Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar células-tronco primárias da crista neural, ou N CSCs, de tecidos do couro cabeludo humano. Isso é feito xingando primeiro a pele do couro cabeludo humano em tiras de um centímetro de largura e incubando em meios contendo dis bays. A pele é então disposta no meio fresco e os folículos pilosos são obstruídos.

O segundo passo do procedimento é tratar os folículos pilosos com tripsina e são obtidas suspensões unicelulares. A etapa final do procedimento é classificar CD 2 71 HNK um ncsc duplo positivo usando citometria de fluxo e colocar placas em placas de cultura. Em última análise, a microscopia de contraste de fase é usada para estudar a formação e o crescimento da esfera neurológica, onde a demonstração desses métodos é crítica, pois as etapas verticais de extração e isolamento da saúde são difíceis de aprender porque é muito difícil dissecar a pele e as partículas de saúde ao microscópio.

Para se preparar para a cultura, as células-tronco revestem o fundo de cada poço de uma placa de seis poços com poli de licina, deixe as placas secarem no capô. Quando os poços estiverem secos, enxágue com água estéril e aspire, depois deixe os poços secarem novamente. Cubra as placas com a solução de 0,17 miligrama por mililitro de fibronectina.

Então, antes que a fibronectina seque na placa no meio de cultura NCSC, prepare e prepare os seguintes meios e reagentes. 97%D-M-E-M-F 12 2%B 27 suplemento 1%e dois suplementos B-F-G-F-F-E-G-F IGF um e diss. Colete pele fresca do couro cabeludo humano adulto de procedimentos de lifting facial ou tecido do couro cabeludo fetal e lave-a com PBS contendo penicilina estreptomicina.

Transfira a pele para tubos de 50 mililitros e incubada em DMEM com 10 miligramas por mililitro de espaço DIS a 37 graus Celsius por duas a quatro horas ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira a pele para uma placa de Petri esterilizada e remova os pelos da pele segurando a haste do cabelo perto da superfície da pele e puxando com firmeza e suavidade. Os folículos pilosos mostrarão uma morfologia orgênica do antígeno, incubarão os fragmentos foliculares isolados em viagens de 0,05% em EDTA por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional.

Em seguida, adicione quatro mililitros de DMEM com 10% FBS para interromper a reação. Em seguida, passe o epitélio folicular por um filtro de 40 mícrons para obter uma única suspensão celular contendo células de tamanho e forma variados. Em seguida, gire a suspensão a 200 vezes G por cinco minutos.

Descarte cuidadosamente o sobrenadante S e ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS com 2% FBS Para isolar N CSCs usando fatos primeiro, rotule as células com anticorpos contra um HD conjugado com PC 2 71 FE C conjugado hnk um ou CD 2 71 PE conjugado com alfa quatro integrina incubando em gelo por 40 minutos na centrífuga escura a 200 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante. Ressuspenda as células em PBS contendo 2% de FBS e dois microgramas por mililitro. Iodeto de propídio para eliminar as células mortas.

Realizar a triagem celular por citometria de fluxo e coletar cultura de células CD 2 71 H e K um duplo positivo ou CD 2 71 alfa quatro integrina duplo positivo. As células em placas de fixação ultra-baixas em meio NCSC, trocando o meio uma vez por dia. Verifique a cultura de células todos os dias ao microscópio.

O NCSC começará a formar pequenos agregados flutuantes após vários dias e esferas bem formadas em duas a cinco semanas na cultura, dependendo da idade dos doadores. O crescimento aparecerá em poucos dias na região da protuberância e esferas bem formadas in situ em várias semanas, quando folículos pilosos inteiros são cultivados no meio NCSC. Para expandir as culturas NCSC, lave as células uma vez com PBS pré-aquecido duas vezes tripsin EDTA a 37 graus Celsius.

Em seguida, adicione-o às células por sete a 15 minutos para que a célula-tronco do folículo de granizo se desprenda. Para interromper as viagens, ADICIONE DMEM com 10% de FBS pipetando suavemente para cima e para baixo para dispersar as células. Em seguida, gire para baixo a 200 vezes G por cinco minutos.

Ressuspenda as células em meio NCSC e placas revestidas de cultura e fibronectina a 37 graus Celsius. Cultura NCSC. O meio é suficiente para manter o NCSC humano em um estado indiferenciado.

Sem a necessidade de células alimentadoras, os queratinócitos não proliferam e morrem gradualmente no meio. Algumas pequenas células redondas proliferam e formam pequenos agregados em suspensão. Após três a cinco dias, esses agregados flutuantes aumentam lentamente de tamanho, gerando estruturas tridimensionais semelhantes a esferas, denominadas esferas de cabelo.

Quando cultivadas placas codificadas, as N CSCs se ligam à superfície e crescem mais rápido do que as células formadoras de esferas em suspensão, tanto as formadoras de esferas quanto as células-tronco anexadas. Expresse os marcadores NCSC quando folículos pilosos inteiros são esferas cultivadas se formam na área correspondente à região da protuberância. Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e cultura.

Célula-tronco neuro primária de tecidos do couro cabeludo herma.