma câmara. Coloque rapidamente a câmara no aquecedor do estágio.Ajuste as braçadeiras sobre a câmara e pipete aproximadamente um mililitro de meio EGM two MV da placa para dentro da câmara. Agora, conecte a mangueira de vácuo ao seu suporte no lado esquerdo da câmara e a linha de A PSS do aquecedor em linha ao canal no lado direito da câmara. Em seguida, ligue o vácuo e abra a linha de A PSS para permitir a perfusão do banho sobre as células transfectadas.Também ligue o aquecedor interno em 37 graus Celsius. Em seguida, coloque a sonda termistora do estágio aquecido na borda do banho e ligue o aquecedor do estágio em 37 graus Celsius. Para remover qualquer resíduo restante de meio EGM dois MV e acúmulo, limpe cuidadosamente o lado inferior do lamínula usando um lenço Kim embebido em etanol 70%, seguido por um lenço Kim seco. Equilibre as células HU transfectadas por 30 minutos.Trave o foco. Concentre-se na área selecionada das células cultivadas para estudo. Ajuste o tempo de exposição da câmera entre 0,5 e dois segundos, dependendo da intensidade do sinal GFP Act nas células.Defina também os intervalos e os tempos de duração do experimento. Agora, com as luzes do ambiente desligadas, capture uma única imagem para avaliar as configurações. Capture a série de imagens em lapso de tempo, monitorando-as conforme forem necessárias.Em um protocolo típico, obtenha imagens de linha de base por 20 a 30 minutos antes de adicionar um agente de teste, seguido por 0,5 a quatro horas de aquisição adicional de imagens. Por fim, conforme detalhado no texto acompanhante, avalie a distância de protrusão de lâminas podiais, a persistência e a velocidade por meio da análise de gráficos de CH. Em um experimento típico, a actina GFP é expressa em mais de 50% das VE transfectadas de maneira aleatória.Essas imagens adquiridas uma vez por minuto capturaram a actina GFP em todo o citoplasma, bem como em estruturas filamentosas e em protrusões locais de filopódios ao longo da borda celular. A persistência de distância e a velocidade das protrusões celulares são quantificadas a partir de conjuntos de imagens com lapso de tempo. Utilizando a análise de gráfico chm, primeiramente, uma linha de um único pixel é traçada aproximadamente perpendicular à borda da célula.Essa região é extraída de cada imagem do conjunto de imagens de lapso de tempo para gerar um mosaico da região ao longo do tempo ou um gráfico de sino, aqui numa perspectiva da esquerda para a direita no gráfico de sino, as projeções são representadas como movimentos ascendentes na borda da célula. Quando uma linha é sobreposta à borda de uma dessas projeções, os dados dos pixels associados a essa linha podem ser coletados para quantificar a dinâmica das projeções. O número total de projeções em um gráfico de sino pode ser usado para estimar a frequência de projeções.Esta análise retrata os movimentos das fibras de estresse formadas próximo à periferia celular e que se deslocam em direção ao centro da célula, onde eventualmente se desmontam. No gráfico chio, as fibras de estresse aparecem como linhas contínuas na área citoplasmática, muitas vezes movendo-se para baixo e para a direita em direção ao centro celular. Quando as fibras são difíceis de visualizar no gráfico chio original, o filtro de máscara de realce aumenta o contraste das linhas da imagem, e as linhas desenhadas sobre as fibras de estresse facilitam a coleta de dados dos pixels usando a função de medição. Alternativamente, linhas traçadas do início ao fim da fibra de estresse identificada permitem obter uma média ponderada dos dados de pixels durante todo o período em que a fibra foi observada.Esta apresentação demonstrou como analisar dados provenientes do conjunto de imagens de lapso de tempo por meio de análise gráfica com softwares como o ImageJ. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a dinâmica do citoesqueleto de actina em resposta a mediadores inflamatórios utilizando a imagem de células endoteliais transfectadas vivas.

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Biologia

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