Name: Transformação e Cercarial In vitro Cultivo de Schistosoma mansoni Esquistossômulos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprenda a transformar cercárias de Schistosoma mansoni em esquistossômulos não infecciosos usando agulha dupla. Este método permite cultivar parasitas por até seis semanas em RPMI a 37°C para pesquisa em esquistossomose.

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Este projeto foi financiado pela Case Western Reserve University fundos de inicialização fornecido para E. Jolly. Caramujos infectados foram fornecidos pelo Centro de Recursos esquistossomo, NIH-NIAID (Contrato n º HHSN272201000009I NIAID). Agradecemos também a Chris King e Ronald Blanton para o apoio na obtenção de caracóis infectados esquistossomo e para discussões úteis.

Medidas de segurança: Cercárias do S. mansoni pode penetrar diretamente na pele sem a necessidade de um corte ou poros, e causar a doença crônica da esquistossomose. S. mansoni é um nível de biossegurança 2 organismo, portanto, equipamento de proteção individual e medidas de segurança apropriadas devem ser seguidas quando se trabalha com cercaria infecciosa. A maioria dos equipamentos necessários para crescer e transformar schistosomes é padrão, com uma chave poucas exceções indicado na tabela ao final do protocolo. Todo o trabalho cercarial deve ser feito em uma sala isolada. Esquistossômulos devem ser cultivadas em um estéril capa de biossegurança, aprovado. Duas camadas de borracha nitrílica ou luvas de látex devem ser usadas, bem como uma bata de laboratório, um par de sapatos impermeáveis, calças sem furos ou rasgos, e mangas de protecção impermeável para seus pulsos e braços. Em caso de derrame acidental, pulverizar imediatamente a área contaminada com etanol 70% ou água sanitária a 10%, esfregando vigorosamente se em sua pessoa. Isso vai ser suficiente para desativar o parasita, mas todas as possíveis infecções devem ser relatados e levada a sério. Embora esquistossômulos não são inatamente infecciosa, diretrizes institucionais variam, e devem ser consultadas para determinar se BSL2 precauções são necessárias durante as fases da vida não-infecciosa. Desinfectar todas as superfícies que entram em contato com qualquer substância potencialmente infecciosos após o experimento é realizado e descarte de resíduos em um recipiente aprovado biohazard. NOTA: caixotes Cubra snail host 1 a 2 dias antes da queda e proteger da luz 1. Colheita cercárias a partir do host caracol <ol><li> Encher um copo limpo e livre de 500mL detergentes metade cheio com água destilada atingir a temperatura ambiente. Se trabalhar com caracóis hospedeiro infectado com miracídios em datas diferentes, use um copo separado para cada data de infecção (Isto é particularmente importante se os caracóis será reutilizado para futuros experimentos). O tamanho do copo também pode ser menor dependendo da experiência do usuário. </li><li> Coletar caramujos infectados hosts que você deseja galpão e depositá-los cuidadosamente no copo com um peixe de aquário padrão net e pinças de uso geral, conforme necessário. </li><li> Copo lugar em um derramamento de emergência bandeja de aproximadamente 8 a 12 polegadas sob uma fonte de luz incandescente. Deixe repousar por 1-2 horas sob a luz. Cercárias sair do caramujo hospedeiro quando expostos à luz brilhante. </li><li> Cuidadosamente filtrar caracóis a partir da mistura cercárias. Tomar precauções de segurança extra, como mistura é altamente infecciosa. Lembre-se, cercárias podem penetrar diretamente da pele humana! </li><li> Substituir mistura sob fonte de luz para cerca de 15 minutos, permitindo que qualquer questão dos resíduos de partículas para resolver. </li><li> Transferência de cercárias em um erlenmeyer limpo usando uma pipeta, evitando os destroços no fundo do copo. Colocar o balão em aproximadamente um ângulo de 45 ° no gelo no escuro por 45-60 minutos, permitindo cercárias para resolver em um canto. </li><li> Use uma pipeta de 50 mL para remover 75 a 90% do sobrenadante e depositá-lo no copo contendo lixívia 10% ou etanol 70%, tendo o cuidado de não deixar pingar gotas de água contendo cercárias da pipeta. </li><li> Agitar o erlenmeyer contendo cercárias suavemente para voltar a suspender as cercárias em solução. Use uma pipeta para transferir a amostra para 50 tubos estéreis ml. Coloque os tubos novamente no gelo por 20 minutos no escuro. Cercárias vai resolver para o fundo do tubo no escuro. </li></ol> 2. Transformação manual de cercárias em esquistossômulos Antes de começar: Faça RPMI 1640 completo (RPMI, 5% de soro fetal bovino, 1X Pen / Strep) e quente a 37 ° C. (É fundamental que o soro fetal bovino utilizado foi inativada pela incubação a 56 ° C durante 1 hora como schistosomes pode ser sensível para complementar). <ol><li> Em uma capa de risco biológico, remover o sobrenadante até 5 a 10 ml de solução em cada cônico de 50 ml utilizando uma pipeta ou outro dispositivo de vácuo. </li><li> Anexar um calibre 22 double-ended, luer lok emulsificante agulha para uma seringa de tamanho adequado. </li><li> Tirar lentamente a mistura para dentro da seringa. Coletar cercárias de todos os tubos de 50 ml em uma seringa. Esteja atento de gotejamento. </li><li> Cuidadosamente por sua vez seringa sobre como que o fim agulha não acoplada é para cima. Anexar outra seringa para este lado da agulha emulsificante. </li><li> Passe a mistura através da agulha de um total de 40 vezes (20 vezes ida e volta) para transformar o cercárias. </li><li> Posição das seringas na vertical de tal forma que a mistura está contida na seringa inferior e superior é a seringa vazia. Retire a seringa top e desinfectar em etanol 70%. </li><li> Gota a gota depósito mistura em um prato limpo alta 100 milímetros x 50 milímetros murada pirex ou prato de cristalização. Desinfectar agulha e seringa em Etanol 70%. </li><li> Adicionar 37 ° C RPMI 1640 completo de mídia de modo que ainferior da placa de Petri é completamente coberto, como se derramando um prato de caldo Luria. </li><li> Agite cuidadosamente para coletar esquistossômulos no centro da placa de Petri. Evitar respingos. Nota: Pode ser útil para desligar a luz do exaustor para esta etapa a mais adequada visualizar os esquistossômulos no centro. </li><li> Imediatamente depósito esquistossômulos concentrada em uma nova placa de cultura de células de 12 bem assim usando um conta-gotas estéril. </li><li> Repita 2.9 e 2.10 até esquistossômulos não estão mais presentes no centro do prato (cerca de 10 vezes). Depósito cada recolha subsequente em uma bem fresca. </li><li> Encher cada poço até metade (~ 1,5 mL) pré-aquecido com a mídia RPMI completo. </li><li> Visualize em um microscópio invertido para verificar a presença dos esquistossômulos e ausência de cercárias. </li><li> Crescer a esquistossômulos em uma incubadora de CO 2 set a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> 3. Resultados representativos: Transferência pendente de esquistossômulos transformados em meios de cultura, visualização sob um microscópio de campo brilhante invertido (Ver tabela de equipamentos, por exemplo) deve render uma imagem semelhante à Figura 1, em que apenas esquistossômulos transformados estão presentes no poço. Contaminantes potenciais poderiam incluir cercárias intacta, caudas cortadas cercárias, ou outros detritos. Se nenhum microscópio invertido estiver disponível, um microscópio padrão ou mesmo um escopo dissecção será suficiente para visualizar os esquistossômulos. Note que este procedimento nem sempre transformar 100% de cercárias. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: esquistossômulo Transformado <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: cercárias e Tails Severed

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vários problemas potenciais poderiam surgir durante o processo de transformação, no entanto, este protocolo é projetado para evitar a maioria destes problemas. Um risco potencial é o entupimento da agulha de emulsificante, que geralmente surge devido aos detritos que sobraram da colheita no passo 1.3. Certifique-se de permitir que todas as partículas para resolver no passo 1.5 e transferir a cercárias cuidadosamente no passo 1.6 para evitar este problema. Além disso, como descrito anteriormente, trabalhando dentro de um armário de segurança biológica, a utilização de equipamento de proteção individual (escudos, mesmo face) e evitar a pressão excessiva sobre as seringas é aconselhável. Moradia caudas cercarial pode ser visualizado na mídia, o que é indicativo da separação pobres durante o passo 2.9. As caudas apresentam um movimento espasmo-like e tem uma forma distinta (ver Figura 2), e desta forma são facilmente distinguíveis da esquistossômulos. As caudas podem ser removidos por lavagem a esquistossômulos em excesso de RPMI completo permitindo que os esquistossômulos para resolver. As caudas permanecerá flutuante e pode ser aspirado off. Se cercárias intactas estão presentes na mídia, a transformação no passo 2.5 não foi executado corretamente. Uma imagem de um cercaria intacta é retratado na Figura 3b, para referência. Se esse problema ocorre, assegurar que a agulha emulsionante a ser utilizado é do tamanho adequado. Além disso, o número de vezes que a mistura cercarial é passado através da agulha pode ser aumentado, apesar de 40 vezes é tipicamente muito mais do que suficiente para chegar perto dos 100% de corte das caudas cercárias. Transformação da cercária em esquistossômulos foi descrita pela primeira vez em 1974 por Colley e Wikel (13). Desde então, a preparação de esquistossômulos foi feito usando a estratégia do corte com uma agulha e seringa, conforme descrito neste protocolo, ou através de uma abordagem vórtex e separados por gradientes de Percoll (14, 15) ou rodando como demonstrado neste trabalho. Estas duas técnicas para preparar esquistossômulos são belamente descrito por Fred Lewis (16) e mais informações para cultura adicional de esquistossômulos de crescimento a longo prazo pode ser encontrado no NIAID esquistossomo Resource Center ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;agulha emulsionante </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 1X Médio (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino de calor (FBS) inativada </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Dish cristalizando (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Objetivo geral Tweezers </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco Aquarium líquido artémia </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

transformação e cercarial in vitro cultivo de schistosoma mansoni esquistossômulos

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Esquistossomo parasitas são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença crônica e debilitante que afeta mais de 200 milhões de pessoas no mundo e ocupa o segundo lugar à malária entre as doenças parasitárias em termos de saúde pública e impacto sócio-econômico (1-4). Esquistossomo parasitas são vermes trematódeos com um ciclo de vida complexo intercâmbio entre uma vida parasitária em hospedeiros mamíferos e moluscos, com intervenção de natação livre etapas. Brevemente, de natação livre cercárias infectar um hospedeiro mamífero penetrando a pele com a ajuda de proteases secretadas, durante o qual o cercárias perdem a cauda, ​​transformando-se em esquistossômulos. Os esquistossômulos agora deve escapar do sistema imune do hospedeiro, desenvolver um intestino para a digestão das células vermelhas do sangue, e migrar embora os pulmões ea circulação portal rota para seu destino final no sistema porta hepática e, eventualmente, as veias mesentéricas (para S. mansoni) onde homens e mulheres par worms e mate, produzindo centenas de ovos por dia. Alguns dos ovos são excretados a partir do corpo em água doce, onde os ovos eclodem em nado livre miracídios (5-10). Os miracídios infectam espécies de caracóis específica e se transformar em mãe e filha esporocistos, que por sua vez, produzem cercárias infectantes, completando o ciclo de vida. Infelizmente, o ciclo de vida do S. mansoni não podem ser cultivadas in vitro, mas cercárias infectantes podem ser transformados em esquistossômulos, e os esquistossômulos podem ser cultivadas durante semanas para a análise do desenvolvimento do S. mansoni in vitro ou análise de microarray. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição visual de transformação cercárias e no cultivo in vitro de esquistossômulos. Nós eliminaram cercárias infecciosas da Biomphalaria glabrata caramujo hospedeiro e manualmente transformá-los em esquistossômulos, destacando suas caudas usando um emulsificante agulha dupla. A in vitro cercarial transformação e técnicas de cultura esquistossômulos descrito evitar o uso de uma série de mamíferos, o que simplifica a visualização de schistosomes e facilita a coleta do parasita para a análise experimental. Vitro na transformação e técnicas de cultivo de schistosomes ter sido feito há anos (11, 12), mas nenhum protocolo visuais têm sido desenvolvidos que estão disponíveis para toda a comunidade.

Nós descrevemos um<em&gt; In vitro</em&gt; Método para esquistossômulos cultura do parasita platelminto<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, Através da colheita e transformação de cercárias infectantes do caramujo de água doce Biomphalaria glabrata hospedeiro intermediário.

Transformação e Cercarial In vitro Cultivo de Schistosoma mansoni Esquistossômulos

Os parasitas esquistossomos são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença cronicamente debilitante que afeta mais de 200 milhões de pessoas globalmente e ...

O objetivo geral deste procedimento é transformar CRC infecciosos em shisom. Isso é realizado primeiramente colhendo CRC infecciosos do hospedeiro caramujo. O CRC infeccioso é concentrado e então transformado em shisom não infeccioso utilizando uma agulha de dupla borda.Finalmente, os shisom são concentrados e coletados em uma placa de cultura e incubados em RPMI a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Utilizando este método, podem-se obter shisom transformados com contaminação por FU cial ou cauda cial. A demonstração visual deste método é essencial, pois um procedimento de transformação pode ser difícil de aprender e potencialmente perigoso.As cicas são infectantes e estão em alta concentração, e o seu isolamento exige um manuseio delicado e preciso para prosseguir com segurança e eficácia. Demonstrará o procedimento John, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Encha pela metade um béquer limpo de 500 mililitros com água destilada à temperatura ambiente, utilizando uma rede padrão para aquário e pinças. Transfira os caramujos infectados para o béquer.Coloque o béquer sobre uma bandeja de contenção de derramamento, a uma altura de 20 a 30 cm abaixo de uma fonte de luz incandescente, e deixe-o ali por uma a duas horas. A exposição à luz intensa faz com que os CRC saiam do hospedeiro caramujo. Para remover os caramujos, certifique-se de tomar precauções extras de segurança para evitar qualquer contato com a água infectante, que contém CRC capazes de penetrar diretamente na pele humana.Remova os caramujos e, em seguida, substitua a solução sob uma fonte de luz por cerca de 15 minutos para permitir que qualquer matéria particulada de resíduo se sedimente no fundo do frasco. Assim que os resíduos se assentarem, use uma pipeta para transferir o circ para um frasco erlenmeyer limpo, evitando os detritos no fundo do béquer.Coloque o frasco sobre gelo em um ângulo de 45 graus. Incube a solução no escuro por 45 a 60 minutos para permitir que o CRC se sedimente em um canto. Após os parasitas terem sedimentado, utilize uma pipeta de 50 mililitros para remover a maior parte do sobrenadante e descarte-o com cuidado.Em um béquer contendo água sanitária a 10% ou etanol a 70%, gire suavemente o frasco erlenmeyer para ressuspender os parasitas. Em seguida, use uma pipeta para transferir a amostra para tubos cónicos estéreis de 50 mililitros. Coloque os tubos sobre gelo e incube-os novamente no escuro por 20 minutos para permitir que o CRC se sedimente.Após os parasitas se acomodarem, utilize uma pipeta para descartar a maior parte dos sobrenatantes, deixando de cinco a dez mililitros de líquido em cada tubo. Em seguida, acople uma seringa com uma agulha emulsificadora de extremidade dupla e trava tipo lure lock, calibre 22. Aspire lentamente a solução contendo os parasitas de cada tubo para dentro da seringa.Tendo cuidado para não derramar a mistura infecciosa na cabine. Gire cuidadosamente a seringa de modo que a agulha fique voltada para cima e conecte uma segunda seringa à extremidade livre da agulha. Passe a mistura de uma seringa para a outra cerca de 20 vezes para transformar o crc.Em seguida, posicione as seringas verticalmente de modo que a vazia fique na parte superior. Remova cuidadosamente a seringa superior e desinfete-a com Etanol 70%. Deposite os parasitas gota a gota em um béquer de Pyrex limpo e com paredes altas.Em seguida, desinfete a agulha e a seringa em etanol 70%. A seguir, coloque a placa sobre um fundo branco para facilitar a visualização dos parasitas e adicione RPMI completo pré-aquecido a 37 graus Celsius, de modo que o fundo da placa de Pyrex fique totalmente coberto.Agite suavemente para concentrar o shisom no centro usando uma pipeta estéril. Colete um pouco do shisom concentrado e transfira os parasitas para uma nova placa de cultura celular de 12 poços. Repita este passo de lavagem até que não haja mais parasitas restantes.Uma vez que os parasitas tenham sido transferidos, preencha cada poço até cerca de metade com RPMI morno para verificar a presença de shisom. Visualize a placa usando um microscópio óptico invertido. Neste ponto, a maioria dos parasitas deverá ter se transformado em shisom, que podem ser distinguidos das CRC E por serem menos modais e não apresentarem o flagelo característico.Um pequeno número de caudas intactas de CRC e de caudas de CRC seccionadas ou outros detritos também pode estar presente. Esses fragmentos podem então ser cultivados e mantidos em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por até seis semanas, com trocas semanais de meio. Não se esqueça de que trabalhar com agentes infecciosos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de duas camadas de luvas, protetores de mangas e o uso adequado de instalações e capelas de biossegurança, devem ser sempre adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Investigações detalhadas sobre os estágios dos mosquitos dos parasitas da malária são fundamentais para projetar estratégias eficazes de bloqueio de transmissão. Este protocolo demonstra como efetivamente cultivar gametocitos infecciosos e, em seguida, alimentar esses gametocitos para mosquitos para gerar estágios de mosquitos de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Cultura gametocito e infecção por mosquitos através da alimentação artificial

Descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida em diferentes estágios de desenvolvimento do Echinococcus granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração.

Transdução Transitória das Formas Estrofes estropidas de Echinococcus granulosus

Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.

Desenvolvimento de Cepas de Espécies de Leishmania com Expressão Constitutiva de eGFP

A malária é transmitida através da inoculação do estágio de esporozoíto do Plasmodium por mosquitos infectados. O Plasmodium Transgênico nos permitiu compreender melhor a biologia da malária e contribuiu diretamente para os esforços de desenvolvimento de vacinas contra a malária. Aqui, descrevemos uma metodologia simplificada para gerar esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei .

Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei

Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a realização de microscopia de expansão ultraestrutural em três estágios do ciclo de vida in vitro do Trypanosoma cruzi, o patógeno responsável pela doença de Chagas. Incluímos a técnica otimizada para proteínas do citoesqueleto e marcação de pan-proteoma.

Microscopia de Expansão Ultraestrutural em Três Estágios do Ciclo de Vida In Vitro do Trypanosoma cruzi

A genética química envolve a substituição de um resíduo de gatekeeper por um aminoácido contendo uma cadeia lateral diferente no locus alvo. Aqui, geramos um parasita mutante contendo um alelo hipomórfico de cdpk1 e identificamos vias compensatórias adotadas pelo parasita no fundo mutante.

Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprenda a transformar cercárias de Schistosoma mansoni em esquistossômulos não infecciosos usando agulha dupla. Este método permite cultivar parasitas por até seis semanas em RPMI a 37°C para pesquisa em esquistossomose.

Transformação e Cercarial In vitro Cultivo de Schistosoma mansoni Esquistossômulos

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